Name: turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks
Uploaded: 2020-05-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks at JoVE.com

이 사업은 국립 트랜스제닉 과학 기술 프로그램(2019ZX08010-003 ~ Y.Z.), 중국 국립 자연과학 재단(31872637 ~ Y.Z.), 중앙대학 기초연구기금(2019TC028 ~Y.Z.), NSF-IOS-1344의 보조금으로 지원되었다. NSF-IOS-1339185 및 NIH-GM132582-01~ S.P.D.K.

참고: 메서드의 개요는 그림 1에나와 있습니다.
1. 식물 재료 준비
<ol><li>고밀도로 젖은 토양에서 N. 벤타미아나 씨앗을 재배하고 23-25 °C에서 16 h 빛 (약 75 μmol /m2s) 및 8 h 어두운 광주기를 가진 기후 챔버에서 유지합니다.</li>
	<li>약 1 주일 후, 조심스럽게 4 'x 4'냄비에 각 젊은 묘목을 전송하고 같은 챔버에 묘목을 유지.</li>
	<li>약...

<ol>
	<li>Bergg&#229;rd, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li><li>Kim, D. I., Roux, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+void:+proximity-based+labeling+of+proteins+in+living+cells.">Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells.</a> Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).</li><li>Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+interacting+proteins:+Application+of+BioID+as+a+discovery+tool.">Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells.">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nuclear+pore+complex+architecture+with+proximity-dependent+biotinylation.">Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).</li><li>Lin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+proximal+and+interacting+proteins+in+rice+protoplasts+by+proximity-dependent+biotinylation.">Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).</li><li>Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+proximity+dependent+biotin+identification+(BioID).">In planta proximity dependent biotin identification (BioID).</a> Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).</li><li>Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+in+planta+BioID+system+as+a+probe+for+plasma+membrane-associated+immunity+proteins.">Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins.</a> Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).</li><li>Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-dependent+biotinylation+screening+identifies+NbHYPK+as+a+novel+interacting+partner+of+ATG8+in+plants.">Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants.</a> BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).</li><li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID.">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurboID-based+proximity+labeling+reveals+that+UBR7+is+a+regulator+of+N+NLR+immune+receptor-mediated+immunity.">TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity.</a> Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).</li><li>Arora, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+proximity-dependent+biotinylation+approaches+in+different+plant+model+systems.">Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+TurboID-mediated+proximity+labeling+for+mapping+a+GSK3+kinase+signaling+network+in+Arabidopsis.">Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+protein+complexes+and+cell-type-specific+organellar+proteomes+in+Arabidopsis+enabled+by+TurboID.">Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID.</a> eLife. 8, 47864 (2019).</li><li>Yuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Barley+stripe+mosaic+virus+vector+for+virus+induced+gene+silencing+in+monocots+and+dicots.">A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots.</a> PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).</li><li>McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+production+of+highly+competent+cells+of+Agrobacterium+for+transformation+via+electroporation.">A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation.</a> Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).</li><li>Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+know+the+neighborhood:+using+proximity-dependent+biotinylation+to+characterize+protein+complexes+and+map+organelles.">Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).</li><li>Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Interactions+among+centrosome+components+identify+regulators+of+centriole+duplication.">Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication.</a> Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+pH+in+the+Arabidopsis+endomembrane+system.">Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system.</a> Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).</li><li>Bally, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+rise+of+Nicotiana+benthamiana:+a+plant+for+all+reasons.">The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons.</a> Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).</li></ol>

터보ID 비오틴 리가제는 바이오ID10의효모 디스플레이 기반 의 방향 진화에 의해 생성된다. 그것은 다른 PL 효소에 비해 많은 장점을 갖는다. TurboID는 최적의 성장 온도가 약 25 °C10인파리와 웜을 포함한 다른 모델 시스템에 PL을 적용 할 수 있습니다. PL 접근법은 동물 시스템에서 널리 사용되어 왔지만 식물에서의 적용은 제한적입니다. 여기에 설명된 프로토콜은 ...

