Name: turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks
Uploaded: 2020-05-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por subsídios do Programa Nacional de Ciência e Tecnologia Transgênica (2019ZX08010-003 para Y.Z.), da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31872637 para Y.Z.), e dos Fundos De Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (2019TC028 a Y.Z.), e NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185 e NIH-GM132582-01 para S.P.D.K.

NOTA: Uma visão geral do método é mostrada na Figura 1.
1. Preparação do material vegetal
<ol><li>Cultivar sementes N. benthamiana em solo úmido em alta densidade e mantê-las em uma câmara climática com uma luz de 16 horas (cerca de 75 μmol/m2s) e 8 h de fotoperíodo escuro a 23-25 °C.</li>
	<li>Cerca de 1 semana depois, transfira cuidadosamente cada muda jovem para potes de 4' x 4' e mantenha as mudas na mesma câmara...

<ol>
	<li>Bergg&#229;rd, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li><li>Kim, D. I., Roux, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+void:+proximity-based+labeling+of+proteins+in+living+cells.">Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells.</a> Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).</li><li>Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+interacting+proteins:+Application+of+BioID+as+a+discovery+tool.">Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells.">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nuclear+pore+complex+architecture+with+proximity-dependent+biotinylation.">Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).</li><li>Lin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+proximal+and+interacting+proteins+in+rice+protoplasts+by+proximity-dependent+biotinylation.">Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).</li><li>Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+proximity+dependent+biotin+identification+(BioID).">In planta proximity dependent biotin identification (BioID).</a> Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).</li><li>Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+in+planta+BioID+system+as+a+probe+for+plasma+membrane-associated+immunity+proteins.">Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins.</a> Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).</li><li>Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-dependent+biotinylation+screening+identifies+NbHYPK+as+a+novel+interacting+partner+of+ATG8+in+plants.">Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants.</a> BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).</li><li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID.">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurboID-based+proximity+labeling+reveals+that+UBR7+is+a+regulator+of+N+NLR+immune+receptor-mediated+immunity.">TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity.</a> Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).</li><li>Arora, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+proximity-dependent+biotinylation+approaches+in+different+plant+model+systems.">Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+TurboID-mediated+proximity+labeling+for+mapping+a+GSK3+kinase+signaling+network+in+Arabidopsis.">Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+protein+complexes+and+cell-type-specific+organellar+proteomes+in+Arabidopsis+enabled+by+TurboID.">Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID.</a> eLife. 8, 47864 (2019).</li><li>Yuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Barley+stripe+mosaic+virus+vector+for+virus+induced+gene+silencing+in+monocots+and+dicots.">A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots.</a> PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).</li><li>McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+production+of+highly+competent+cells+of+Agrobacterium+for+transformation+via+electroporation.">A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation.</a> Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).</li><li>Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+know+the+neighborhood:+using+proximity-dependent+biotinylation+to+characterize+protein+complexes+and+map+organelles.">Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).</li><li>Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Interactions+among+centrosome+components+identify+regulators+of+centriole+duplication.">Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication.</a> Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+pH+in+the+Arabidopsis+endomembrane+system.">Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system.</a> Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).</li><li>Bally, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+rise+of+Nicotiana+benthamiana:+a+plant+for+all+reasons.">The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons.</a> Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).</li></ol>

A ligase de biotina TurboID é gerada pela evolução direcionada baseada em levedura do BioID10. Tem muitas vantagens sobre outras enzimas PL. TurboID permite a aplicação de PL em outros sistemas modelo, incluindo moscas e vermes, cuja temperatura de crescimento ideal é de cerca de 25 °C10. Embora a abordagem pl tenha sido amplamente utilizada em sistemas animais, sua aplicação em plantas é limitada. O protocolo descrito aqui fornece um procedimento passo-a-passo pa...

