Name: turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks
Uploaded: 2020-05-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag från National Transgenic Science and Technology Program (2019ZX08010-003 till Y.Z.), National Natural Science Foundation of China (31872637 till Y.Z.)) och grundforskningsfonderna för de centrala universiteten (2019TC028 till Y.Z.) och NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185, och NIH-GM132582-01 till S.P.D.K.

OBS: En översikt över metoden visas i figur 1.
1. Beredning av växtmaterial
<ol><li>Odla N. benthamiana frön i våt jord vid en hög densitet och underhålla dem i en klimatkammare med en 16 h ljus (ca 75 μmol/m2s) och 8 h mörk fotoperiod vid 23-25 °C .</li>
	<li>Ungefär 1 vecka senare, försiktigt överföra varje ung planta till 4 'x 4 ' krukor och hålla plantorna i samma kammare.</li>
	<li>Underhåll växterna i kamma...

<ol>
	<li>Bergg&#229;rd, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li><li>Kim, D. I., Roux, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+void:+proximity-based+labeling+of+proteins+in+living+cells.">Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells.</a> Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).</li><li>Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+interacting+proteins:+Application+of+BioID+as+a+discovery+tool.">Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells.">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nuclear+pore+complex+architecture+with+proximity-dependent+biotinylation.">Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).</li><li>Lin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+proximal+and+interacting+proteins+in+rice+protoplasts+by+proximity-dependent+biotinylation.">Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).</li><li>Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+proximity+dependent+biotin+identification+(BioID).">In planta proximity dependent biotin identification (BioID).</a> Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).</li><li>Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+in+planta+BioID+system+as+a+probe+for+plasma+membrane-associated+immunity+proteins.">Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins.</a> Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).</li><li>Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-dependent+biotinylation+screening+identifies+NbHYPK+as+a+novel+interacting+partner+of+ATG8+in+plants.">Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants.</a> BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).</li><li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID.">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurboID-based+proximity+labeling+reveals+that+UBR7+is+a+regulator+of+N+NLR+immune+receptor-mediated+immunity.">TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity.</a> Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).</li><li>Arora, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+proximity-dependent+biotinylation+approaches+in+different+plant+model+systems.">Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+TurboID-mediated+proximity+labeling+for+mapping+a+GSK3+kinase+signaling+network+in+Arabidopsis.">Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+protein+complexes+and+cell-type-specific+organellar+proteomes+in+Arabidopsis+enabled+by+TurboID.">Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID.</a> eLife. 8, 47864 (2019).</li><li>Yuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Barley+stripe+mosaic+virus+vector+for+virus+induced+gene+silencing+in+monocots+and+dicots.">A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots.</a> PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).</li><li>McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+production+of+highly+competent+cells+of+Agrobacterium+for+transformation+via+electroporation.">A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation.</a> Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).</li><li>Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+know+the+neighborhood:+using+proximity-dependent+biotinylation+to+characterize+protein+complexes+and+map+organelles.">Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).</li><li>Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Interactions+among+centrosome+components+identify+regulators+of+centriole+duplication.">Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication.</a> Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+pH+in+the+Arabidopsis+endomembrane+system.">Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system.</a> Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).</li><li>Bally, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+rise+of+Nicotiana+benthamiana:+a+plant+for+all+reasons.">The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons.</a> Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).</li></ol>

TurboID biotin ligase genereras av jäst display-baserad riktad utveckling av BioID10. Det har många fördelar jämfört med andra PL enzymer. TurboID tillåter tillämpning av PL till andra modellsystem, inklusive flugor och maskar, vars optimala tillväxttemperatur är runt 25 °C10. Även om PL-metoden har använts i stor utsträckning i djursystem är dess tillämpning i växter begränsad. Protokollet beskrivs här ger en steg-för-steg förfarande för att upprätta ...