PPI는 다양한 세포 과정의 기초입니다. PPI를 확인하기 위한 전통적인 방법은 질량 분석법 (IP-MS)와 결합된 효모 2 하이브리드 (Y2H) 검열 및 면역침전을 포함합니다 1. 그러나 둘 다 몇 가지 단점으로 고통받고 있습니다. 예를 들어, Y2H 스크리닝은 표적 식물 또는 동물 종의 Y2H 라이브러리의 가용성을 요구한다. 이 도서관의 건설은 노동 집약적이고 비싸다. 더욱이, Y2H 접근법은 더 높은 진핵 세포의 세포 상태를 나타내지 않을 수 있는 이종 단세포 진핵 생물 효모에서 수행된다.
대조적으로, IP-MS는 일시적 또는 약한 PPI를 포착하는 데 있어 낮은 효율을 나타내며, 또한 낮은 풍부하거나 높은 소수성을 가진 단백질에 적합하지 않다. 수용체 같이 키나아제 (RLKs) 또는 면역 수용체의 NLR 가족과 같은 식물 신호 통로에서 관련시킨 많은 중요한 단백질은 낮은 수준에서 표현되고 수시로 그밖 단백질과 일시적으로 상호 작용합니다. 따라서, 그것은 크게 이러한 단백질의 조절의 기본 메커니즘의 이해를 제한.
최근에는 엔지니어링된 아스코르베이트 과산화수산아제(APEX)와 돌연변이 대장균 리게틴 리가제 비라R118G(BioID로 알려짐)에 기초한 근접 라벨링(PL) 방법이 개발되어 PPIs2,3,4의,4연구에 활용되고 있다. PL의 원리는 관심있는 표적 단백질이 효소와 융합되어 비질 바이오티닐-AMP(bio-AMP)의 형성을 촉매한다는 것입니다. 이러한 자유 바이오-AMP는 PL 효소에 의해 방출되고 표적 단백질 부근으로 확산되어 10 nm5의추정 반경 내에 있는 1차 아민에서 근위 단백질의 생체측을 허용한다.
이 접근법은 과도 또는 약한 PPI를 캡처하는 기능과 같은 기존의 Y2H 및 IP-MS 접근 방식에 비해 상당한 이점이 있습니다. 더욱이, PL은 그들의 모국세포 환경에서 표적 단백질의 근위 단백질의 라벨링을 허용한다. 다른 PL 효소는 다른 시스템에 적용할 때 독특한 단점이 있습니다. 예를 들어, APEX는 BioID에 비해 더 높은 태깅 역학을 제공하고 포유류 시스템에 성공적으로 적용되지만,2이 접근법에서 독성 과산화수소(H2O2)의요구 사항은 식물의 PL 연구에 적합하지 않습니다.
대조적으로, BioID 기반 PL은 독성H2O2의사용을 피하지만 라벨링 속도가 느립니다 (생체 이식을 완료하기 위해 18-24 시간이 필요함) 따라서 과도 PPI의 캡처가 덜 효율적입니다. 더욱이, BioID에 의한 효율적인 PL에 필요한 높은 인큐베이션 온도(37°C)는 식물4와같은 일부 유기체에 외부 스트레스를 유발한다. 따라서 식물(즉, 쌀 톱니세포, 애기장대 및 N. 벤타미아나)에서 BioID 기반 PL의 제한된 배치가6,7,78,9로보고되었다.,8 최근 기술된 터보ID 효소는 APEX 및 BioID 기반 PL. TurboID의 결핍을 극복하여 RT10에서10분 이내에 PL을 성취할 수 있는 높은 활성을 보였다. TurboID 기반 PL은 포유류 세포, 파리 및 웜10에성공적으로 적용되었습니다. 최근, 당사및 기타 연구그룹은 N. 벤타미아나 및, 애기장대 식물 및 토마토 털뿌리11,12,13,,,14를포함한 다양한 식물 시스템에서 PPI를 연구하기 위한 TurboID 기반 PL의 사용을 독립적으로 최적화및 확장시켰다. 비교 분석에 따르면 TurboID는 BioID11,,14에비해 식물에서 PL에 대해 더 나은 성능을 보입니다. 또한 전통적인 방법을 사용하여 얻기 어려운 상호 작용 파트너가 일반적으로 어려운 NLR 면역 수용체11과의 새로운 상호 작용의 수를 확인함으로써 질라에서 TurboID 기반 PL의 견고성을 입증했습니다.
이 프로토콜은 N. 벤타미아나 식물에서 NLR 면역 수용체의 N-말단 TIR 도메인의 상호작용 단백질의 식별을 설명함으로써 질라에서 터보ID 기반 PL을 설명한다. 이 방법은 N. 벤타미아나에관심있는 모든 단백질로 확장 될 수 있습니다. 더 중요 한 것은, 그것은 애기장대등 다른 식물 종에서 PPI를 조사에 대 한 중요 한 참조를 제공 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>721 Spectrophotometer</td>
			<td>Metash, made in China</td>
			<td>Q/SXFZ6</td>
			<td>For OD600 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639-1G</td>
			<td>50 mM Stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td>For affinity purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Costar 3590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>For Western blot analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride solution(LiCl), 8M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Zonkia, made in China</td>
			<td>KDC-2046</td>
			<td>For desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123.21D</td>
			<td>For bead adsorption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N07710</td>
			<td>For OD595 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 (IGEPAL CA-630)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-HA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotational mixer</td>
			<td>Kylin-Bell Lab Instrument</td>
			<td>WH-986</td>
			<td>For IP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shock incubator</td>
			<td>Labotery, made in China</td>
			<td>ZQPZ-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate(SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4390-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G-560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-jacket Incubator</td>
			<td>Blue pard, made in China</td>
			<td>GHP-9080</td>
			<td>For Agrobacterium incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89893</td>
			<td>For removal of biotin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks

근접 라벨링(PL) 기술은 엔지니어링된 아스코르브베이트 과산화수배 (APEX) 또는 대장균 비오틴 리가제 비라(BioID로 알려짐)를 사용하여 포유류 세포에서 단백질-단백질 상호작용(PPI)을 식별하는 데 성공적으로 사용되어 왔다. 그러나 APEX 기반 PL에서2독성 과산화수소(H2O2)의요구 사항, 비오틴(16-24시간)의 배양 시간 연장, BioID 기반 PL의 더 높은 인큐베이션 온도(37°C)는 식물에서의 적용을 심각하게 제한합니다. 최근에 설명된 TurboID 기반 PL은 BioID 및 APEX의 많은 한계를 해결합니다. TurboID는 실온(RT) 조건에서 단 10분 만에 단백질의 신속한 근접 라벨링을 허용합니다. TurboID의 유용성은 동물 모델에서 입증되었지만, 우리는 최근 터보 ID 기반 PL이 관심있는 단백질에 근접한 단백질의 라벨링에 대한 BioID에 비해 식물에서 더 나은 성능을 보였다. 여기에 제공된 단계별 프로토콜은 뉴클레오티드 결합 류신-리치 반복(NLR) 단백질 패밀리의 N-말단 톨/인터류키핀-1 수용체(TIR) 도메인을 이용하여 단백질 상호작용 파트너의 식별을 위한 단계별 프로토콜이다. 이 방법은 친화도 정제에 의한 생체 연단백질의 벡터 구성, 단백질 발현 구조, 비오틴 처리, 단백질 추출 및 탈염, 정량화 및 농축에 대해 설명합니다. 여기에 기술된 프로토콜은 니코티아나 및 다른 식물 종에서 관심 있는 다른 단백질을 연구하기 위해 쉽게 적응될 수 있다.

설명된 프로토콜에 기초하여 예상되는 결과를 나타내는 대표적인 데이터는 Zhang et al11에서조정된다. 그림 1은 N. 벤타미아나에서터보ID 기반 PL을 수행하기 위한 절차를 요약한 것입니다. 도 2는 침윤된 N. 벤타미아나 잎에서단백질 발현 및 생체이식화를 나타낸다. 도 3은 침윤된 잎내의 생체티니화 ?...

