Name: turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks
Uploaded: 2020-05-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Transgenik Bilim ve Teknoloji Programı (2019ZX08010-003-003'ten Y.Z.'ye), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (31872637'den Y.Z.'ye) ve Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (2019TC028-Y.Z.) ve NSF-IOS-1354434,. NSF-IOS-1339185 ve NIH-GM132582-01 Için S.P.D.K.

NOT: Yöntemegenel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. Bitki malzemesi hazırlama
<ol><li>N. benthamiana tohumlarını ıslak toprakta yüksek yoğunlukta yetiştirin ve 23-25 °C'de 16 h ışık (yaklaşık 75 mol/m2s) ve 8 saat karanlık fotoperiyotlu bir iklim odasında saklayın.</li>
	<li>Yaklaşık 1 hafta sonra, her genç fideyi dikkatlice 4' x 4' tencereye aktarın ve fideleri aynı odada tutun.</li>
	<li>Onlar s...

<ol>
	<li>Bergg&#229;rd, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li><li>Kim, D. I., Roux, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+void:+proximity-based+labeling+of+proteins+in+living+cells.">Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells.</a> Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).</li><li>Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+interacting+proteins:+Application+of+BioID+as+a+discovery+tool.">Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells.">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nuclear+pore+complex+architecture+with+proximity-dependent+biotinylation.">Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).</li><li>Lin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+proximal+and+interacting+proteins+in+rice+protoplasts+by+proximity-dependent+biotinylation.">Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).</li><li>Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+proximity+dependent+biotin+identification+(BioID).">In planta proximity dependent biotin identification (BioID).</a> Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).</li><li>Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+in+planta+BioID+system+as+a+probe+for+plasma+membrane-associated+immunity+proteins.">Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins.</a> Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).</li><li>Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-dependent+biotinylation+screening+identifies+NbHYPK+as+a+novel+interacting+partner+of+ATG8+in+plants.">Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants.</a> BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).</li><li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID.">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurboID-based+proximity+labeling+reveals+that+UBR7+is+a+regulator+of+N+NLR+immune+receptor-mediated+immunity.">TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity.</a> Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).</li><li>Arora, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+proximity-dependent+biotinylation+approaches+in+different+plant+model+systems.">Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+TurboID-mediated+proximity+labeling+for+mapping+a+GSK3+kinase+signaling+network+in+Arabidopsis.">Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+protein+complexes+and+cell-type-specific+organellar+proteomes+in+Arabidopsis+enabled+by+TurboID.">Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID.</a> eLife. 8, 47864 (2019).</li><li>Yuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Barley+stripe+mosaic+virus+vector+for+virus+induced+gene+silencing+in+monocots+and+dicots.">A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots.</a> PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).</li><li>McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+production+of+highly+competent+cells+of+Agrobacterium+for+transformation+via+electroporation.">A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation.</a> Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).</li><li>Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+know+the+neighborhood:+using+proximity-dependent+biotinylation+to+characterize+protein+complexes+and+map+organelles.">Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).</li><li>Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Interactions+among+centrosome+components+identify+regulators+of+centriole+duplication.">Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication.</a> Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+pH+in+the+Arabidopsis+endomembrane+system.">Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system.</a> Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).</li><li>Bally, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+rise+of+Nicotiana+benthamiana:+a+plant+for+all+reasons.">The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons.</a> Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).</li></ol>

TurboID biotin ligaz BioID10maya ekran tabanlı yönlendirilmiş evrim tarafından oluşturulur. Diğer PL enzimlerine göre birçok avantajı vardır. TurboID, optimum büyüme sıcaklığı 25 °C10civarında olan sinek ler ve solucanlar da dahil olmak üzere diğer model sistemlerine PL uygulamasına olanak sağlar. PL yaklaşımı hayvan sistemlerinde yaygın olarak kullanılmasına rağmen, bitkilerde uygulanması sınırlıdır. Burada açıklanan protokol N. bent...

