Name: turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks
Uploaded: 2020-05-17T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa Nacional de Ciencia y Tecnología Transgénica (2019ZX08010-003 a Y.Z.), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31872637 a Y.Z.), y los Fondos Fundamentales de Investigación para las Universidades Centrales (2019TC028 a Y.Z.), y NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185, y NIH-GM132582-01 a S.P.D.K.

NOTA: En la Figura 1se muestra una descripción general del método.
1. Preparación de materiales vegetales
<ol><li>Cultivar semillas de N. benthamiana en suelo húmedo a alta densidad y mantenerlas en una cámara climática con una luz de 16 h (alrededor de 75 omol/m2s) y fotoperiodo oscuro de 8 h a 23-25 oC.</li>
	<li>Aproximadamente 1 semana más tarde, transfiera cuidadosamente cada plántula joven a ollas de 4' x 4' y mante...

<ol>
	<li>Bergg&#229;rd, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li><li>Kim, D. I., Roux, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+void:+proximity-based+labeling+of+proteins+in+living+cells.">Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells.</a> Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).</li><li>Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+interacting+proteins:+Application+of+BioID+as+a+discovery+tool.">Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells.">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nuclear+pore+complex+architecture+with+proximity-dependent+biotinylation.">Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).</li><li>Lin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+proximal+and+interacting+proteins+in+rice+protoplasts+by+proximity-dependent+biotinylation.">Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).</li><li>Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+proximity+dependent+biotin+identification+(BioID).">In planta proximity dependent biotin identification (BioID).</a> Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).</li><li>Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+in+planta+BioID+system+as+a+probe+for+plasma+membrane-associated+immunity+proteins.">Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins.</a> Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).</li><li>Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-dependent+biotinylation+screening+identifies+NbHYPK+as+a+novel+interacting+partner+of+ATG8+in+plants.">Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants.</a> BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).</li><li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID.">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurboID-based+proximity+labeling+reveals+that+UBR7+is+a+regulator+of+N+NLR+immune+receptor-mediated+immunity.">TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity.</a> Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).</li><li>Arora, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+proximity-dependent+biotinylation+approaches+in+different+plant+model+systems.">Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+TurboID-mediated+proximity+labeling+for+mapping+a+GSK3+kinase+signaling+network+in+Arabidopsis.">Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+protein+complexes+and+cell-type-specific+organellar+proteomes+in+Arabidopsis+enabled+by+TurboID.">Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID.</a> eLife. 8, 47864 (2019).</li><li>Yuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Barley+stripe+mosaic+virus+vector+for+virus+induced+gene+silencing+in+monocots+and+dicots.">A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots.</a> PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).</li><li>McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+production+of+highly+competent+cells+of+Agrobacterium+for+transformation+via+electroporation.">A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation.</a> Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).</li><li>Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+know+the+neighborhood:+using+proximity-dependent+biotinylation+to+characterize+protein+complexes+and+map+organelles.">Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).</li><li>Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Interactions+among+centrosome+components+identify+regulators+of+centriole+duplication.">Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication.</a> Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+pH+in+the+Arabidopsis+endomembrane+system.">Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system.</a> Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).</li><li>Bally, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+rise+of+Nicotiana+benthamiana:+a+plant+for+all+reasons.">The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons.</a> Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).</li></ol>

La ligaa de biotina TurboID es generada por la evolución dirigida basada en la visualización de levaduras del BioID10. Tiene muchas ventajas sobre otras enzimas PL. TurboID permite la aplicación de PL a otros sistemas de modelos, incluyendo moscas y gusanos, cuya temperatura óptima de crecimiento es de alrededor de 25 oC10. Aunque el enfoque PL ha sido ampliamente utilizado en sistemas animales, su aplicación en plantas es limitada. El protocolo descrito aquí proporci...

