Name: turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks
Uploaded: 2020-05-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Transgenic Science and Technology Program (2019-X08010-003 a Y.z.), della National Natural Science Foundation of China (31872637 a Y.z.) e dei Fondi di Ricerca Fondamentali per le Università Centrali (da 2019TC028 a Y.E.) e della NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185 e NIH-GM132582-01 a S.P.D.K.

NOTA: una panoramica del metodo è illustrata nella Figura 1.
1. Preparazione del materiale vegetale
<ol><li>Coltiva i semi di N. benthamiana in terreno umido ad alta densità e mantenerli in una camera climatica con una luce di 16 h (circa 75 mol/m2s) e un fotoperiodo scuro di 8 h a 23–25 gradi centigradi.</li>
	<li>Circa 1 settimana dopo, trasferire attentamente ogni giovane piantine a pentole da 4' x 4' e tenere le piantine ...

<ol>
	<li>Bergg&#229;rd, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li><li>Kim, D. I., Roux, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+void:+proximity-based+labeling+of+proteins+in+living+cells.">Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells.</a> Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).</li><li>Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+interacting+proteins:+Application+of+BioID+as+a+discovery+tool.">Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells.">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nuclear+pore+complex+architecture+with+proximity-dependent+biotinylation.">Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).</li><li>Lin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+proximal+and+interacting+proteins+in+rice+protoplasts+by+proximity-dependent+biotinylation.">Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).</li><li>Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+proximity+dependent+biotin+identification+(BioID).">In planta proximity dependent biotin identification (BioID).</a> Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).</li><li>Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+in+planta+BioID+system+as+a+probe+for+plasma+membrane-associated+immunity+proteins.">Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins.</a> Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).</li><li>Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-dependent+biotinylation+screening+identifies+NbHYPK+as+a+novel+interacting+partner+of+ATG8+in+plants.">Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants.</a> BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).</li><li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID.">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurboID-based+proximity+labeling+reveals+that+UBR7+is+a+regulator+of+N+NLR+immune+receptor-mediated+immunity.">TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity.</a> Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).</li><li>Arora, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+proximity-dependent+biotinylation+approaches+in+different+plant+model+systems.">Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+TurboID-mediated+proximity+labeling+for+mapping+a+GSK3+kinase+signaling+network+in+Arabidopsis.">Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+protein+complexes+and+cell-type-specific+organellar+proteomes+in+Arabidopsis+enabled+by+TurboID.">Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID.</a> eLife. 8, 47864 (2019).</li><li>Yuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Barley+stripe+mosaic+virus+vector+for+virus+induced+gene+silencing+in+monocots+and+dicots.">A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots.</a> PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).</li><li>McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+production+of+highly+competent+cells+of+Agrobacterium+for+transformation+via+electroporation.">A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation.</a> Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).</li><li>Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+know+the+neighborhood:+using+proximity-dependent+biotinylation+to+characterize+protein+complexes+and+map+organelles.">Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).</li><li>Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Interactions+among+centrosome+components+identify+regulators+of+centriole+duplication.">Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication.</a> Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+pH+in+the+Arabidopsis+endomembrane+system.">Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system.</a> Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).</li><li>Bally, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+rise+of+Nicotiana+benthamiana:+a+plant+for+all+reasons.">The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons.</a> Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).</li></ol>

Il turboID biotina lega è generato dall'evoluzione diretta del BioID10basato sul display di lievito. Ha molti vantaggi rispetto ad altri enzimi PL. TurboID consente l'applicazione di PL ad altri sistemi di modello, tra cui mosche e vermi, la cui temperatura di crescita ottimale è di circa 25 c10. Anche se l'approccio PL è stato ampiamente utilizzato nei sistemi animali, la sua applicazione nelle piante è limitata. Il protocollo qui descritto fornisce una procedura passo...

