Name: turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks
Uploaded: 2020-05-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Transgenic Science and Technology Program (2019ZX08010-003 til Y.Z.), National Natural Science Foundation of China (31872637 til Y.Z.), og Fundamental Research Funds for the Central Universities (2019TC028 til Y.Z.), og NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185, og NIH-GM132582-01 til S.P.D.K.

MERK: En oversikt over metoden vises i figur 1.
1. Forberedelse av plantemateriale
<ol><li>Grow N. benthamiana frø i våt jord ved høy tetthet og opprettholde dem i et klimakammer med en 16 h lys (ca 75 μmol / m2s) og 8 t mørk fotoperiode ved 23-25 °C.</li>
	<li>Omtrent 1 uke senere, nøye overføre hver ung frøplante til 4 'x 4 ' potter og holde plantene i samme kammer.</li>
	<li>Vedlikehold plantene i kammeret i ca 4 uker...

<ol>
	<li>Bergg&#229;rd, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li><li>Kim, D. I., Roux, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+void:+proximity-based+labeling+of+proteins+in+living+cells.">Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells.</a> Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).</li><li>Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+interacting+proteins:+Application+of+BioID+as+a+discovery+tool.">Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells.">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nuclear+pore+complex+architecture+with+proximity-dependent+biotinylation.">Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).</li><li>Lin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+proximal+and+interacting+proteins+in+rice+protoplasts+by+proximity-dependent+biotinylation.">Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).</li><li>Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+proximity+dependent+biotin+identification+(BioID).">In planta proximity dependent biotin identification (BioID).</a> Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).</li><li>Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+in+planta+BioID+system+as+a+probe+for+plasma+membrane-associated+immunity+proteins.">Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins.</a> Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).</li><li>Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-dependent+biotinylation+screening+identifies+NbHYPK+as+a+novel+interacting+partner+of+ATG8+in+plants.">Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants.</a> BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).</li><li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID.">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurboID-based+proximity+labeling+reveals+that+UBR7+is+a+regulator+of+N+NLR+immune+receptor-mediated+immunity.">TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity.</a> Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).</li><li>Arora, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+proximity-dependent+biotinylation+approaches+in+different+plant+model+systems.">Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+TurboID-mediated+proximity+labeling+for+mapping+a+GSK3+kinase+signaling+network+in+Arabidopsis.">Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+protein+complexes+and+cell-type-specific+organellar+proteomes+in+Arabidopsis+enabled+by+TurboID.">Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID.</a> eLife. 8, 47864 (2019).</li><li>Yuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Barley+stripe+mosaic+virus+vector+for+virus+induced+gene+silencing+in+monocots+and+dicots.">A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots.</a> PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).</li><li>McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+production+of+highly+competent+cells+of+Agrobacterium+for+transformation+via+electroporation.">A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation.</a> Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).</li><li>Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+know+the+neighborhood:+using+proximity-dependent+biotinylation+to+characterize+protein+complexes+and+map+organelles.">Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).</li><li>Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Interactions+among+centrosome+components+identify+regulators+of+centriole+duplication.">Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication.</a> Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+pH+in+the+Arabidopsis+endomembrane+system.">Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system.</a> Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).</li><li>Bally, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+rise+of+Nicotiana+benthamiana:+a+plant+for+all+reasons.">The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons.</a> Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).</li></ol>

TurboID biotin ligase genereres av gjær skjermbasert rettet utvikling av BioID10. Den har mange fordeler fremfor andre PL-enzymer. TurboID tillater bruk av PL til andre modellsystemer, inkludert fluer og ormer, hvis optimale veksttemperatur er rundt 25 °C10. Selv om PL-tilnærmingen har blitt mye brukt i dyresystemer, er bruken i planter begrenset. Protokollen som er beskrevet her gir en trinnvis prosedyre for å etablere Den TurboID-baserte PL i N. benthamiana, ...