Os PPIs são a base de vários processos celulares. Os métodos tradicionais de identificação de PPIs incluem triagem de leveduras-dois híbridos (Y2H) e imunoprecipitação juntamente com espectrometria de massa (IP-MS)1. No entanto, ambos sofrem de algumas desvantagens. Por exemplo, a triagem Y2H requer a disponibilidade da biblioteca Y2H da espécie de planta-alvo ou animal. A construção dessas bibliotecas é trabalhosa e cara. Além disso, a abordagem Y2H é realizada na levedura heteróloga do organismo eucaótico unicelular, que pode não representar o status celular de células eucaóticas mais altas.
Em contraste, o IP-MS mostra baixa eficiência na captura de PPIs transitórios ou fracos, e também é inadequado para aquelas proteínas com baixa abundância ou alta hidrofobicidade. Muitas proteínas importantes envolvidas nas vias de sinalização vegetal, como quinases semelhantes a receptores (RLKs) ou a família NLR de receptores imunológicos são expressas em níveis baixos e frequentemente interagem com outras proteínas transitoriamente. Por isso, restringe muito a compreensão dos mecanismos subjacentes à regulação dessas proteínas.
Recentemente, métodos de rotulagem de proximidade (PL) baseados em ascorbate peroxidase (APEX) e um mutante Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (conhecido como BioID) foram desenvolvidos e utilizados para o estudo de PPIs2,3,4. O princípio da PL é que uma proteína de interesse alvo é fundida com uma enzima, que catalisa a formação de biotinyl-AMP labile (bio-AMP). Estes bio-AMP livres são liberados por enzimas PL e difusos para a proximidade da proteína alvo, permitindo a biotinylação de proteínas proximais nas aminas primárias dentro de um raio estimado de 10 nm5.
Essa abordagem tem vantagens significativas em relação às abordagens tradicionais Y2H e IP-MS, como a capacidade de capturar PPIs transitórios ou fracos. Além disso, o PL permite a rotulagem de proteínas proximais da proteína alvo em seus ambientes celulares nativos. Diferentes enzimas PL têm desvantagens únicas ao aplicá-las em diferentes sistemas. Por exemplo, embora a APEX ofereça cinética de marcação mais alta em comparação com o BioID e seja aplicada com sucesso em sistemas de mamíferos, a exigência de peróxido de hidrogênio tóxico (H2O2) nesta abordagem torna-o inadequado para estudos de PL em plantas.
Em contraste, o PL baseado em BioID evita o uso do Tóxico H2O2, mas a taxa de rotulagem é lenta (exigindo 18-24 h para completar a biotinylação), tornando assim a captura de PPIs transitórios menos eficiente. Além disso, a maior temperatura de incubação (37 °C) necessária para um PL eficiente pelo BioID introduz estresse externo a alguns organismos, como plantas4. Portanto, a implantação limitada de PL baseado em BioID em plantas (ou seja, protoplastos de arroz, Arabidopsis e N. benthamiana) foi relatada6,7,8,9. A enzima TurboID recentemente descrita supera as deficiências do PL. Turbo. TurboID, baseado em APEX e BioID, mostrou alta atividade que permite a realização de PL dentro de 10 min na RT10. O PL baseado em TurboID foi aplicado com sucesso em células, moscas e vermes10. Recentemente, nós e outros grupos de pesquisa otimizamos e ampliamos independentemente o uso de PL baseado em TurboID para estudar PPIs em diferentes sistemas vegetais, incluindo plantas n. benthamiana e arabidopsis e raízes peludas de tomate11,12,13,14. Análises comparativas indicaram que o TurboID tem melhor desempenho para pl em plantas em comparação com o BioID11,14. Também demonstrou a robustez do PL baseado em TurboID na planta, identificando uma série de novas interações com um receptor imunológico NLR11, uma proteína cujos parceiros de interação são geralmente difíceis de obter usando métodos tradicionais.
Este protocolo ilustra o PL baseado em TurboID na planta, descrevendo a identificação de proteínas de interação do domínio N-terminal TIR do receptor imunológico NLR em plantas n. benthamiana. O método pode ser estendido a quaisquer proteínas de interesse em N. benthamiana. Mais importante, fornece uma referência importante para investigar PPIs em outras espécies vegetais, como Arabidopsis,tomate e outras.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>721 Spectrophotometer</td>
			<td>Metash, made in China</td>
			<td>Q/SXFZ6</td>
			<td>For OD600 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639-1G</td>
			<td>50 mM Stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td>For affinity purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Costar 3590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>For Western blot analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride solution(LiCl), 8M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Zonkia, made in China</td>
			<td>KDC-2046</td>
			<td>For desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123.21D</td>
			<td>For bead adsorption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N07710</td>
			<td>For OD595 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 (IGEPAL CA-630)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-HA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotational mixer</td>
			<td>Kylin-Bell Lab Instrument</td>
			<td>WH-986</td>
			<td>For IP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shock incubator</td>
			<td>Labotery, made in China</td>
			<td>ZQPZ-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate(SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4390-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G-560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-jacket Incubator</td>
			<td>Blue pard, made in China</td>
			<td>GHP-9080</td>
			<td>For Agrobacterium incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89893</td>
			<td>For removal of biotin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks

