Name: localization and quantification of begomoviruses in whitefly tissues by immunofluorescence and quantitative pcr
Uploaded: 2020-02-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي (رقم المنحة: 2017YFD0200600)، والصندوق المخصص لنظام البحوث الزراعية الصيني (رقم المنحة: CARS-23-D07) ومؤسسة بيل وميليندا غيتس (INVESTMENT ID OPP1149777 ). نشكر البروفيسور جيان شيانغ وو لتوفير الأجسام المضادة TYLCV CP.

1. الذبابة البيضاء ، والفيروسات ، والنباتات ، واكتساب الفيروس
<ol><li>الذباب الأبيض الخلفي (MEAM1) على القطن(Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) في أقفاص مقاومة للحشرات في دفيئة عند 26 ± 1 درجة مئوية مع 14:10 ضوء: دورة داكنة و60 ± 10٪ رطوبة نسبية.</li>
	<li>إجراء PCR التقليدية على أساس الخلايا الميتوكوندريا البيضاء أوك...

<ol>
	<li>Rojas, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+management+of+geminiviruses.">World management of geminiviruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).</li><li>De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bemisia+tabaci:+a+statement+of+species+status.">Bemisia tabaci: a statement of species status.</a> Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).</li><li>Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+virus+diseases+transmitted+by+whiteflies.">Emerging virus diseases transmitted by whiteflies.</a> Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+infection+of+tobacco+plants+improves+performance+of+Bemisia+tabaci+but+more+so+for+an+invasive+than+for+an+indigenous+biotype+of+the+whitefly.">Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).</li><li>Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+effects+of+a+begomovirus+infection+and+host+plant+resistance+on+the+preference+and+development+of+an+insect+vector,+Bemisia+tabaci,+and+implications+for+epidemics.">Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics.</a> PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+alters+the+host+preferences+of+its+vector+Bemisia+tabaci.">Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci.</a> Scientific Reports. 3, 2876 (2013).</li><li>Guo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+transmission+of+papaya+leaf+curl+China+virus+among+four+cryptic+species+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+complex.">Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex.</a> Scientific Reports. 5, 15432 (2015).</li><li>Pan, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+efficiency+of+a+begomovirus+to+cross+the+midgut+of+different+species+of+whiteflies+results+in+variation+of+virus+transmission+by+the+vectors.">Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors.</a> Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).</li><li>Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+leaf+curl+disease:+which+whitefly+is+the+vector.">Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector.</a> Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).</li><li>Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+begomoviruses+and+other+whitefly-borne+viruses:+dependence+on+the+vector+species.">Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species.</a> Phytopathology. , (2019).</li><li>Cohen, S., Nitzany, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+and+host+range+of+the+tomato+yellow+leaf+curl+virus.">Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus.</a> Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).</li><li>Moriones, E., Navas-Castillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus,+an+emerging+virus+complex+causing+epidemics+worldwide.">Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide.</a> Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).</li><li>Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+mechanisms+and+components+that+determine+the+transmission+efficiency+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+(Geminiviridae;+Begomovirus)+by+its+whitefly+vector.">A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector.</a> Virus Research. 186, 47-54 (2014).</li><li>Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+-+a+whitefly-transmitted+geminivirus+with+a+single+genomic+component.">Tomato yellow leaf curl virus - a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component.</a> Virology. 185 (1), 151-161 (1991).</li><li>Sanchez-Campos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus:+No+evidence+for+replication+in+the+insect+vector+Bemisia+tabaci.">Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci.</a> Scientific Reports. 6, 30942 (2016).</li><li>Pakkianathan, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+its+whitefly+vector,+Bemisia+tabaci.">Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci.</a> Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).</li><li>Rodriguez-Negrete, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+the+quantification+of+virion-sense+and+complementary-sense+DNA+strands+of+circular+single-stranded+DNA+viruses.">A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses.</a> Scientific Reports. 4, 6438 (2014).</li><li>Gotz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+Bemisia+tabaci+heat+shock+protein+70+in+Begomovirus-whitefly+interactions.">Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).</li><li>Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+whitefly+vesicle+associated+membrane+protein-associated+protein+B+in+the+transmission+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus.">Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus.</a> Virology. 535, 210-217 (2019).</li><li>Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+benefits+population+growth+of+the+Q+biotype+of+Bemisia+tabaci+(Gennadius)+(Hemiptera:+Aleyrodidae).">Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).</li><li>Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incredible+journey+of+begomoviruses+in+their+whitefly+vector.">The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector.</a> Viruses. 9 (10), 273 (2017).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+development+and+vitellogenin+determine+the+transovarial+transmission+of+begomoviruses.">Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).</li><li>Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+transovarial+transmission+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+by+its+vector,+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci.</a> Virology. 240 (2), 295-303 (1998).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+serological+methods+for+detecting+tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+tomato+plants+and+whiteflies.">Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies.</a> Virology Journal. 10, 142 (2013).</li><li>Arya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+principles+of+real-time+quantitative+PCR.">Basic principles of real-time quantitative PCR.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+cells+in+the+primary+salivary+glands+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+control+retention+and+transmission+of+begomoviruses.">Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses.</a> Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).</li><li>Wang, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagy+pathway+participates+in+resistance+to+tomato+yellow+leaf+curl+virus+infection+in+whiteflies.">The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies.</a> Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).</li><li>Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+2(-Delta+Delta+Ct)+calculation+as+an+alternate+method+of+data+analysis+for+quantitative+PCR+of+BCR-ABL+P210+transcripts.">Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts.</a> Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+gene+selection+for+qRT-PCR+analysis+in+the+sweetpotato+whitefly,+Bemisia+tabaci+(Hemiptera:+Aleyrodidae).">Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).</li></ol>

هنا نصف بروتوكول لتوطين والقياس الكمي لفيروس بيغومو في أنسجة ناقل الذبابة البيضاء من قبل الفلور المناعي وqPCR. تشريح يمثل الخطوة الأولى لتوطين والقياس الكمي للفيروس في أنسجة الذبابة البيضاء. يبلغ طول جسم الذبابة البيضاء حوالي 1 مم ، مما يعني أن الأنسجة صغيرة للغاية ، ومن الصعب تشريحها. إلى ج...