Gli IPP sono alla base di vari processi cellulari. I metodi tradizionali per identificare gli IPP includono lo screening del lievito-due-ibrido (Y2H) e l'immunoprecipitazioni accoppiati con la spettrometria di massa (IP-MS)1. Tuttavia, entrambi soffrono di alcuni svantaggi. Ad esempio, lo screening Y2H richiede la disponibilità della libreria Y2H delle specie vegetali o animali bersaglio. La costruzione di queste biblioteche è laboriosa e costosa. Inoltre, l'approccio Y2H viene eseguito nel lievito eterologo dell'organismo eucatotico unidestro, che potrebbe non rappresentare lo stato cellulare delle cellule eucariotiche superiori.
Al contrario, IP-MS mostra una bassa efficienza nell'acquisizione di IPP transitori o deboli, ed è anche inadatto per quelle proteine con bassa abbondanza o alta idrofobicità. Molte importanti proteine coinvolte nei percorsi di segnalazione delle piante, come le chinasi recettoriali (RLK) o la famiglia NLR di recettori immunitari, sono espresse a bassi livelli e spesso interagiscono con altre proteine in modo transitorio. Pertanto, limita notevolmente la comprensione dei meccanismi alla base della regolazione di queste proteine.
Recentemente, sono stati sviluppati e utilizzati per lo studio degli Escherichia coli biotin ligase Ligase R118G (noto come BioID) metodi basati su ascorbate perossidasi ingegnerizzati (APEX) e un mutante Escherichia coli biotinli ligaseBirA R118G (noto come BioID) e utilizzati per lo studio degli IPP2,,3,4. Il principio di PL è che una proteina bersaglio di interesse è fusa con un enzima, che catalizza la formazione di labile biotinyl-AMP (bio-AMP). Questi bio-AMP gratuiti vengono rilasciati dagli enzimi PL e si diffondono in prossimità della proteina bersaglio, permettendo la biotinyalazione delle proteine prossimali nelle ammine primarie entro un raggio stimato di 10 nm5.
Questo approccio presenta vantaggi significativi rispetto agli approcci tradizionali Y2H e IP-MS, ad esempio la capacità di acquisire IPP temporanei o deboli. Inoltre, PL consente l'etichettatura delle proteine prossimali della proteina bersaglio nei loro ambienti cellulari nativi. Diversi enzimi PL hanno svantaggi unici quando li applicano a sistemi diversi. Ad esempio, sebbene APEX offra una cinetica di tagging più elevata rispetto al BioID e venga applicato con successo nei sistemi di mammiferi, il fabbisogno di perossido di idrogeno tossico (H2O2) in questo approccio lo rende inadatto per gli studi PL negli impianti.
Al contrario, PL basato su BioID evita l'uso del tossico H2O2, ma il tasso di etichettatura è lento (che richiede 18-24 h per completare la biotinylation), rendendo così meno efficiente la cattura di PpI transitori. Inoltre, la temperatura di incubazione più elevata (37 gradi centigradi) necessaria per un PL efficiente da parte di BioID introduce lo stress esterno ad alcuni organismi, come le piante4. Pertanto, è stato segnalatoun,7,8,9impiego limitato di PL a base di BioID in impianti (ad esempio protoplasti di riso, Arabidopsis e N. benthamiana) . L'enzima TurboID recentemente descritto supera le carenze di APEX e PL.10 PL basato su turboidi è stato applicato con successo nelle cellule dei mammiferi, mosche e vermi10. Recentemente, noi e altri gruppi di ricerca indipendenteottimizzato ed esteso l'uso di TurboID-based PL per studiare IPP in diversi sistemi vegetali, tra cui N. benthamiana e arabidopsis piante e pomodoro radici pelose11,12,13,14. Analisi comparative hanno indicato che TurboID offre prestazioni migliori per PL nelle piante rispetto al BioID11,14. Ha anche dimostrato la robustezza di PL a base di TurboID in planta identificando una serie di nuove interazioni con un recettore immunitario NLR11, una proteina i cui partner di interazione sono solitamente difficili da ottenere utilizzando metodi tradizionali.
Questo protocollo illustra il PL basato su TurboID in planta descrivendo l'identificazione delle proteine di interazione del dominio TIR N-terminale del recettore immunitario NLR nelle piante Di N. benthamiana. Il metodo può essere esteso a qualsiasi proteina di interesse in N. benthamiana. Ancora più importante, fornisce un importante riferimento per lo studio degli IPP in altre specie vegetali come l'Arabidopsis,il pomodoro e altri.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>721 Spectrophotometer</td>
			<td>Metash, made in China</td>
			<td>Q/SXFZ6</td>
			<td>For OD600 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639-1G</td>
			<td>50 mM Stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td>For affinity purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Costar 3590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>For Western blot analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride solution(LiCl), 8M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Zonkia, made in China</td>
			<td>KDC-2046</td>
			<td>For desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123.21D</td>
			<td>For bead adsorption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N07710</td>
			<td>For OD595 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 (IGEPAL CA-630)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-HA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotational mixer</td>
			<td>Kylin-Bell Lab Instrument</td>
			<td>WH-986</td>
			<td>For IP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shock incubator</td>
			<td>Labotery, made in China</td>
			<td>ZQPZ-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate(SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4390-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G-560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-jacket Incubator</td>
			<td>Blue pard, made in China</td>
			<td>GHP-9080</td>
			<td>For Agrobacterium incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89893</td>
			<td>For removal of biotin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks

Le tecniche di etichettatura di prossimità (PL) che utilizzano l'aossidasi ascorbate (APEX) ingegnerizzata o l'Escherichia coli biotini ligase ligase BirA (noto come BioID) sono state utilizzate con successo per l'identificazione delle interazioni proteina-proteina (IPP) nelle cellule dei mammiferi. Tuttavia, i requisiti di perossido di idrogeno tossico (H2O2) in PL basato su APEX, tempi di incubazione più lunghi con biotina (16-24 h) e una temperatura di incubazione più elevata (37 gradi centigradi) nel PL basato sul bioID limitano gravemente le loro applicazioni nelle piante. Il PL basato su TurboID recentemente descritto affronta molte limitazioni di BioID e APEX. TurboID consente una rapida etichettatura di prossimità delle proteine in soli 10 min in condizioni di temperatura ambiente (RT). Anche se l'utilità di TurboID è stata dimostrata in modelli animali, abbiamo recentemente dimostrato che PL a base di TurboID offre prestazioni migliori nelle piante rispetto al BioID per l'etichettatura delle proteine che sono propimali a una proteina di interesse. A questo proposito è fornito un protocollo passo-passo per l'identificazione dei partner di interazione proteica utilizzando il dominio del recettore N-terminale Toll/interleukin-1 (TIR) della famiglia di proteine leucina-ricca (NLR) legante-legame nucleotide come modello. Il metodo descrive la costruzione vettoriale, l'agroinfiltrazione dei costrutti di espressione proteica, il trattamento della biotina, l'estrazione e la dissalazione delle proteine, la quantificazione e l'arricchimento delle proteine biotinylate per purificazione dell'affinità. Il protocollo qui descritto può essere facilmente adattato per studiare altre proteine di interesse per Nicotiana e altre specie vegetali.

I dati rappresentativi, che illustrano i risultati attesi in base al protocollo descritto, sono adattati da .hang et al11. Figura 1 riepiloga le procedure per l'esecuzione di TurboID-based PL in N. benthamiana. La figura 2 mostra l'espressione proteica e la biotinylazione nelle foglie di N. benthamiana infiltrate. La figura 3 mostra che le proteine biotinylate nelle foglie infiltrate sono st...

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TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Descritto qui è un metodo di etichettatura di prossimità per l'identificazione dei partner di interazione del dominio TIR del recettore immunitario NLR nel tessuto fogliare di Nicotiana benthamiana. Viene inoltre fornito un protocollo dettagliato per l'identificazione delle interazioni tra altre proteine di interesse utilizzando questa tecnica nella Nicotiana e in altre specie vegetali.

Etichettatura di prossimità basata su turboid per in Planta identificazione di reti di interazione proteina-proteina

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been ...

