Name: turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks
Uploaded: 2020-05-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами От Национальной трансгенной научно-технической программы (2019-X08010-003 до Y.З.), Национального фонда естественных наук Китая (31872637 до Y.З.), а также фундаментальных научно-исследовательских фондов для центральных университетов (2019TC028 к Y.) и NSF-IOS-13544444, NSF-IOS-1339185, и NIH-GM132582-01 до S.P.D.K.

ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор метода показан на рисунке 1.
1. Подготовка материала завода
<ol><li>Выращивайте семена N. benthamiana во влажной почве при высокой плотности и поддерживайте их в климатической камере с 16 ч светом (около 75 моль/м2с) и 8 ч темным фотоп...

<ol>
	<li>Bergg&#229;rd, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li><li>Kim, D. I., Roux, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+void:+proximity-based+labeling+of+proteins+in+living+cells.">Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells.</a> Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).</li><li>Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+interacting+proteins:+Application+of+BioID+as+a+discovery+tool.">Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells.">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nuclear+pore+complex+architecture+with+proximity-dependent+biotinylation.">Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).</li><li>Lin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+proximal+and+interacting+proteins+in+rice+protoplasts+by+proximity-dependent+biotinylation.">Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).</li><li>Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+proximity+dependent+biotin+identification+(BioID).">In planta proximity dependent biotin identification (BioID).</a> Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).</li><li>Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+in+planta+BioID+system+as+a+probe+for+plasma+membrane-associated+immunity+proteins.">Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins.</a> Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).</li><li>Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-dependent+biotinylation+screening+identifies+NbHYPK+as+a+novel+interacting+partner+of+ATG8+in+plants.">Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants.</a> BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).</li><li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID.">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurboID-based+proximity+labeling+reveals+that+UBR7+is+a+regulator+of+N+NLR+immune+receptor-mediated+immunity.">TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity.</a> Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).</li><li>Arora, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+proximity-dependent+biotinylation+approaches+in+different+plant+model+systems.">Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+TurboID-mediated+proximity+labeling+for+mapping+a+GSK3+kinase+signaling+network+in+Arabidopsis.">Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+protein+complexes+and+cell-type-specific+organellar+proteomes+in+Arabidopsis+enabled+by+TurboID.">Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID.</a> eLife. 8, 47864 (2019).</li><li>Yuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Barley+stripe+mosaic+virus+vector+for+virus+induced+gene+silencing+in+monocots+and+dicots.">A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots.</a> PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).</li><li>McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+production+of+highly+competent+cells+of+Agrobacterium+for+transformation+via+electroporation.">A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation.</a> Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).</li><li>Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+know+the+neighborhood:+using+proximity-dependent+biotinylation+to+characterize+protein+complexes+and+map+organelles.">Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).</li><li>Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Interactions+among+centrosome+components+identify+regulators+of+centriole+duplication.">Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication.</a> Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+pH+in+the+Arabidopsis+endomembrane+system.">Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system.</a> Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).</li><li>Bally, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+rise+of+Nicotiana+benthamiana:+a+plant+for+all+reasons.">The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons.</a> Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).</li></ol>

TurboID биотин лигаза генерируется дрожжей дисплей основе направленной эволюции BioID10. Он имеет много преимуществ по сравнению с другими ферментами PL. TurboID позволяет применять PL к другим модельным системам, включая мух и червей, оптимальная температура роста которых составляе?...