Técnicas de rotulagem de proximidade (PL) utilizando ascorbate peroxidase (APEX) ou Escherichia coli biotin ligase BirA (conhecida como BioID) têm sido usadas com sucesso para identificação de interações proteína-proteína (PPIs) em células de mamíferos. No entanto, os requisitos de peróxido de hidrogênio tóxico (H2O2) em PL baseado em APEX, maior tempo de incubação com biotina (16-24 h) e maior temperatura de incubação (37 °C) em PL baseado em BioID limitam severamente suas aplicações em plantas. O PL baseado em TurboID recentemente descrito aborda muitas limitações do BioID e do APEX. TurboID permite rotulagem rápida de proximidade de proteínas em apenas 10 min sob condições de temperatura ambiente (RT). Embora a utilidade do TurboID tenha sido demonstrada em modelos animais, recentemente mostramos que o PL baseado em TurboID tem melhor desempenho em plantas em comparação com o BioID para rotulagem de proteínas que são proximais a uma proteína de interesse. Desde que aqui esteja um protocolo passo-a-passo para a identificação de parceiros de interação proteica usando o domínio n-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) da família de proteínas de nucleotídeo-binding leucina-rich repeat (NLR) como modelo. O método descreve construção vetorial, agroinfiltração de construtos de expressão proteica, tratamento de biotina, extração e dessalização de proteínas, quantificação e enriquecimento das proteínas biotinylated por purificação de afinidade. O protocolo descrito aqui pode ser facilmente adaptado para estudar outras proteínas de interesse em Nicotiana e outras espécies vegetais.

Os dados representativos, que ilustram os resultados esperados com base no protocolo descrito, são adaptados de Zhang et al11. A Figura 1 resume os procedimentos para a realização de PL baseado em TurboID em N. benthamiana. A Figura 2 mostra a expressão proteica e biotinylation nas folhas de N. benthamiana infiltradas. A Figura 3 mostra que as proteínas biotinyladas nas folhas infiltrad...

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TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Descrito aqui é um método de rotulagem de proximidade para identificação de parceiros de interação do domínio TIR do receptor imunológico NLR no tecido da folha Nicotiana benthamiana. Também é fornecido um protocolo detalhado para a identificação de interações entre outras proteínas de interesse utilizando essa técnica em Nicotiana e outras espécies vegetais.

Rotulagem de proximidade baseada em turboid para identificação na planta de redes de interação proteína-proteína

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been ...