Los IBP son la base de varios procesos celulares. Los métodos tradicionales para identificar los IBP incluyen el cribado de levadura-dos híbridos (Y2H) y la inmunoprecipitación junto con espectrometría de masas (IP-MS)1. Sin embargo, ambos sufren de algunas desventajas. Por ejemplo, el cribado De2H requiere la disponibilidad de la biblioteca Y2H de las especies vegetales o animales objetivo. La construcción de estas bibliotecas es costosa y laboriosa. Además, el enfoque Y2H se realiza en la levadura de organismo eucariota de una sola célula heteróloga, que puede no representar el estado celular de las células eucariotas superiores.
Por el contrario, IP-MS muestra baja eficiencia en la captura de IBP transitorios o débiles, y también es inadecuado para aquellas proteínas con baja abundancia o alta hidrofobicidad. Muchas proteínas importantes implicadas en las vías de señalización de la planta como las quinasas similares a los receptores (RK) o la familia NLR de receptores inmunes se expresan en niveles bajos y a menudo interactúan con otras proteínas de forma transitoria. Por lo tanto, restringe en gran medida la comprensión de los mecanismos subyacentes a la regulación de estas proteínas.
Recientemente, se han desarrollado y utilizado métodos de etiquetado de proximidad (PL) basados en ascorbato peroxidasa (APEX) y un mutante Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (conocido como BioID) para el estudio de los IBP2,,3,4. El principio de PL es que una proteína objetivo de interés se fusiona con una enzima, que cataliza la formación de biotinyl-AMP de lábil (bio-AMP). Estos bio-AMP libres son liberados por las enzimas PL y difuminados a la proximidad de la proteína diana, permitiendo la biotinilación de proteínas proximales en las aminas primarias dentro de un radio estimado de 10 nm5.
Este enfoque tiene ventajas significativas sobre los enfoques tradicionales Y2H e IP-MS, como la capacidad de capturar PPI transitorios o débiles. Además, PL permite el etiquetado de proteínas proximales de la proteína diana en sus ambientes celulares nativos. Diferentes enzimas PL tienen desventajas únicas al aplicarlas a diferentes sistemas. Por ejemplo, aunque APEX ofrece una cinética de etiquetado más alta en comparación con BioID y se aplica con éxito en sistemas de mamíferos, el requisito de peróxido de hidrógeno tóxico (H2O2) en este enfoque hace que no sea adecuado para estudios de PL en plantas.
Por el contrario, la PL basada en BioID evita el uso del tóxico H2O2, pero la tasa de etiquetado es lenta (requiere 18-24 h para completar la biotinylación), lo que hace que la captura de IBP transitorios sea menos eficiente. Por otra parte, la temperatura de incubación más alta (37 oC) necesaria para el PL eficiente por BioID introduce estrés externo a algunos organismos, como las plantas4. Por lo tanto, se ha notificado un despliegue limitado de PL a base de BioID en plantas (es decir, protoplastias de arroz, Arabidopsis y N. benthamiana) 6,7,8,9. La enzima TurboID recientemente descrita supera las deficiencias de APEX y PL. basado en BioID demostró una alta actividad que permite la realización de PL dentro de 10 min en RT10. La PL basada en TurboID se ha aplicado con éxito en células de mamíferos, moscas y gusanos10. Recientemente, nosotros y otros grupos de investigación optimizamos y ampliamos de forma independiente el uso de PL basado en TurboID para el estudio de los IBP en diferentes sistemas vegetales, incluyendo las plantas de N. benthamiana y Arabidopsis y raíces peludas de tomate11,,12,,13,,14. Los análisis comparativos indicaron que TurboID funciona mejor para PL en plantas en comparación con BioID11,14. También ha demostrado la robustez de la PL basada en TurboID en planta mediante la identificación de una serie de interacciones novedosas con un receptor inmune NLR11, una proteína cuyos socios de interacción son generalmente difíciles de obtener utilizando métodos tradicionales.
Este protocolo ilustra el PL basado en TurboID en planta describiendo la identificación de proteínas de interacción del dominio N-terminal TIR del receptor inmune NLR en plantas de N. benthamiana. El método se puede extender a cualquier proteína de interés en N. benthamiana. Más importante aún, proporciona una referencia importante para la investigación de IBP en otras especies vegetales como Arabidopsis,tomate, y otros.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>721 Spectrophotometer</td>
			<td>Metash, made in China</td>
			<td>Q/SXFZ6</td>
			<td>For OD600 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639-1G</td>
			<td>50 mM Stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td>For affinity purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Costar 3590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>For Western blot analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride solution(LiCl), 8M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Zonkia, made in China</td>
			<td>KDC-2046</td>
			<td>For desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123.21D</td>
			<td>For bead adsorption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N07710</td>
			<td>For OD595 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 (IGEPAL CA-630)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-HA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotational mixer</td>
			<td>Kylin-Bell Lab Instrument</td>
			<td>WH-986</td>
			<td>For IP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shock incubator</td>
			<td>Labotery, made in China</td>
			<td>ZQPZ-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate(SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4390-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G-560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-jacket Incubator</td>
			<td>Blue pard, made in China</td>
			<td>GHP-9080</td>
			<td>For Agrobacterium incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89893</td>
			<td>For removal of biotin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks

Las técnicas de etiquetado de proximidad (PL) que utilizan ascorbato peroxidasa (APEX) o Escherichia coli biotin ligase BirA (conocida como BioID) se han utilizado con éxito para la identificación de interacciones proteína-proteína (IPP) en células de mamíferos. Sin embargo, los requisitos de peróxido de hidrógeno tóxico (H2O2) en PL basado en APEX, tiempo de incubación más largo con biotina (16–24 h) y mayor temperatura de incubación (37 oC) en PL basado en BioID limitan gravemente sus aplicaciones en plantas. El PL basado en TurboID recientemente descrito aborda muchas limitaciones de BioID y APEX. TurboID permite el etiquetado rápido de proximidad de proteínas en tan solo 10 minutos en condiciones de temperatura ambiente (RT). Aunque la utilidad de TurboID se ha demostrado en modelos animales, recientemente demostramos que la PL basada en TurboID funciona mejor en plantas en comparación con BioID para el etiquetado de proteínas que son proximales a una proteína de interés. Aquí se proporciona un protocolo paso a paso para la identificación de socios de interacción proteica utilizando el dominio del receptor N-terminal Toll/interleukin-1 (TIR) de la familia de proteínas de repetición rica en leucina (NLR) de unión a nucleótidos como modelo. El método describe la construcción vectorial, la agroinfiltración de construcciones de expresión de proteínas, el tratamiento de la biotina, la extracción y desalación de proteínas, la cuantificación y el enriquecimiento de las proteínas biotinyladas mediante la purificación de afinidad. El protocolo descrito aquí se puede adaptar fácilmente para estudiar otras proteínas de interés en Nicotiana y otras especies de plantas.

Los datos representativos, que ilustran los resultados esperados basados en el protocolo descrito, se adaptan de Zhang et al11. La Figura 1 resume los procedimientos para realizar PL basado en TurboID en N. benthamiana. La Figura 2 muestra la expresión proteica y biotinylación en las hojas infiltradas de N. benthamiana. La Figura 3 muestra que las proteínas biotiniladas en las hojas infil...

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TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Aquí se describe un método de etiquetado de proximidad para la identificación de socios de interacción del dominio TIR del receptor inmune NLR en el tejido de hoja de Nicotiana benthamiana. También se proporciona un protocolo detallado para la identificación de interacciones entre otras proteínas de interés utilizando esta técnica en Nicotiana y otras especies vegetales.

Etiquetado de proximidad basado en TurboID para la identificación en planta de redes de interacción proteína-proteína

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been ...