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TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

여기서 설명된 것은 니코티아나 벤타미아나 잎 조직에서 NLR 면역 수용체의 TIR 도메인의 상호작용 파트너의 식별을 위한 근접 라벨링 방법이다. 또한 니코티아나 및 다른 식물 종에서 이 기술을 사용하여 관심 있는 다른 단백질 간의 상호 작용을 식별하기 위한 상세한 프로토콜이 제공된다.

단백질-단백질 상호 작용 네트워크의 질라 식별을 위한 터보ID 기반 근접 라벨링

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been ...

NLR 면역 수용체는 다양한 병원체에 대한 식물 방어를 중재하는 데 중요한 역할을합니다. 우리는 니코티아나 벤타미안 식물에 있는 면역 수용체와 같은 NLR를 포함하는 Toll/interleukin-1 수용체 도메인의 상호 작용 파트너의 식별을 위한 TurboID 기지를 둔 근접 라벨링 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 다른 식물 종에서 단백질 단백질 상호 작용을 조사하기위한 중요한 참조를 제공하고 니코티아나 벤타미안에 관심있는 모든 단백질로 확장 될 수있다.TurboID 기반 근접 라벨링 접근법은 생체 내에서 일시적 또는 약한 단백질 단백질 상호 작용을 포착하는 데 사용할 수 있기 때문에 전통적인 접근 방식에 비해 뚜렷한 이점을 가지고 있습니다. 고밀도에서 젖은 토양에서 N.benthamiana 씨앗을 재배하여 시작합니다. 섭씨 23~25도의 18시간 빛과 8시간 어두운 사진 으로 기후 챔버에서 유지하십시오.그들은 후속 농가 침투에 대한 4 ~ 8의 잎 단계로 성장할 때까지 약 4 주 동안 챔버에 식물을 유지합니다. TurboID 융합을 구성하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플라스미드를 아그로박테리움 tumefaciens 유능한 세포로 변환합니다. 완전히 성숙한 N.benthamiana 잎의 축축표의 접종에 침투하기 위해 1 밀리리터 바늘없는 주사기를 사용합니다.여과 후 36시간 동안 200마이크로몰러 비오틴을 잎에 침투하여 잎 조직을 수확하기 전에 3~12시간 동안 식물을 유지합니다. 잎 샘플을 수집하려면, 쁘띠올의 기지에서 침투 잎을 잘라 잎 정맥을 제거하고, 액체 질소에 조직을 동결 플래시. 잎 조직을 유봉과 박격포로 갈아서 15 또는 50 밀리리터 팔콘 튜브에 섭씨 영하 80도에 저장합니다.총 단백질을 추출하려면 약 0.35 그램의 잎 분말을 2 밀리리터 튜브로 전달하십시오. 이 과정에서 액체 질소의 저온에서 조직을 유지하십시오. 700 마이크로리터의 RIPA 용해 버퍼를 파우더에 넣습니다.튜브를 10분 동안 소용돌이치며 30분 동안 샘플을 얼음 위에 두고 튜브를 반전시켜 4~5분마다 내용물들을 섞습니다. 10 분 동안 섭씨 4도에서 20, 000 배 g에서 튜브를 원심 분리합니다. 그런 다음 상체를 수집합니다.탈염 컬럼을 통해 샘플을 실행하여 무료 비오틴을 제거합니다. 컬럼 하단의 실러를 제거하고 50 밀리리터 튜브에 놓습니다. 그런 다음 캡을 풀고 컬럼을 1, 000배, 섭씨 4도에서 2분간 분리합니다.탈염 컬럼을 신선한 50 밀리리터 튜브에 넣고 RIPA 리시스 버퍼 5밀리리터로 컬럼을 3번 평형화합니다. 원심분리기는 1, 000배, 섭씨 4도에서 2분간 2분간, 매번 흐름을 폐기합니다. 1.5 밀리리터의 단백질 추출물을 평형 컬럼의 수지 위에 넣습니다.그리고 추출물이 수지에 들어가면 RIPA 리시스 버퍼의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 컬럼을 2분 동안 원심분리하고 탈염된 샘플을 얼음 위에 두어 추가 사용이 가능해질 때까지 그대로 둡니다. 탈염 단백질 추출물을 정량화하려면 바이오 라드 분광계를 사용하여 OD595를 측정합니다.그라데이션 BSA 용액의 값을 기준으로 표준 곡선을 그리고 탈염 단백질 샘플의 농도를 계산합니다. 