I recettori immunitari NLR svolgono un ruolo cruciale nella mediazione della difesa delle piante contro vari agenti patogeni. Descriviamo un metodo di etichettatura di prossimità basato su TurboID per l'identificazione di partner di interazione del dominio del recettore Toll / interleuchina-1 contenente NLR come recettori immunitari nelle piante di Nicotiana benthamiana. Questo protocollo fornisce un importante riferimento per lo studio delle interazioni proteina-proteina in altre specie vegetali e può essere esteso a qualsiasi proteina di interesse per Nicotiana benthamiana.L'approccio di etichettatura di prossimità basato su TurboID ha un netto vantaggio rispetto agli approcci tradizionali perché può essere utilizzato per catturare interazioni proteina-proteina transitoria o debole in vivo. Inizia coltivando semi di N.benthamiana in terreno umido ad alta densità. Mantienili in una camera climatica con una luce di 18 ore e un periodo di foto scure di otto ore a 23-25 gradi Celsius.Tenere le piante nella camera per circa quattro settimane fino a quando non crescono fino a una fase fogliare da quattro a otto per la successiva agroinfiltrazione. Costruisci fusioni TurboID e trasforma i plasmidi in cellule competenti agrobacterium tumefaciens come descritto nel protocollo di testo. Utilizzare una siringa senza ago millilitro per infiltrarsi nell'inoculo dell'epidermide abassiale delle foglie di N.benthamiana completamente mature.A 36 ore dalla postfiltrazione, infiltrarsi in 200 biotina micromolare nelle foglie e mantenere la pianta per altre tre o 12 ore prima di raccogliere il tessuto fogliare. Per raccogliere il campione fogliare, tagliare le foglie infiltrate alla base del picciolo, rimuovere la vena fogliare e congelare il tessuto in azoto liquido. Macinare il tessuto fogliare con un pestello e malta e conservare la polvere in tubi Falcon da 15 o 50 millilitri a meno 80 gradi Celsius.Per estrarre la proteina totale, trasferire circa 0,35 grammi di polvere fogliare in un tubo da due millilitri. Assicurarsi di mantenere il tessuto a bassa temperatura nell'azoto liquido durante questo processo. Aggiungere 700 microlitri di tampone dilisi RIPA alla polvere.Vortice il tubo per 10 minuti e lasciare il campione sul ghiaccio per 30 minuti, mescolando il contenuto ogni quattro o cinque minuti invertendo i tubi. Centrifugare i tubi a 20.000 volte g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Quindi raccogli il supernatante.Rimuovere la biotina libera eseguendo il campione attraverso una colonna di desalinizzazione. Rimuovere il sigillatore nella parte inferiore della colonna e posizionarlo in un tubo da 50 millilitri. Quindi allentare il tappo e centrifugare la colonna a 1.000 volte g e quattro gradi Celsius per due minuti.Posizionare la colonna di desalinizzazione in un tubo fresco da 50 millilitri ed equilibrare la colonna tre volte con cinque millilitri di tampone dilisi RIPA. Centrifugarlo a 1.000 volte g e quattro gradi Celsius per due minuti e scartare il flusso ogni volta. Aggiungere 1,5 millilitri di estratto proteico sulla parte superiore della resina nella colonna equilibrata.E quando l'estratto entra nella resina, aggiungere altri 100 microlitri di tampone dilisi RIPA. Centrifugare la colonna per due minuti e lasciare i campioni dissalati sul ghiaccio fino a un ulteriore utilizzo. Per quantificare gli estratti proteici dissalti, misurare l'OD595 utilizzando uno spettrofotometro Bio-Rad.Disegnare la curva standard in base al valore della soluzione BSA gradiente e calcolare la concentrazione dei campioni proteici dissalati. Equilibrare le perle magnetiche coniugate streptavidin C1 con un millilitro di tampone dilisi RIPA per un minuto a temperatura ambiente. Utilizzare il rack magnetico per assorbire le perline per tre minuti e aspirare delicatamente la soluzione.Quindi ripetere il lavaggio un'altra volta. Trasferire l'estratto proteico sulle perline magnetiche equilibrate e incubare il tubo a quattro gradi Celsius durante la notte su un rotatore per purificare l'affinità delle proteine. Il giorno dopo, cattura le perline con un rack magnetico e aspira il supernatante.Successivamente, lavare le perline con 1,7 millilitri di tampone di lavaggio uno aggiungendolo al tubo e incubarlo sul rotore per otto minuti. Rimuovere il supernatante come descritto in precedenza e ripetere il lavaggio con 1,7 millilitri di tampone di lavaggio due e lavare il tampone tre. Aggiungere 1,7 millilitri di Tris HCL da 50 millimolare per rimuovere il detergente.Quindi posizionare il tubo sul rack magnetico e rimuovere il supernatante. Ripetere il lavaggio con un millilitro di Tris HCL da 50 millimolare e trasferire le perline in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Infine, lavare le perline sei volte con tampone in bicarbonato di ammonio millimolare per cinque minuti per lavaggio.Utilizzare 100 microlitri di perline per l'analisi immunoblot per confermare l'arricchimento delle proteine biotinilate e congelare flash il resto del campione da stoccare a meno 80 gradi Celsius. Le macchie occidentali sono state utilizzate per analizzare l'espressione proteica e la biotinylation nelle foglie agroinfiltrate di N.benthamiana. Le proteine biotinilate nelle foglie infiltrate sono state efficacemente arricchite con perline magnetiche coniugate streptavidina C1 per successive analisi della spettrometria di massa.Sono state catturate diverse proteine di varie dimensioni e l'analisi western delle proteine arricchite ha mostrato bande spalmato. Quando si tenta questa procedura, ricordarsi di rimuovere il sigillare nella parte inferiore della colonna di desalinizzazione e allentare i tappi prima di ogni centrifugazione. Questo protocollo è facilmente adattabile ad altre proteine di interesse per Nicotiana benthamiana e può anche essere utilizzato per estendere il TurboID PL in altre specie vegetali.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

Metodo di particelle agglutinazione per l&#39;identificazione Poliovirus

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Dissezione Host-virus Interazione in replica litico di un Herpesvirus modello

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Visualizzazione virus Dengue attraverso Alexa Fluor Etichettatura

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

Un metodo per l&#39;etichettatura vasi embrionali nei topi

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Un approccio comparato alla caratterizzano il paesaggio di ospite-patogeno interazioni proteina-proteina

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Saggi per l&#39;individuazione di nuovi antivirali contro virus della Bluetongue

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Rapida identificazione dei batteri Gram-negativi dal sangue brodo di coltura Uso MALDI-TOF

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolamento, identificazione e purificazione di cellule murine timica epiteliali

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Identificazione di sequenze di localizzazione Plasmodesmal in proteine In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identificazione di fattori di virulenza di Mycobacterium abscessus per replica intracellulare nei fagociti

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...