Los receptores inmunes NLR juegan un papel crucial en la mediación de la defensa de la planta contra varios patógenos. Describimos un método de etiquetado de proximidad basado en TurboID para la identificación de socios de interacción del dominio de receptor de peaje/interleucina-1 que contiene NLR como receptores inmunes en plantas de Nicotiana benthamiana. Este protocolo proporciona una referencia importante para investigar las interacciones proteína-proteína en otras especies vegetales y puede extenderse a cualquier proteína de interés en Nicotiana benthamiana.El enfoque de etiquetado de proximidad basado en TurboID tiene una clara ventaja sobre los enfoques tradicionales porque se puede utilizar para capturar interacciones proteína-proteína transitorias o débiles in vivo. Comience por cultivar semillas de N.benthamiana en suelo húmedo a alta densidad. Mantenlos en una cámara climática con una luz de 18 horas y un período de fotos oscuras de ocho horas a 23 a 25 grados centígrados.Mantener las plantas en la cámara durante unas cuatro semanas hasta que crezcan a una etapa de hoja de cuatro a ocho para la posterior agroinfiltración. Construir fusiones TurboID y transformar los plásmidos en células competentes Agrobacterium tumefaciens como se describe en el protocolo de texto. Utilice una jeringa sin aguja de un mililitro para infiltrarse en el inóculo de la epidermis abaxial de las hojas de N.benthamiana completamente maduras.A las 36 horas posteriores a la filtración, infíltrate 200 biotina micromolar en las hojas y mantén la planta durante tres a 12 horas adicionales antes de cosechar el tejido de la hoja. Para recoger la muestra de hoja, corte las hojas infiltradas en la base del pecíolo, retire la vena de la hoja y congele el tejido en nitrógeno líquido. Moler el tejido de la hoja con un pestillo y mortero y almacenar el polvo en tubos de halcón de 15 o 50 mililitros a menos 80 grados Centígrados.Para extraer la proteína total, transfiera alrededor de 0,35 gramos de polvo de hoja a un tubo de dos mililitros. Asegúrese de mantener el tejido a baja temperatura en el nitrógeno líquido durante este proceso. Agregue 700 microlitros de tampón de lysis RIPA al polvo.Vórtice el tubo durante 10 minutos y deje la muestra sobre hielo durante 30 minutos, mezclando el contenido cada cuatro a cinco minutos invirtiendo los tubos. Centrifugar los tubos a 20.000 veces g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, recoger el sobrenadante.Retire la biotina libre ejecutando la muestra a través de una columna de desaladuración. Retire el sellador en la parte inferior de la columna y colóquelo en un tubo de 50 mililitros. A continuación, afloje la tapa y centrifuga la columna a 1.000 veces g y cuatro grados centígrados durante dos minutos.Coloque la columna de desaladora en un tubo fresco de 50 mililitros y equilibre la columna tres veces con cinco mililitros de tampón de lysis RIPA. Centrifugarlo a 1.000 veces g y cuatro grados Celsius durante dos minutos y desechar el flujo a través cada vez. Añadir 1,5 mililitros de extracto de proteína a la parte superior de la resina en la columna equilibrada.Y cuando el extracto entre en la resina, agregue otros 100 microlitros de tónifico de lysis RIPA. Centrifugar la columna durante dos minutos y dejar las muestras desaladas sobre hielo hasta su uso posterior. Para cuantificar los extractos de proteínas desaladas, mida el OD595 utilizando un espectrofotómetro Bio-Rad.Dibuje la curva estándar basándose en el valor de la solución BSA de gradiente y calcule la concentración de las muestras de proteínas desaladas. Equilibrar las perlas magnéticas conjugadas C1 de estreptavidina con un mililitro de tampón de lysis RIPA durante un minuto a temperatura ambiente. Utilice el bastidor magnético para absorber las perlas durante tres minutos y aspirar suavemente la solución.A continuación, repita el lavado una vez más. Transfiera el extracto de proteína a las cuentas magnéticas equilibradas e incubar el tubo a cuatro grados Celsius durante la noche en un rotador para purificar la afinidad de las proteínas. Al día siguiente, capture las perlas con un bastidor magnético y aspire el sobrenadante.A continuación, lave las perlas con 1,7 mililitros de tampón de lavado uno añadiéndolo al tubo e incubarlo en el rotor durante ocho minutos. Retire el sobrenadante como se describió anteriormente y repita el lavado con 1,7 mililitros de tampón de lavado dos y lave el tampón tres. Añadir 1,7 mililitros de 50 mililitros Tris HCL para retirar el detergente.A continuación, coloque el tubo en el bastidor magnético y retire el sobrenadante. Repita el lavado con un mililitro de 50 mililitros Tris HCL y transfiera las perlas a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Por último, lave las cuentas seis veces con 50 tampones de bicarbonato de amonio milimolar durante cinco minutos por lavado.Utilice 100 microlitros de perlas para el análisis de inmunoblots para confirmar el enriquecimiento de las proteínas biotiniladas y congelar el resto de la muestra a menos 80 grados centígrados. Se utilizaron manchas occidentales para analizar la expresión proteica y la biotinilación en las hojas agroinfiltradas de N.benthamiana. Las proteínas biotiniladas en las hojas infiltradas se enriquecieron eficientemente con cuentas magnéticas conjugadas C1 de estreptavidina para el posterior análisis de espectrometría de masas.Se capturaron diferentes proteínas con tamaños variados y el análisis de manchas occidentales de las proteínas enriquecidas mostró bandas manchadas. Al intentar este procedimiento, recuerde retirar el sellador en la parte inferior de la columna de desalado y aflojar las tapas antes de cada centrifugación. Este protocolo es fácilmente adaptable a otras proteínas de interés en Nicotiana benthamiana y también se puede utilizar para extender el TurboID PL en otras especies de plantas.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

Método de aglutinación de partículas para la identificación de poliovirus

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Investigación

Inmunología e Infección

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Disección de Host-virus Interacción en la replicación lítica de un Herpesvirus Modelo

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Visualización de virus del dengue a través de Alexa Fluor etiquetado

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

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The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Un enfoque comparativo para caracterizar el paisaje del Huésped-Patógeno interacciones proteína-proteína

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Los ensayos para la identificación de nuevos antivirales contra la fiebre catarral ovina Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

La identificación rápida de bacterias gram negativas de Cultura sangre caldo de cultivo utilizando MALDI-TOF espectrometría de masas

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

El aislamiento, la identificación y purificación de células epiteliales del timo murino

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Identificación de secuencias de localización Plasmodesmal en proteínas en Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identificación de marcadores de virulencia de Mycobacterium abscessus para la replicación intracelular de fagocitos

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...