실온에서 1분 동안 RIPA 용해 버퍼 1밀리리터로 자성구를 분리합니다. 마그네틱 랙을 사용하여 구슬을 3분 동안 흡수하고 용액을 부드럽게 흡인시합니다.그런 다음 세탁을 한 번 더 반복합니다. 단백질 추출물을 평형 마그네틱 구슬로 옮기고 회전기에서 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 튜브를 배양하여 단백질을 정화합니다. 다음 날, 마그네틱 랙으로 구슬을 캡처하고 슈퍼 나티브를 흡인.다음으로, 튜브에 추가하여 1.7 밀리리터의 워시 버퍼로 구슬을 씻고 8 분 동안 로터에 배양하십시오. 앞서 설명한 대로 상체를 제거하고 세척 버퍼 2의 1.7 밀리리터로 세척을 반복하고 버퍼 3을 세척합니다. 세제를 제거하기 위해 50 밀리머 트리 HCL의 1.7 밀리리터를 추가합니다.그런 다음 튜브를 자기 랙에 놓고 상체를 제거합니다. 50 밀리머 트리스 HCL의 1 밀리리터로 세척을 반복하고 구슬을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮겨보십시오. 마지막으로, 50 밀리몰라 중탄산염 버퍼로 구슬을 세척당 5분간 6회 세척합니다.면역blot 분석을 위해 100 마이크로리터의 비드를 사용하여 생체화 단백질의 농축을 확인하고 나머지 시료를 영하 80도에서 보관할 수 있도록 플래시를 동결합니다. 서양 얼룩은 농약 이내 N.benthamiana 잎에서 단백질 발현 및 생체 자극을 분석하는 데 사용되었다. 침투된 잎에 있는 생물요닉한 단백질은 후속 질량 분광법 분석을 위한 연쇄상비딘 C1 공액 자기 구슬로 효율적으로 농축되었다.다양한 크기의 다른 단백질이 포착되었고 농축 된 단백질의 서양 얼룩 분석은 얼룩진 밴드를 보였다. 이 절차를 시도할 때는 탈염 열 의 하단에있는 실러를 제거하고 각 원심 분리 전에 캡을 느슨하게해야합니다. 이 프로토콜은 니코티아나 벤타미안에 대한 관심있는 다른 단백질에 쉽게 적응할 수 있으며 다른 식물 종에서 TurboID PL을 확장하는 데 사용할 수도 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

Poliovirus 식별을위한 입자 응집 방법

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

연구

면역학 및 감염병학

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

모델 Herpesvirus의 Lytic 복제의 해부 호스트 바이러스 상호 작용

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

알렉사 플루어 라벨링을 통해 뎅그열 바이러스를 떠올리

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

배아 마우스에 Vasculature을 라벨링하는 방법

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

호스트 병원체 단백질 - 단백질 상호 작용의 풍경의 특성을 비교 접근

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Bluetongue 바이러스에 대한 항 바이러스제 소설의 식별에 대한 분석

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

MALDI-TOF 질량 분석기를 사용하여 혈액 배양액에서 그람 음성 박테리아의 빠른 확인

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

격리, 식별 및 쥐과 흉선 상피 세포의 정화

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmal 지역화 시퀀스 Planta에 단백질의 식별

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

식 세포에서 세포내 복제에 대 한의 진 균 abscessus 독성 마커의 식별

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...