PPI er grunnlaget for ulike cellulære prosesser. Tradisjonelle metoder for å identifisere PPIer inkluderer gjær-to-hybrid (Y2H) screening og immunoprecipitation kombinert med massespektrometri (IP-MS)1. Men begge lider av noen ulemper. For eksempel krever Y2H screening tilgjengeligheten av Y2H-biblioteket til målanlegget eller dyrearter. Byggingen av disse bibliotekene er arbeidskrevende og dyrt. Videre utføres Y2H-tilnærmingen i heterologøs encellede eukaryotisk organismegjær, som kanskje ikke representerer cellulær status for høyere eukaryoetiske celler.
Ip-MS viser derimot lav effektivitet i å fange forbigående eller svake PPI-er, og det er også uegnet for de proteinene med lav overflod eller høy hydrofobiitet. Mange viktige proteiner involvert i anlegget signalisering veier som reseptor-lignende kinaser (RLKs) eller NLR familien av immunreseptorer uttrykkes på lave nivåer og ofte samhandle med andre proteiner transiently. Derfor begrenser det i stor grad forståelsen av mekanismer som ligger til grunn for reguleringen av disse proteinene.
Nylig er nærhetsmerking (PL) metoder basert på konstruert askcorbat peroksidase (APEX) og en mutant Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (kjent som BioID) utviklet og benyttet for studiet av PPIs2,3,4. Prinsippet om PL er at et målprotein av interesse er smeltet sammen med et enzym, som katalyserer dannelsen av labile biotinyl-AMP (bio-AMP). Disse gratis bio-AMP frigjøres av PL enzymer og diffustil nærheten av målet protein, slik at biotinylation av proksimale proteiner ved de primære aminer innenfor en estimert radius på 10 nm5.
Denne tilnærmingen har betydelige fordeler i forhold til de tradisjonelle Y2H- og IP-MS-tilnærmingene, for eksempel evnen til å fange forbigående eller svake PPI-er. Videre tillater PL merking av proksimale proteiner av målproteinet i sine innfødte cellulære miljøer. Ulike PL enzymer har unike ulemper når du bruker dem på forskjellige systemer. For eksempel, selv om APEX tilbyr høyere tagging kinetikk sammenlignet med BioID og er vellykket brukt i pattedyr systemer, kravet om giftig hydrogenperoksid (H2O2) i denne tilnærmingen gjør det uegnet for PL studier i planter.
BioID-baserte PL unngår derimot bruk av giftig H2O2, men merkingshastigheten er langsom (krever 18–24 timer for å fullføre biotinylation), og dermed gjøre fangsten av forbigående PPIer mindre effektiv. Videre introduserer høyere inkubasjonstemperatur (37 °C) som kreves for effektiv PL av BioID, ekstern stress for enkelte organismer, for eksempel planter4. Derfor er begrenset distribusjon av BioID-basert PL i planter (dvs. risprotoplast, arabidopsis og N. benthamiana) rapportert6,,7,8,9. Det nylig beskrevne TurboID-enzymet overvinner manglene til APEX og BioID-baserte PL. TurboID viste høy aktivitet som muliggjør oppnåelse av PL innen 10 minutter ved RT10. TurboID-basert PL har blitt brukt i pattedyrceller, fluer og ormer10. Nylig optimaliserte og utvidet vi og andre forskningsgrupper uavhengig av TurboID-baserte PL for å studere PPI-er i forskjellige plantesystemer, inkludert N. benthamiana og Arabidopsis planter og tomat hårete røtter11,12,13,14. Komparative analyser indikerte at TurboID yter bedre for PL i anlegg sammenlignet med BioID11,14. Det har også vist robustheten til TurboID-baserte PL i planta ved å identifisere en rekke nye interaksjoner med en NLR immunreseptor11, et protein hvis interaksjonspartnere vanligvis er vanskelige å få ved hjelp av tradisjonelle metoder.
Denne protokollen illustrerer Den TurboID-baserte PL i planta ved å beskrive identifisering av interaksjonsproteiner i N-terminal TIR-domenet til NLR-immunreseptoren i N. benthamiana-planter. Metoden kan utvides til alle proteiner av interesse i N. benthamiana. Enda viktigere, det gir en viktig referanse for å undersøke PPIer i andre plantearter som Arabidopsis,tomat og andre.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>721 Spectrophotometer</td>
			<td>Metash, made in China</td>
			<td>Q/SXFZ6</td>
			<td>For OD600 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639-1G</td>
			<td>50 mM Stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td>For affinity purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Costar 3590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>For Western blot analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride solution(LiCl), 8M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Zonkia, made in China</td>
			<td>KDC-2046</td>
			<td>For desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123.21D</td>
			<td>For bead adsorption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N07710</td>
			<td>For OD595 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 (IGEPAL CA-630)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-HA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotational mixer</td>
			<td>Kylin-Bell Lab Instrument</td>
			<td>WH-986</td>
			<td>For IP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shock incubator</td>
			<td>Labotery, made in China</td>
			<td>ZQPZ-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate(SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4390-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G-560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-jacket Incubator</td>
			<td>Blue pard, made in China</td>
			<td>GHP-9080</td>
			<td>For Agrobacterium incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89893</td>
			<td>For removal of biotin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks

Nærhetmerkingsteknikker (PL) ved hjelp av konstruertascorbat peroksidase (APEX) eller Escherichia coli biotin ligase BirA (kjent som BioID) har blitt brukt til identifisering av proteinproteininteraksjoner (PPI) i pattedyrceller. Kravene til giftig hydrogenperoksid (H2O2) i APEX-basert PL, lengre inkubasjonstid med biotin (16–24 timer) og høyere inkubasjonstemperatur (37 °C) i BioID-basert PL begrenser sine applikasjoner alvorlig i planter. Den nylig beskrevne TurboID-baserte PL-en tar for seg mange begrensninger av BioID og APEX. TurboID tillater rask nærhetmerking av proteiner på bare 10 minutter under romtemperatur (RT) forhold. Selv om nytten av TurboID har blitt demonstrert i dyremodeller, viste vi nylig at TurboID-baserte PL utfører bedre i planter sammenlignet med BioID for merking av proteiner som er proksimale til et protein av interesse. Forutsatt her er en trinnvis protokoll for identifisering av protein interaksjon partnere ved hjelp av N-terminal Toll / interleukin-1 reseptor (TIR) domene av nucleotide-bindende leucine-rik gjenta (NLR) protein familie som modell. Metoden beskriver vektorkonstruksjon, agroinfiltrasjon av proteinuttrykkskonstruksjoner, biotinbehandling, proteinekstraksjon og desalting, kvantifisering og berikelse av de biotinylated proteinene ved affinitetsrensing. Protokollen som er beskrevet her, kan lett tilpasses for å studere andre proteiner av interesse for Nicotiana og andre plantearter.

De representative dataene, som illustrerer de forventede resultatene basert på den beskrevne protokollen, er tilpasset fra Zhang et al11. Figur 1 oppsummerer prosedyrene for å utføre TurboID-basert PL i N. benthamiana. Figur 2 viser proteinuttrykket og biotinylasjonen i de infiltrerte N. benthamianabladene. Figur 3 viser at de biotinylated proteinene i de infiltrerte bladene ble effektivt...

Watch this Scientific Journal Video about TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks at JoVE.com

TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Beskrevet her er en nærhet merking metode for identifisering av interaksjonpartnere av TIR-domenet til NLR immunreseptoren i Nicotiana benthamiana bladvev. Også gitt er en detaljert protokoll for identifisering av interaksjoner mellom andre proteiner av interesse ved hjelp av denne teknikken i Nikotiana og andre plantearter.

TurboID-basert nærhetmerking for i Planta-identifisering av proteinproteininteraksjonsnettverk

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been ...