ИЦП являются основой различных клеточных процессов. Традиционные методы выявления ИЦП включают скрининг дрожжей-двух гибридов (Y2H) и иммунопрецитивввву в сочетании с масс-спектрометрией (IP-MS)1. Тем не менее, оба страдают от некоторых недостатков. Например, скрининг на 200 00 лет требует наличия библиотеки 2000-х растений-мишеней или видов животных. Строительство этих библиотек является трудоемким и дорогостоящим. Кроме того, подход Y2H осуществляется в гетерологических одноклеточных дрожжах эукариотического организма, которые не могут представлять клеточный статус высших эукариотических клеток.
В отличие от этого, IP-MS показывает низкую эффективность в захвате переходных или слабых ИЦП, и это также не подходит для тех белков с низким изобилием или высокой гидрофобичностью. Многие важные белки, участвующие в растительной сигнальных путей, таких как рецептороподобные киназы (RLKs) или NLR семьи иммунных рецепторов выражаются на низких уровнях и часто взаимодействуют с другими белками переходно. Таким образом, это значительно ограничивает понимание механизмов, лежащих в основе регулирования этих белков.
В последнее время методы маркировки близости (PL) на основе инженерных аскорбат перекиснида (APEX) и мутант Escherichia coli биотина ligase BirAR118G (известный как BioID) были разработаны и использованы для изучения ИЦП2,3,4. Принцип PL заключается в том, что интересуемый целевой белок сливается с ферментом, который катализает образование лабийского биотинила-AMP (био-AMP). Эти бесплатные био-AMP высвобождаются ферментами PL и диффундируют в непосредственной близости от целевого белка, что позволяет биотиниляцию проксимальных белков в первичных аминах в пределах предполагаемого радиуса 10 нм5.
Этот подход имеет значительные преимущества по сравнению с традиционными подходами Y2H и IP-MS, такими как способность фиксировать переходные или слабые ИЦП. Кроме того, PL позволяет маркировки проксимальных белков целевого белка в их родной клеточной среде. Различные ферменты PL имеют уникальные недостатки при применении их к различным системам. Например, хотя APEX предлагает более высокую пометку кинетики по сравнению с BioID и успешно применяется в системах млекопитающих, требование токсичного перекиси водорода (H2O2) в этом подходе делает его непригодным для исследований PL в растениях.
В отличие от этого, BioID основе PL избегает использования токсичных H2O2, но скорость маркировки медленно (требуя 18-24 ч для завершения биотинилаации), что делает захват переходных ИЦП менее эффективным. Кроме того, более высокая температура инкубации (37 градусов по Цельсию), необходимая для эффективного Pl by BioID, вводит внешний стресс для некоторых организмов, таких как растения4. Таким образом, ограниченное развертывание BioID основе PL в растениях (т.е. рис протопластов, arabidopsis, и Н. benthamiana) было сообщено6,,7,8,9. Недавно описанный фермент TurboID преодолевает недостатки APEX и BioID на основе PL. TurboID показал высокую активность, которая позволяет достижение PL в течение 10 минут на RT10. TurboID основе PL была успешно применена в клетках млекопитающих, мух, и червей10. Недавно мы и другие исследовательские группы независимо оптимизировали и расширили использование TurboID на основе PL для изучения ИЦП в различных системах растений, в том числе Н. бентамиана и Арабидопсис растений и томатные волосатые корни11,12,13,14. Сравнительный анализ показал, что TurboID работает лучше для PL в растениях по сравнению с BioID11,14. Он также продемонстрировал надежность TurboID основе PL в плантиве, определив ряд новых взаимодействий с иммунным рецептором NLR11, белок, взаимодействие партнеров которого, как правило, трудно получить с помощью традиционных методов.
Этот протокол иллюстрирует TurboID основе PL в плану, описывая определение взаимодействия белков N-терминала TIR домена NLR иммунного рецептора в N. benthamiana растений. Метод может быть распространен на любые белки, представляющие интерес у N. benthamiana. Что еще более важно, он обеспечивает важную ссылку для исследования ИЦП в других видов растений, таких как Arabidopsis, помидоры, и другие.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>721 Spectrophotometer</td>
			<td>Metash, made in China</td>
			<td>Q/SXFZ6</td>
			<td>For OD600 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639-1G</td>
			<td>50 mM Stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td>For affinity purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Costar 3590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>For Western blot analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride solution(LiCl), 8M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Zonkia, made in China</td>
			<td>KDC-2046</td>
			<td>For desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123.21D</td>
			<td>For bead adsorption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N07710</td>
			<td>For OD595 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 (IGEPAL CA-630)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-HA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotational mixer</td>
			<td>Kylin-Bell Lab Instrument</td>
			<td>WH-986</td>
			<td>For IP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shock incubator</td>
			<td>Labotery, made in China</td>
			<td>ZQPZ-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate(SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4390-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G-560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-jacket Incubator</td>
			<td>Blue pard, made in China</td>
			<td>GHP-9080</td>
			<td>For Agrobacterium incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89893</td>
			<td>For removal of biotin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks

Методы маркировки близости (PL) с использованием сконструированного аскорбата пероксидаза (APEX) или Escherichia coli biotin ligase BirA (известный как BioID) были успешно использованы для идентификации белково-белковых взаимодействий (PPIs) в клетках млекопитающих. Тем не менее, требования токсичной перекиси водорода (H2O2) в APEX основе PL, больше времени инкубации с биотином (16-24 ч), и более высокая температура инкубации (37 градусов по Цельсию) в BioID основе PL серьезно ограничить их применение в растениях. Недавно описанный TurboID основе PL рассматриваются многие ограничения BioID и APEX. TurboID позволяет быстро маркировать близость белков всего за 10 минут при комнатной температуре (RT). Хотя полезность TurboID была продемонстрирована в животных моделях, мы недавно показали, что TurboID основе PL работает лучше в растениях по сравнению с BioID для маркировки белков, которые проксимальны для белка интерес. Приведенный здесь пошаговый протокол для идентификации партнеров взаимодействия протеина используя N-терминальный Toll/interleukin-1 пренициальное устройство (TIR) домена нуклеотид-связывающего лейцина-богатого повтора (NLR) протеинового семейства (NLR) в качестве модели. Метод описывает векторную конструкцию, агроининсредуификацию конструкций экспрессии белка, лечение биотином, экстракцию белка и опреснение, количественную оценку и обогащение биотинилатированных белков сродством очищения. Описанный здесь протокол может быть легко адаптирован для изучения других белков, представляющих интерес у Никотинианы и других видов растений.

Репрезентативные данные, иллюстрирующие ожидаемые результаты, основанные на описанном протоколе, адаптированы из «Чжан идр.11». Рисунок 1 обобщает процедуры выполнения TurboID на основе PL в Н. benthamiana. На рисунке 2 показано выражение белка и б...

Watch this Scientific Journal Video about TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks at JoVE.com

TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Описано здесь метод маркировки близости для идентификации партнеров взаимодействия области TIR иммунного рецептора NLR в ткани листьев Nicotiana benthamiana. Также предусмотрен подробный протокол для выявления взаимодействий между другими белками, представляющими интерес с использованием этой техники в Никотина и других видов растений.

TurboID-на основе Близость маркировки для в Planta идентификации белково-белковых взаимодействий сетей

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been ...