PpIs çeşitli hücresel süreçlerin temelidir. PpIs tanımlamak için geleneksel yöntemler maya-iki-hibrid (Y2H) tarama ve immünopresidkütle spektrometresi ile birleştiğinde (IP-MS)1. Ancak, her ikisi de bazı dezavantajları muzdarip. Örneğin, Y2H taraması hedef bitki veya hayvan türlerinin Y2H kütüphanesinin kullanılabilirliğini gerektirir. Bu kütüphanelerin inşaatı emek yoğun ve pahalıdır. Ayrıca, Y2H yaklaşımı heterolog tek hücreli ökaryotik organizma mayasında gerçekleştirilir, bu da yüksek ökaryotik hücrelerin hücresel durumunu temsil etmeyebilir.
Buna karşılık, IP-MS geçici veya zayıf PPI yakalama düşük verimlilik gösterir, ve aynı zamanda düşük bolluk veya yüksek hidrofobiklik ile bu proteinler için uygun değildir. Reseptör benzeri kinazlar (RLKs) veya NLR bağışıklık reseptörleri ailesi gibi bitki sinyal yollarında yer alan birçok önemli protein düşük seviyelerde ifade edilir ve genellikle geçici olarak diğer proteinlerle etkileşime girer. Bu nedenle, büyük ölçüde bu proteinlerin düzenlenmesi altında mekanizmaların anlaşılmasını kısıtlar.
Son zamanlarda, yakınlık etiketleme (PL) yöntemleri mühendislik askorbat peroksidaz dayalı (APEX) ve mutant Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (BioID olarak bilinen) geliştirilmiş ve PPIs çalışması için kullanılmıştır2,3,4. PL prensibi, bir hedef proteinin labile biotinyl-AMP (bio-AMP) oluşumunu katalizler bir enzim ile kaynaşmış olmasıdır. Bu serbest biyo-AMP PL enzimleri tarafından serbest bırakılır ve hedef protein in çevresine diffüz, 10 nm5tahmini yarıçapı içinde birincil aminlerde proksimal proteinlerin biyotinylation sağlayan 5 .
Bu yaklaşım, geçici veya zayıf PPI yakalama yeteneği gibi geleneksel Y2H ve IP-MS yaklaşımları üzerinde önemli avantajlara sahiptir. Ayrıca, PL kendi yerli hücresel ortamlarda hedef proteinproksimal proteinlerin etiketleme sağlar. Farklı PL enzimleri farklı sistemlere uygularken benzersiz dezavantajları vardır. Örneğin, APEX BioID'ye göre daha yüksek etiketleme kinetik leri sunsa ve memeli sistemlerinde başarılı bir şekilde uygulansa da, bu yaklaşımda toksik hidrojen peroksit (H2O2)gereksinimi bitkilerdeki PL çalışmaları için uygun değildir.
Buna karşılık, BioID tabanlı PL toksik H kullanımını önler2O2, ama etiketleme oranı yavaş (biyotinylation tamamlamak için 18-24 h gerektiren), böylece geçici PPIs yakalama daha az verimli hale. Ayrıca BioID tarafından verimli PL için gereken yüksek kuluçka sıcaklığı (37 °C) bitkiler4gibi bazı organizmalara dış stres getirir. Bu nedenle, bitkilerde BioID tabanlı PL sınırlı dağıtım (yani, pirinç protoplastlar, Arabidopsis, ve N. benthamiana) bildirilmiştir6,7,8,9. Yakın zamanda açıklanan TurboID enzim APEX ve BioID tabanlı PL. TurboID eksiklikleri üstesinden rt 10 10 10 dakika içinde PL başarı sağlayan yüksek aktivitegösterdi. TurboID tabanlı PL başarıyla memeli hücreleri, sinekler ve solucanlar10uygulanmıştır. Son zamanlarda, biz ve diğer araştırma grupları bağımsız optimize ve N. benthamiana ve Arabidopsis bitkiler ve domates tüylü kökleri11,12,,13,14dahil olmak üzere farklı bitki sistemlerinde PPI eğitimi için TurboID tabanlı PL kullanımını uzattı. Karşılaştırmalı analizler TurboID'nin bitkilerde PL için BioID11,14ile karşılaştırıldığında daha iyi performans gösterdiğini göstermiştir. Ayrıca bir NLR bağışıklık reseptörü 11 ile yeni etkileşimler bir dizi tespit ederek planta TurboID tabanlı PL sağlamlığını göstermiştir11, etkileşim ortakları genellikle geleneksel yöntemlerle elde etmek zor bir protein.
Bu protokol, N. benthamiana tesislerinden NLR immün reseptörünün N-terminal TIR etki alanının etkileşim proteinlerinin tanımlanmasını tanımlayarak planta'daki TurboID tabanlı PL'yi göstermektedir. Yöntem N. benthamianailgi herhangi bir protein için uzatılabilir. Daha da önemlisi, Arabidopsis,domates ve diğerleri gibi diğer bitki türlerinde PPIs araştırmak için önemli bir referans sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>721 Spectrophotometer</td>
			<td>Metash, made in China</td>
			<td>Q/SXFZ6</td>
			<td>For OD600 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639-1G</td>
			<td>50 mM Stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td>For affinity purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Costar 3590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>For Western blot analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride solution(LiCl), 8M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Zonkia, made in China</td>
			<td>KDC-2046</td>
			<td>For desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123.21D</td>
			<td>For bead adsorption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N07710</td>
			<td>For OD595 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 (IGEPAL CA-630)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-HA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotational mixer</td>
			<td>Kylin-Bell Lab Instrument</td>
			<td>WH-986</td>
			<td>For IP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shock incubator</td>
			<td>Labotery, made in China</td>
			<td>ZQPZ-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate(SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4390-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G-560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-jacket Incubator</td>
			<td>Blue pard, made in China</td>
			<td>GHP-9080</td>
			<td>For Agrobacterium incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89893</td>
			<td>For removal of biotin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks

Mühendislik askorbat peroksidaz (APEX) veya Escherichia coli biotin ligaz BirA (BioID olarak da bilinir) kullanılarak yapılan yakınlık etiketleme (PL) teknikleri memeli hücrelerindeki protein-protein etkileşimlerinin (PPI) belirlenmesinde başarıyla kullanılmıştır. Ancak, APEX tabanlı PL'de toksik hidrojen peroksit (H2O2)gereksinimleri, biotin ile daha uzun kuluçka süresi (16-24 saat) ve BioID tabanlı PL'de daha yüksek kuluçka sıcaklığı (37 °C) bitkilerdeki uygulamalarını ciddi şekilde sınırlar. Yakın zamanda açıklanan TurboID tabanlı PL BioID ve APEX birçok sınırlamaları giderir. TurboID, oda sıcaklığında (RT) sadece 10 dakika içinde proteinlerin hızlı bir şekilde etiketlemesine olanak tanır. TurboID'nin faydası hayvan modellerinde gösterilmiş olsa da, yakın zamanda TurboID tabanlı PL'nin bitkilerde bioid ile karşılaştırıldığında ilgi çekici bir proteine yakın proteinlerin etiketedilmesi nde daha iyi performans gösterdiğini gösterdik. Burada sağlanan bir model olarak nükleotit bağlayıcı lösin zengintekrar (NLR) protein ailesinin N-terminal Toll/interlökin-1 reseptör (TIR) etki alanı kullanarak protein etkileşim ortaklarının belirlenmesi için bir adım adım protokoldür. Yöntem vektör yapımı, protein ekspresyonu yapılarının agroinfiltrasyonu, biotin tedavisi, protein ekstraksiyonu ve tuzsuzlaştırma, niceleme ve biyotinylated proteinlerin afinite saflaştırma ile zenginleştirilmesi açıklar. Burada açıklanan protokol, Nicotiana ve diğer bitki türlerinde ilgi çeken diğer proteinleri incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Açıklanan protokole dayalı olarak beklenen sonuçları gösteren temsili veriler, Zhang ve ark11'denuyarlanmıştır. Şekil 1 N. benthamianaTurboID tabanlı PL gerçekleştirmek için prosedürleri özetler. Şekil 2, inmiş N. benthamiana yapraklarındaki protein ekspresyonu ve biyotinylasyonunu göstermektedir. Şekil 3, sızmış yapraklarda biyotinylated proteinlerin verimli sonraki ...