NLR immunreseptorer spiller en avgjørende rolle i å megme planteforsvar mot ulike patogener. Vi beskriver en TurboID-basert nærhetsmerkingsmetode for identifisering av samhandlingspartnere av Toll/interleukin-1 reseptordomene som inneholder NLRs som immunreseptorer i Nicotiana benthamiana planter. Denne protokollen gir en viktig referanse for å undersøke protein-protein interaksjoner i andre plantearter, og det kan utvides til ethvert protein av interesse for Nicotiana benthamiana.Den TurboID-baserte nærhetsmerkingstilnærmingen har en klar fordel over de tradisjonelle tilnærmingene fordi den kan brukes til å fange forbigående eller svake protein-proteininteraksjoner in vivo. Start med å dyrke N.benthamiana frø i våt jord med høy tetthet. Oppretthold dem i et klimakammer med et 18-timers lys og åtte timers mørk fotoperiode på 23 til 25 grader Celsius.Hold plantene i kammeret i omtrent fire uker til de vokser til et bladstadium på fire til åtte for etterfølgende agroinfiltrasjon. Konstruer TurboID-fusjoner og forvandle plasmidene til Agrobacterium tumefaciens kompetente celler som beskrevet i tekstprotokollen. Bruk en en milliliter nålløs sprøyte for å infiltrere inokulumet til abaksialepidermis av de fullt modne N.benthamiana bladene.Ved 36 timer etter filtrering infiltrerer 200 mikromolarbiotin i bladene og opprettholder anlegget i ytterligere tre til 12 timer før høsting av bladvevet. For å samle bladprøven, kutt de infiltrerte bladene ved foten av petiole, fjern bladvenen og flash fryse vevet i flytende nitrogen. Grind bladvevet med en pestle og mørtel og lagre pulveret i 15 eller 50 milliliter Falcon rør på minus 80 grader Celsius.For å trekke ut det totale proteinet, overfør ca 0,35 gram bladpulver til et to milliliter rør. Sørg for å opprettholde vevet ved lav temperatur i flytende nitrogen under denne prosessen. Tilsett 700 mikroliter RIPA lysisbuffer til pulveret.Vortex røret i 10 minutter og la prøven på is i 30 minutter, bland innholdet hvert fjerde til femte minutt ved å invertere rørene. Sentrifuger rørene ved 20.000 ganger g ved fire grader Celsius i 10 minutter. Samle deretter det overnaturlige.Fjern den gratis biotinen ved å kjøre prøven gjennom en desaltingskolonne. Fjern tetningsforseglingen nederst i kolonnen og legg den i et 50 milliliter rør. Løsne deretter hetten og sentrifuger kolonnen på 1000 ganger g og fire grader Celsius i to minutter.Plasser avsaltingskolonnen i et friskt 50 milliliter rør og likevekt av kolonnen tre ganger med fem milliliter RIPA lysisbuffer. Sentrifuger den ved 1, 000 ganger g og fire grader Celsius i to minutter og kast gjennomstrømningen hver gang. Tilsett 1,5 milliliter proteinekstrakt til toppen av harpiksen i den likevektskolonnen.Og når ekstraktet kommer inn i harpiksen, legg til ytterligere 100 mikroliter RIPA lysisbuffer. Sentrifuger kolonnen i to minutter og la desaltede prøvene stå på is inntil videre bruk. For å kvantifisere desaltede proteinekstraktene, mål OD595 ved hjelp av et Bio-Rad spektrofotometer.Tegn standardkurven basert på verdien av graderings-BSA-løsningen og beregn konsentrasjonen av de avsaltede proteinprøvene. Likevekt streptavidin C1 konjugert magnetiske perler med en milliliter RIPA lysis buffer i ett minutt ved romtemperatur. Bruk magnetstativet til å absorbere perlene i tre minutter og aspirere forsiktig løsningen.Gjenta deretter vasken en gang til. Overfør proteinekstraktet til de likeliberte magnetiske perlene og inkubere røret ved fire grader Celsius over natten på en rotator for å affinitet rense proteinene. På neste dag, fange perlene med et magnetisk stativ og aspirere supernatant.Deretter vasker du perlene med 1,7 milliliter vaskebuffer en ved å legge den til røret og inkubere den på rotoren i åtte minutter. Fjern det overnaturlige som beskrevet tidligere, og gjenta vasken med 1,7 milliliter vaskebuffer to og vask buffer tre. Tilsett 1,7 milliliter 50 millimolar Tris HCL for å fjerne vaskemiddelet.Plasser deretter røret på magnetstativet og fjern supernatanten. Gjenta vasken med en milliliter på 50 millimolar Tris HCL og overfør perlene til et nytt 1,5 milliliter rør. Til slutt vask perlene seks ganger med 50 millimolar ammonium bikarbonatbuffer i fem minutter per vask.Bruk 100 mikroliter perler for immunoblotanalyse for å bekrefte berikelsen av biotinylertproteiner og blits fryse resten av prøven som skal lagres på minus 80 grader Celsius. Vestlige flekker ble brukt til å analysere proteinuttrykk og biotinylering i de agroinfiltrerte N.benthamiana bladene. De biotinylererte proteinene i de infiltrerte bladene ble effektivt beriket med streptavidin C1 konjugerte magnetiske perler for påfølgende massespektrometrianalyse.Ulike proteiner med varierte størrelser ble fanget og vestlig flekkanalyse av de berikede proteinene viste smurte bånd. Når du prøver denne prosedyren, må du huske å fjerne sealeren nederst på avsaltingskolonnen og løsne hettene før hver sentrifugering. Denne protokollen er lett tilpasningsdyktig til andre proteiner av interesse for Nicotiana benthamiana og kan også brukes til å utvide TurboID PL i andre plantearter.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

En komparativ tilnærming til preger landskapet av Host-patogenfrie Protein-protein interaksjoner

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Analyser for identifisering av nye antivirale midler mot blåtungevirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Rapid Identifikasjon av gramnegative bakterier fra blodkultur buljong Bruke MALDI-TOF massespektrometri

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolasjon, Identifikasjon, og rensing av Muse thymisk Epitelceller

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Identifikasjon av Plasmodesmal lokalisering sekvenser i proteiner i Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identifikasjon av virulens markører av Mycobacterium abscessus for intracellulær replikering i Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...