Prothämmare är grunden för olika cellulära processer. Traditionella metoder för att identifiera prokrommor inkluderar svamp-två-hybrid (Y2H) screening och immunprecipitation i kombination med masspektrometri (IP-MS)1. Båda lider dock av vissa nackdelar. Y2H-screening kräver till exempel att måldjurs- eller djurarter finns tillgängliga för Y2H-bibliotek. Byggandet av dessa bibliotek är arbetsintensivt och dyrt. Dessutom utförs Y2H-metoden i den heterologa eukaryota organismjästen med en cell, som kanske inte representerar cellulära status för högre eukaryota celler.
Däremot visar IP-MS låg effektivitet i att fånga övergående eller svaga probetalare, och det är också olämpligt för de proteiner med lågt överflöd eller hög hydrofobabilitet. Många viktiga proteiner som är involverade i växtsignaleringsvägarna såsom receptorliknande kinaser (RLKs) eller NLR-familjen av immunreceptorer uttrycks på låga nivåer och interagerar ofta med andra proteiner övergående. Därför begränsar det i hög grad förståelsen av mekanismer som ligger till grund för regleringen av dessa proteiner.
Nyligen har närhetsmärkning (PL) metoder baserade på konstruerade ascorbateperoxidas (APEX) och en mutant Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (känd som BioID) har utvecklats och utnyttjats för studier av probetalare2,3,4. Principen för PL är att ett målprotein av intresse är smält med ett enzym, som katalyserar bildandet av labile biotinyl-AMP (bio-AMP). Dessa fria bio-AMP frigörs av PL enzymer och diffusa till närheten av målet proteinet, vilket gör biotinylation av proximala proteiner vid de primära aminer inom en beräknad radie av 10 nm5.
Detta tillvägagångssätt har betydande fördelar jämfört med de traditionella Y2H- och IP-MS-metoderna, såsom förmågan att fånga övergående eller svaga protlyiditeter. Dessutom tillåter PL märkning av proximala proteiner av målproteinet i sina inhemska cellulära miljöer. Olika PL enzymer har unika nackdelar när de appliceras på olika system. Till exempel, även om APEX erbjuder högre märkning kinetik jämfört med BioID och framgångsrikt tillämpas i däggdjurssystem, kravet på giftiga väteperoxid (H2O2) i detta tillvägagångssätt gör det olämpligt för PL-studier i växter.
Däremot undviker BioID-baserade PL användning av giftiga H2O2, men graden av märkning är långsam (kräver 18-24 h för att slutföra biotinylation), vilket gör fångsten av övergående prolkys mindre effektiv. Dessutom medför den högre inkubationstemperatur (37 °C) som krävs för effektiv PL av BioID yttre stress för vissa organismer, såsom växter4. Därför har begränsad användning av BioID-baserade PL i växter (dvs. ris protoplaster, Arabidopsis, och N. benthamiana) rapporterats6,7,8,9. Den nyligen beskrivna TurboID enzym övervinner bristerna i APEX och BioID-baserade PL. TurboID visade hög aktivitet som gör det möjligt att uppnå PL inom 10 min på RT10. TurboID-baserade PL har framgångsrikt tillämpats i däggdjursceller, flugor och maskar10. Nyligen har vi och andra forskargrupper självständigt optimerat och utökat användningen av TurboID-baserade PL för att studera prober i olika växtsystem, inklusive N. benthamiana och Arabidopsis växter och tomat håriga rötter11,12,13,14. Jämförande analyser visade att TurboID presterar bättre för PL i anläggningar jämfört med BioID11,14. Det har också visat robustheten hos TurboID-baserade PL i planta genom att identifiera ett antal nya interaktioner med en NLR immunreceptor11, ett protein vars interaktionspartners vanligtvis är svåra att få med traditionella metoder.
Detta protokoll illustrerar TurboID-baserade PL i planta genom att beskriva identifiering av interaktion proteiner av N-terminal TIR domän nlr immunreceptorn i N. benthamiana växter. Metoden kan utvidgas till alla proteiner av intresse i N. benthamiana. Ännu viktigare, det ger en viktig referens för att undersöka protidies i andra växtarter som Arabidopsis,tomat, och andra.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>721 Spectrophotometer</td>
			<td>Metash, made in China</td>
			<td>Q/SXFZ6</td>
			<td>For OD600 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639-1G</td>
			<td>50 mM Stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td>For affinity purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Costar 3590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>For Western blot analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride solution(LiCl), 8M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Zonkia, made in China</td>
			<td>KDC-2046</td>
			<td>For desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123.21D</td>
			<td>For bead adsorption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N07710</td>
			<td>For OD595 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 (IGEPAL CA-630)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-HA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotational mixer</td>
			<td>Kylin-Bell Lab Instrument</td>
			<td>WH-986</td>
			<td>For IP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shock incubator</td>
			<td>Labotery, made in China</td>
			<td>ZQPZ-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate(SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4390-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G-560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-jacket Incubator</td>
			<td>Blue pard, made in China</td>
			<td>GHP-9080</td>
			<td>For Agrobacterium incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89893</td>
			<td>For removal of biotin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks

Tekniker för närhetsmärkning (PL) med hjälp av konstruerade ascorbatperoxidas (APEX) eller Escherichia coli biotin ligase BirA (känd som BioID) har framgångsrikt använts för identifiering av protein-proteininteraktioner (PROPO) i däggdjursceller. Kraven på toxisk väteperoxid (H2O2)i APEX-baserad PL, längre inkubationstid med biotin (16–24 h) och högre inkubationstemperatur (37 °C) i BioID-baserade PL begränsar dock kraftigt deras tillämpningar i växter. Den nyligen beskrivna TurboID-baserade PL behandlar många begränsningar av BioID och APEX. TurboID möjliggör snabb närhetsmärkning av proteiner på bara 10 min under rumstemperatur (RT) förhållanden. Även om nyttan av TurboID har visats i djurmodeller, visade vi nyligen att TurboID-baserade PL presterar bättre i växter jämfört med BioID för märkning av proteiner som är proximala till ett protein av intresse. Tillhandahålls här är ett steg-för-steg-protokoll för identifiering av protein interaktion partner med hjälp av N-terminal Toll/interleukin-1 receptorn (TIR) domän av nukleotid-bindande leucin-rika upprepa (NLR) protein familj som modell. Metoden beskriver vektorkonstruktion, agroinfiltration av proteinuttryckskonstruktioner, biotinbehandling, proteinutvinning och avsaltning, kvantifiering och anrikning av de biotinylerade proteinerna genom affinitetsrening. Det protokoll som beskrivs här kan enkelt anpassas för att studera andra proteiner av intresse för Nicotiana och andra växtarter.

De representativa uppgifterna, som illustrerar de förväntade resultaten baserat på det beskrivna protokollet, anpassas från Zhang et al11. Figur 1 sammanfattar förfarandena för att utföra TurboID-baserade PL i N. benthamiana. Figur 2 visar proteinuttryck och biotinylation i de infiltrerade N. benthamiana bladen. Figur 3 visar att de biotinylerade proteinerna i de infiltrerade bladen e...

Watch this Scientific Journal Video about TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks at JoVE.com

TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Beskrivs här är en närhet märkning metod för identifiering av interaktion partner i TIR domänen nlr immun receptorn i Nicotiana benthamiana blad vävnad. Dessutom tillhandahålls ett detaljerat protokoll för identifiering av interaktioner mellan andra proteiner av intresse med hjälp av denna teknik i Nicotiana och andra växtarter.

TurboID-baserad närhetsmärkning för planta-identifiering av protein-proteininteraktionsnätverk

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been ...