Watch this Scientific Journal Video about TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks at JoVE.com

TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Burada açıklanan Nicotiana benthamiana yaprak dokusunda NLR bağışıklık reseptörünün TIR etki alanının etkileşim ortaklarının belirlenmesi için bir yakınlık etiketleme yöntemidir. Ayrıca Nicotiana ve diğer bitki türlerinde bu tekniği kullanarak ilgi diğer proteinler arasındaki etkileşimlerin belirlenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlanır.

Protein-Protein Etkileşim Ağlarının Planta Özdeşleştirilmesinde TurboID Tabanlı Yakınlık Etiketlemesi

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been ...

NLR immün reseptörleri çeşitli patojenlere karşı bitki savunma aracılık önemli bir rol oynamaktadır. Nicotiana benthamiana tesislerinde ki immün reseptörler gibi NLR'leri içeren Toll/interlökin-1 reseptör etki alanının etkileşim ortaklarının belirlenmesi için TurboID tabanlı yakınlık etiketleme yöntemini tanımladık. Bu protokol diğer bitki türlerinde protein-protein etkileşimlerini araştırmak için önemli bir referans sağlar ve Nicotiana benthamiana ilgi herhangi bir protein genişletilebilir.TurboID tabanlı yakınlık etiketleme yaklaşımı geleneksel yaklaşımlara göre belirgin bir avantaja sahiptir, çünkü geçici veya zayıf protein-protein etkileşimlerini vivo olarak yakalamak için kullanılabilir. Yüksek yoğunlukta ıslak toprakta N.benthamiana tohumları yetiştirerek başlayın. 23 ila 25 santigrat derece 18 saat ışık ve sekiz saatlik karanlık fotoğraf süresi ile bir iklim odasında bakım.Onlar sonraki agroinfiltrasyon için dört ila sekiz bir yaprak aşamasına kadar yaklaşık dört hafta boyunca odada bitkiler tutun. TurboID füzyonları inşa edin ve plazmidleri metin protokolünde açıklandığı gibi yetkili hücreleri Agrobacterium tumefaciens'e dönüştürün. Tamamen olgun N.benthamiana yapraklarının abaxial epidermisinin inoculum inoculum sızmak için bir mililitre iğnesiz şırınga kullanın.36 saat post-filtrasyon, yaprakiçine 200 mikromolar biotin sızmak ve yaprak dokusu hasat önce ek bir 3 ila 12 saat için bitki korumak. Yaprak örneği toplamak için, petiole tabanında sızmış yaprakları kesmek, yaprak damarı kaldırmak ve flaş sıvı azot doku dondurmak. Bir havaneli ve harç ile yaprak dokusu grind ve eksi 80 santigrat derece 15 veya 50 mililitre Likkar tüpleri toz saklayın.Toplam proteini çıkarmak için, yaklaşık 0,35 gram yaprak tozunun iki mililitrelik bir tüpe aktarılması. Bu işlem sırasında sıvı nitrojen düşük sıcaklıkta doku korumak için emin olun. Toz için RIPA lysis tampon 700 mikrolitre ekleyin.Tüpü 10 dakika boyunca girdaplayın ve numuneyi 30 dakika buzda bırakın, tüpleri ters çevirerek her 4-5 dakikada bir içindekileri karıştırın. Tüpleri 20,000 kez g'de 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin. Sonra supernatant toplamak.Numuneyi tuzsuzlama sütununa geçirerek serbest biotin'i çıkarın. Köşenin altındaki ucumu çıkarın ve 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Sonra kapağı gevşetin ve iki dakika boyunca 1, 000 kez g ve dört derece santigrat sütun santrifüj.Tuzsuzlama sütununa taze bir 50 mililitrelik tüp yerleştirin ve beş mililitre RIPA lysis tamponu yla sütunu üç kez dengeleyin. 