Иммунные рецепторы NLR играют решающую роль в посредничестве защиты растений от различных патогенов. Мы описываем метод маркировки близости на основе TurboID для идентификации партнеров по взаимодействию домена рецепторов Toll/interleukin-1, содержащего НЛР, таких как иммунные рецепторы в растениях Nicotiana benthamiana. Этот протокол обеспечивает важную ссылку для изучения белково-белковых взаимодействий в других видах растений и может быть распространен на любой белок, представляющий интерес в Никотиана бентамиана.Подход к маркировке близости на основе TurboID имеет явное преимущество перед традиционными подходами, поскольку он может быть использован для захвата переходных или слабых белково-белковых взаимодействий in vivo. Начните с выращивания семян N.benthamiana во влажной почве при высокой плотности. Поддерживайте их в климатической камере с 18-часовым светом и восьмичасовым темным фото периодом при 23-25 градусах Цельсия.Держите растения в камере около четырех недель, пока они не вырастут до стадии листа от четырех до восьми для последующей агроинфильтрации. Построить TurboID слияний и превратить плазмиды в Agrobacterium tumefaciens компетентных клеток, как описано в текстовом протоколе. Используйте один миллилитр без иглы шприц, чтобы проникнуть в инокулум абаксиального эпидермиса полностью зрелых листьев N.benthamiana.В 36 часов после фильтрации, проникнуть 200 микромоляных биотина в листья и поддерживать растение в течение еще трех-12 часов до сбора листьев ткани. Чтобы собрать образец листа, вырезать проникли листья у основания петиола, удалить вены листьев, и вспышки заморозить ткани в жидком азоте. Измельчить ткани листьев с пестиком и раствором и хранить порошок в 15 или 50 миллилитров Сокол трубки при температуре минус 80 градусов по Цельсию.Чтобы извлечь общий белок, перенесите около 0,35 грамма листового порошка в двухми миллилитровую трубку. Будьте уверены, чтобы поддерживать ткани при низкой температуре в жидком азоте во время этого процесса. Добавьте в порошок 700 микролитров буфера лиза RIPA.Вихрь трубки в течение 10 минут и оставить образец на льду в течение 30 минут, смешивая содержимое каждые четыре-пять минут путем инвертирования труб. Центрифуга труб при 20 000 раз г при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Тогда соберите супернатант.Удалите бесплатный биотин, запуская образец через столбец опреснив. Удалите герметику в нижней части колонны и поместите его в 50 миллилитровую трубку. Затем ослабьте крышку и центрифугу колонки в 1000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение двух минут.Поместите опресняемую колонку в свежую 50-миллилитровую трубку и трижды уравновесите столбец пятью миллилитров буфера лиза RIPA. Центрифуга его на 1000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение двух минут и отказаться от потока через каждый раз. Добавьте 1,5 миллилитров белкового экстракта в верхнюю часть смолы в равноовесной колонке.А когда экстракт попадает в смолу, добавьте еще 100 микролитров буфера лиза RIPA. Центрифуга колонны на две минуты и оставить опресненные образцы на льду до дальнейшего использования. Для количественной оценки экстрактов белка, измерить OD595 с помощью био-рад спектрофотометр.Нарисуйте стандартную кривую на основе значения градиентного раствора BSA и рассчитайте концентрацию опресненные образцы белка. Эквилибрировать стрептавидин C1 конъюгированных магнитных бусин с одним миллилитром буфера лиза RIPA в течение одной минуты при комнатной температуре. Используйте магнитную стойку, чтобы поглотить бисер в течение трех минут и аккуратно аспирировать раствор.Затем повторите мыть еще раз. Передача экстракта белка в уравновешенные магнитные бусы и инкубировать трубку при четырех градусах по Цельсию на ночь на ротаторе, чтобы сродство очистить белки. На следующий день, захватить бисер с магнитной стойкой и аспирировать супернатант.Затем вымойте шарики с 1,7 миллилитров буфера мыть один, добавив его в трубку и инкубировать его на роторе в течение восьми минут. Удалите супернатант, как описано ранее, и повторите стирку с 1,7 миллилитров буфера мытья два и мыть буфер три. Добавьте 1,7 миллилитров 50 миллимолярной Tris HCL для удаления моющего средства.Затем поместите трубку на магнитную стойку и удалите супернатант. Повторите стирку с одним миллилитром 50 миллимолейных Tris HCL и перенесите шарики в новую 1,5 миллилитровую трубку. Наконец, мыть бисер шесть раз с 50 миллимолярия аммония бикарбонат буфера в течение пяти минут за стирку.Используйте 100 микролитров бисера для иммуноблотного анализа, чтобы подтвердить обогащение биотинилированных белков и флэш-заморозку остальной части образца, который будет храниться при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Западные помарки были использованы для анализа экспрессии белка и биотинилирования в агроинфильтрированных листьях N.benthamiana. Биотинилированные белки в инфильтрированных листьях эффективно обогащались стрептавидином C1, конъюгированными магнитными бусинами для последующего анализа масс-спектрометрии.Различные белки с различными размерами были захвачены и западный анализ пятно обогащенных белков показали смазаны полос. При попытке этой процедуры, пожалуйста, не забудьте удалить уплотнитель в нижней части опреснения столбца и ослабить крышки перед каждой центрифугации. Этот протокол легко адаптируется к другим белкам, представляющим интерес в Nicotiana benthamiana, а также может быть использован для расширения TurboID PL в других видах растений.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

Частица Агглютинация Метод Полиовирус Идентификация

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Пройдя Host-вирус Взаимодействие в Литические репликации Модель Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Визуализация вируса денге через Alexa Fluor маркировки

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

Метод маркировки сосудистую в эмбриональных мышей

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Сравнительный подход к характеризации Пейзаж хозяин-патоген белок-белковых взаимодействий

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Анализы для идентификации новых видов Antivirals против вируса катаральной лихорадки овец

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Быстрое выявление грамотрицательных бактерий из крови культуральной жидкости Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Выделение, идентификация, и очистка мышиного тимуса эпителиальных клеток

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Выявление Plasmodesmal локализации последовательностей белков в Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Определение маркеров вирулентность микобактерий abscessus для внутриклеточного репликации в фагоцитов

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...