NLR immunreceptorer spelar en avgörande roll i medla växt försvar mot olika patogener. Vi beskriver en TurboID-baserad närhetsmärkningsmetod för identifiering av interaktionspartners av Toll/interleukin-1-receptordomän som innehåller NLRs såsom immunreceptorer i Nicotiana benthamiana-växter. Detta protokoll ger en viktig referens för att undersöka protein-protein interaktioner i andra växtarter och det kan utvidgas till något protein av intresse i Nicotiana benthamiana.Den TurboID-baserade närhetsmärkningsmetoden har en klar fördel jämfört med de traditionella tillvägagångssätten eftersom den kan användas för att fånga upp övergående eller svaga protein-proteininteraktioner in vivo. Börja med att odla N.benthamiana frön i våt jord med hög densitet. Underhåll dem i en klimatkammare med en 18-timmars ljus och åtta timmars mörk fotoperiod vid 23 till 25 grader Celsius.Håll växterna i kammaren i ungefär fyra veckor tills de växer till ett blad skede av fyra till åtta för efterföljande agroinfiltration. Konstruera TurboID fusioner och omvandla plasmiderna till Agrobacterium tumefaciens kompetenta celler som beskrivs i textprotokollet. Använd en en milliliter nållös spruta för att infiltrera inokulat av abaxial epidermis av de fullt mogna N.benthamiana bladen.Vid 36 timmar efter filtrering, infiltrera 200 mikromolar biotin i bladen och underhålla anläggningen i ytterligare tre till 12 timmar innan skörd bladvävnaden. För att samla bladprovet, skär de infiltrerade bladen vid basen av petiole, ta bort bladvenen och flash frysa vävnaden i flytande kväve. Mala bladvävnaden med en mortel och mortel och förvara pulvret i 15 eller 50 milliliter Falcon rör på minus 80 grader Celsius.För att extrahera det totala proteinet, överför ca 0,35 gram bladpulver till ett två milliliterrör. Var noga med att bibehålla vävnaden vid låg temperatur i det flytande kvävet under denna process. Tillsätt 700 mikroliter av RIPA-lysbuffert till pulvret.Vortexa röret i 10 minuter och lämna provet på is i 30 minuter, blanda innehållet var fjärde till femte minut genom att vända rören. Centrifugera rören vid 20, 000 gånger g vid fyra grader Celsius i 10 minuter. Samla sedan supernatanten.Ta bort den fria biotin genom att köra provet genom en desalting kolumn. Ta bort sealern längst ned på kolonnen och lägg den i ett 50 milliliterrör. Lossa sedan locket och centrifug kolonnen vid 1, 000 gånger g och fyra grader Celsius i två minuter.Placera avsaltningskolumnen i ett färskt 50 milliliterrör och jämviktskolonnen tre gånger med fem milliliter RIPA-lysbuffert. Centrifugera den vid 1, 000 gånger g och fyra grader Celsius i två minuter och kassera genomflödet varje gång. Tillsätt 1,5 milliliter proteinextrakt till toppen av hartset i den ekvilokanterade kolonnen.Och när extraktet kommer in i hartset, tillsätt ytterligare 100 mikroliter av RIPA lysbuffert. Centrifugera kolonnen i två minuter och lämna de desaltade proverna på is tills vidare används. För att kvantifiera de avsaltade proteinextrakten, mät OD595 med hjälp av en Bio-Rad-spektrofotometer.Rita standardkurvan utifrån värdet på gradienten BSA-lösningen och beräkna koncentrationen av de avsaltade proteinproverna. Jämviktsrelaterat streptavidin C1 konjugerade magnetiska pärlor med en milliliter RIPA-lysbuffert under en minut vid rumstemperatur. Använd det magnetiska stället för att absorbera pärlorna i tre minuter och aspirera försiktigt lösningen.Upprepa sedan tvätten en gång till. Överför proteinextraktet till de ekvilonde magnetiska pärlorna och inkubera röret i fyra grader Celsius över natten på en rotator till affinitetrenarea proteinerna. På nästa dag, fånga pärlorna med en magnetisk rack och aspirera supernatanten.Därefter tvätta pärlorna med 1,7 milliliter tvättbuffert en genom att lägga till det i röret och inkubera den på rotorn i åtta minuter. Ta bort supernatanten som tidigare beskrivits och upprepa tvätten med 1,7 milliliter tvättbuffert två och tvätta buffert tre. Tillsätt 1,7 milliliter på 50 millimol tris HCL för att avlägsna diskmedlet.Placera sedan röret på magnetstället och ta bort supernatanten. Upprepa tvätten med en milliliter på 50 millimol tris HCL och överför pärlorna till ett nytt 1,5 milliliterrör. Slutligen, tvätta pärlorna sex gånger med 50 millimolar ammoniumbikarbonatbuffert i fem minuter per tvätt.Använd 100 mikroliter av pärlor för immunblotanalys för att bekräfta anrikningen av de biotinylerade proteinerna och flashfrys resten av provet som ska lagras vid minus 80 grader Celsius. Western blots användes för att analysera protein uttryck och biotinylation i den agroinfiltrated N.benthamiana blad. De biotinylerade proteiner i de infiltrerade bladen var effektivt berikas med streptavidin C1 konjugerade magnetiska pärlor för efterföljande massa spectrometry analys.Olika proteiner med varierande storlekar fångades och Western blot analys av de berikade proteiner visade utsmetade band. När du försöker med detta förfarande, var god kom ihåg att ta bort förslutningsapparaten i botten av avsaltningskolumnen och lossa locken före varje centrifugering. Detta protokoll är lätt att anpassa till andra proteiner av intresse i Nicotiana benthamiana och kan också användas för att utvidga TurboID PL i andra växtarter.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

Partikel Agglutination Metod för Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Analysera Host-virus interaktion i Lytisk Replikering av en modell Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Visualisering Dengue genom Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

En metod för märkning vaskulatur i embryonala möss

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

En komparativ metod för att karakterisera Landskap av värdpatogen Protein-protein interaktioner

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Analyser för identifiering av nya Virushämmande medel mot blåtungevirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Snabb identifiering av gramnegativa bakterier från Blood Culture Broth Använda MALDI-TOF masspektrometri

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolering, identifiering och rening av murina Thymic epitelceller

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Identifiering av Plasmodesmal lokalisering sekvenser i proteiner i Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identifiering av virulens markörer för Mycobacterium abscessus för intracellulär replikering i fagocyter

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...