1,000 kez g ve dört santigrat derece iki dakika için santrifüj ve akış her zaman atmak. Dengedeki sütundaki reçinenin üstüne 1,5 mililitre protein ekstresi ekleyin.Ve ekstresi reşin girdiğinde, RIPA lysis tampon başka 100 mikrolitre ekleyin. Koloniki dakika santrifüj ve daha fazla kullanıma kadar buz üzerinde tuzsuz örnekleri bırakın. Tuzsuz protein özlerini ölçmek için Bio-Rad spektrofotometre kullanarak OD595'i ölçün.Degrade BSA çözeltisinin değerine göre standart eğriyi çizin ve tuzsuz protein örneklerinin konsantrasyonunu hesaplayın. Streptavidin C1 konjuge manyetik boncukları oda sıcaklığında bir dakika boyunca bir mililitre RIPA lysis tamponu ile dengeleyin. Üç dakika boyunca boncuk emmek ve yavaşça çözelti aspire için manyetik raf kullanın.Sonra yıkamayı bir kez daha tekrarlayın. Protein ekstresini dengedeki manyetik boncuklara aktarın ve proteinleri arındırmak için bir rotator üzerinde bir gecede tüpü dört derece yetüp tüpe inküler. Ertesi gün, bir manyetik raf ile boncuk yakalamak ve supernatant aspire.Daha sonra, tüpe ekleyerek 1,7 mililitre yıkama tamponu ile boncukları yıkayın ve sekiz dakika boyunca rotor üzerinde kuluçkaya yatırın. Supernatant daha önce açıklandığı gibi çıkarın ve yıkama tampon iki 1.7 mililitre ve yıkama tampon üç ile yıkama tekrarlayın. Deterjanı çıkarmak için 1,7 mililitre 50 milimolar Tris HCL ekleyin.Sonra manyetik raf üzerine tüp yerleştirin ve supernatant çıkarın. 50 milimolar Tris HCL bir mililitre ile yıkama tekrarlayın ve yeni bir 1.5 mililitretüp boncuk transfer. Son olarak, yıkama başına beş dakika 50 milimolar amonyum bikarbonat tampon ile boncuk altı kez yıkayın.Biyotinylated proteinlerin zenginleşmesini onaylamak için immünoblot analizi için boncuk 100 mikrolitre kullanın ve flaş eksi 80 santigrat derecede depolanacak numunenin geri kalanını dondurmak. Batı lekeleri tarıma sızmış N.benthamiana yapraklarında protein ekspresyonu ve biyotinylation analiz etmek için kullanılmıştır. Sızmış yapraklarda biyotinylated proteinler verimli streptavidin C1 sonraki kütle spektrometresi analizi için konjuge manyetik boncukile zenginleştirilmiştir.Çeşitli boyutlarda farklı proteinler ele geçirildi ve zenginleştirilmiş proteinlerin Batı leke analizinde bulaşmış bantlar saptandı. Bu yordamı denerken, lütfen tuzluk sütununun altındaki mastarı çıkarmayı ve her santrifüjden önce kapakları gevşetmeyi unutmayın. Bu protokol, Nicotiana benthamiana'daki diğer proteinlere kolayca uyarlanabilir ve diğer bitki türlerinde TurboID PL'yi genişletmek için de kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

Poliovirüs Kimlik Parçacık Aglütinasyon Yöntemi

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Model Herpesvirüs Litik çoğaltma Diseksiyon Host-virüs Etkileşim

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Alexa Fluor Etiketleme Dang Virüs görselleştirme

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

Embriyonik Farelerde damarları Etiketleme Bir Yöntem

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Bluetongue Virüs karşı Roman Antiviraller belirlenmesi için Tahliller

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

MALDI-TOF kütle spektrometrisi kullanılarak kan kültür besi yerinden, Gram negatif bakterilerin hızlı belirlenmesi

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

İzolasyon, tanımlama ve Murin Thymic Epitel Hücreleri saflaştırılması

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Proteinlerin içinde Planta serilerinde Plasmodesmal yerelleştirme tanımlaması

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Mycobacterium abscessus virülans işaretleri tanımlaması fagositler hücre içi çoğaltma için

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...