Os receptores imunológicos NLR desempenham um papel crucial na mediação da defesa vegetal contra vários patógenos. Descrevemos um método de rotulagem de proximidade baseado em TurboID para a identificação de parceiros de interação do domínio receptor Toll/interleukin-1 contendo NLRs, como receptores imunológicos em plantas nicotiana benthamiana. Este protocolo fornece uma referência importante para investigar interações proteína-proteína em outras espécies vegetais e pode ser estendido a qualquer proteína de interesse em Nicotiana benthamiana.A abordagem de rotulagem de proximidade baseada em TurboID tem uma vantagem distinta sobre as abordagens tradicionais porque pode ser usada para capturar interações transitórias ou fracas proteína-proteína in vivo. Comece cultivando sementes de N.benthamiana em solo molhado em alta densidade. Mantenha-os em uma câmara climática com uma luz de 18 horas e oito horas de foto escura a 23 a 25 graus Celsius.Mantenha as plantas na câmara por cerca de quatro semanas até que elas cresçam para uma fase de folha de quatro a oito para a agroinfiltração subsequente. Construa fusões TurboID e transforme os plasmídeos em células competentes de Agrobacterium, conforme descrito no protocolo de texto. Use uma seringa sem agulha de um mililitro para se infiltrar no inóculo da epiderme abaxial das folhas n.benthamiana totalmente maduras.Às 36 horas após a filtragem, infiltre 200 biotinas micromolar nas folhas e mantenha a planta por mais três a 12 horas antes de colher o tecido da folha. Para coletar a amostra da folha, corte as folhas infiltradas na base da petiole, remova a veia da folha e congele o tecido em nitrogênio líquido. Triture o tecido da folha com um pilão e argamassa e armazene o pó em tubos Falcon de 15 ou 50 mililitros a menos 80 graus Celsius.Para extrair a proteína total, transfira cerca de 0,35 gramas de pó de folha para um tubo de dois mililitros. Certifique-se de manter o tecido em baixa temperatura no nitrogênio líquido durante este processo. Adicione 700 microliters de tampão de lise RIPA ao pó.Vórtice do tubo por 10 minutos e deixe a amostra no gelo por 30 minutos, misturando o conteúdo a cada quatro a cinco minutos invertendo os tubos. Centrifugar os tubos a 20.000 vezes g a quatro graus Celsius por 10 minutos. Então pegue o supernatante.Remova a biotina livre executando a amostra através de uma coluna de desalamento. Remova o selador na parte inferior da coluna e coloque-o em um tubo de 50 mililitros. Em seguida, solte a tampa e centrifugar a coluna a 1.000 vezes g e quatro graus Celsius por dois minutos.Coloque a coluna de desalização em um tubo fresco de 50 mililitros e equilibre a coluna três vezes com cinco mililitros de tampão de lise RIPA. Centrifuá-lo a 1.000 vezes g e quatro graus Celsius por dois minutos e descartar o fluxo de cada vez. Adicione 1,5 mililitros de extrato de proteína ao topo da resina na coluna equilibrada.E quando o extrato entrar na resina, adicione mais 100 microliters de tampão de lise RIPA. Centrifugar a coluna por dois minutos e deixar as amostras desaladas no gelo até que usem mais. Para quantificar os extratos de proteínas salgadas, meça o OD595 usando um espectrômetro Bio-Rad.Desenhe a curva padrão com base no valor da solução BSA gradiente e calcule a concentração das amostras de proteínas desseladas. Equilibre as contas magnéticas conjugadas streptavidin C1 com um mililitro de tampão de lise RIPA por um minuto a temperatura ambiente. Use o rack magnético para absorver as contas por três minutos e aspirar suavemente a solução.Em seguida, repita a lavagem mais uma vez. Transfira o extrato de proteína para as contas magnéticas equilibradas e incubar o tubo a quatro graus Celsius durante a noite em um rotador para a afinidade purificar as proteínas. No dia seguinte, capture as contas com um rack magnético e aspire o supernatante.Em seguida, lave as contas com 1,7 mililitros de tampão de lavagem um, adicionando-o ao tubo e incubando-as no rotor por oito minutos. Remova o supernatante como descrito anteriormente e repita a lavagem com 1,7 mililitros de tampão de lavagem dois e lave o tampão três. Adicione 1,7 mililitros de 50 mililitros Tris HCL para remover o detergente.Em seguida, coloque o tubo no rack magnético e remova o sobrenatário. Repita a lavagem com um mililitro de 50 mililitros Tris HCL e transfira as contas para um novo tubo de 1,5 mililitro. Por fim, lave as contas seis vezes com 50 mililitros de tampão de bicarbonato de amônio por cinco minutos por lavagem.Use 100 microliters de contas para análise de imunoblot para confirmar o enriquecimento das proteínas biotiniladas e congelar o resto da amostra a ser armazenada a menos 80 graus Celsius. Manchas ocidentais foram utilizadas para analisar expressão proteica e biotinilação nas folhas de N.benthamiana agroinfiladas. As proteínas biotiniladas nas folhas infiltradas foram eficientemente enriquecidas com contas magnéticas conjugadas streptavidin C1 para análise subsequente de espectrometria de massa.Diferentes proteínas com tamanhos variados foram capturadas e a análise ocidental das proteínas enriquecidas mostrou bandas manchadas. Ao tentar este procedimento, lembre-se de remover o selador na parte inferior da coluna de desalagem e afrouxar as tampas antes de cada centrifugação. Este protocolo é facilmente adaptável a outras proteínas de interesse em Nicotiana benthamiana e também pode ser usado para estender o TurboID PL em outras espécies vegetais.

Research

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Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Ensaios para a identificação de novos antivirais contra a febre catarral ovina vírus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Rápida identificação de bactérias gram-negativas de Sangue Cultura Caldo Usando MALDI-TOF Espectrometria de Massa

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo murino

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Identificação de sequências de localização Plasmodesmal em proteínas em Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identificação de marcadores de virulência de Mycobacterium abscessus para replicação intracelular em fagócitos

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...