في العقود الأخيرة ، تسببت فيروسات البجومو (جنس Begomovirus، Geminiviridaeالأسرة) في أضرار جسيمة لإنتاج العديد من محاصيل الخضروات والألياف والزينة في جميع أنحاء العالم1. تنتقل فيروسات البجومو بطريقة مستمرة عن طريق ذبابة البياض البيضاء (Hemiptera: Aleyrodidae) ، وهي نوع معقد يحتوي على أكثر من 35 نوعًا خفيًا2،3. قد تؤثر فيروسات Begomo بشكل مباشر أو غير مباشر على فسيولوجيا الذبابة البيضاء وسلوكها ، مثل البراز4، وطول العمر4، وتفضيل المضيف5،6. وعلاوة على ذلك، فإن كفاءة انتقال أنواع/سلالة فيروس بيغومو تختلف عن الأنواع المختلفة خفي الذبابة البيضاء حتى في ظل نفس الظروف التجريبية7،8،9،10، مما يدل على أن هناك تفاعل معقد بين فيروسات البجومو والذباب الأبيض. من أجل فهم أفضل للآليات الكامنة وراء تفاعلات الذبابة البيضاء والفايروس، فإن توطين الفيروس والقياس الكمي له في أنسجة الذبابة البيضاء أمر ضروري.
الطماطم الصفراء ورقة حليقة فيروس (TYLCV) هو فيروس begomo التي تم الإبلاغ عنها لأول مرة في إسرائيل ولكن في الوقت الحاضر يسبب أضرارا جسيمة لإنتاج الطماطم في جميع أنحاء العالم11،12. نظرا لأهميتها الاقتصادية، وهي واحدة من أفضل درس begomoviruses13. مثل غيرها من فيروسات البجومو أحادية الجانب ، TYLCV هو فيروس الحمض النووي الدائري أحادي ة حبلا بحجم جينوم يبلغ حوالي 2800 نيوكليوتيدات14. في حين لا تزال قيد المناقشة، عدة خطوط من الأدلة تدعم تكرار TYLCV في الذباب الأبيض15،16،17. وعلاوة على ذلك، تم الإبلاغ عن تفاعل جزيئات TYLCV وبروتينات الذبابة البيضاء6،18،19،20. لانتقال الفيروس، الذباب الأبيض الحصول على TYLCV عن طريق التغذية على النباتات المصابة بالفيروس، وتمر الفيريونات على طول قناة الغذاء للوصول إلى المريء، واختراق جدار منتصف الأمعاء للوصول إلى الهيموليمف، ومن ثم نقل هاوية إلى الغدد اللعابية الأولية (PSGs). وأخيرا، يتم على غرار virions مع اللعاب على طول القناة اللعابية في phloem النبات21. وعلاوة على ذلك، تظهر العديد من الدراسات أن TYLCV قادرة على أن تنتقل عبر ية من الذباب الأبيض الإناث إلى ذريتها22،23. وبعبارة أخرى، من أجل تحقيق انتقال منتج، يتعين على الفيروس التغلب على الحواجز الخلوية داخل الذبابة البيضاء للانتقال من نسيج إلى آخر. أثناء عبور هذه الحواجز، من المرجح أن تحدث تفاعلات بين بروتينات الذبابة البيضاء والفيروسات، وربما تحديد الكفاءة التي تنتقل بها الفيروسات.
الفلور المناعي هو تقنية شائعة الاستخدام لتحليل توزيع البروتين. خصوصية الأجسام المضادة الملزمة للمستضد تشكل أساس الفلور المناعي. نظرًا للأهمية الاقتصادية لـ TYLCV ، تم تطوير الأجسام المضادة أحادية النسيلة ضد بروتين معطف TYLCV ، مما يوفر طريقة حساسة للغاية لتوطين الفيروس24. يسمح PCR الكمي (qPCR) بالقياس الكمي الحساس والمحدد للأحماض النووية. وتستند هذه التقنية في أغلب الأحيان إلى استخدام مسبار التحلل المائي (على سبيل المثال، TaqMan) أو صبغة الفلورسنت (على سبيل المثال، SYBR Green) للكشف. وبالنسبة لـ qPCR القائم على مسبار التحلل المائي، هناك حاجة إلى مسابر محددة، مما يزيد بالتالي من التكلفة. الفلورسنت المستندة إلى صبغ qPCR هو أبسط وأكثر فعالية من حيث التكلفة، وذلك لأن المسمى تحقيقات التهجين amplicon محددة ليست مطلوبة25. حتى الآن، استخدمت العديد من الدراسات الفلورة المناعية وqPCR جنبا إلى جنب مع طرق أخرى للتحقيق في التفاعلات المعقدة بين فيروس بيجومو والذبابة البيضاء. على سبيل المثال، أجرى بان وآخرون تحليل qPCR ومثبط اتّصال المناعة للفيروس في أنسجة الذبابة البيضاء، ووجدوا أن الفرق في القدرة على نقل فيروس التبغ المجعد (TbCSV) بين أنواع الذبابة البيضاء AsiaII 1 والشرق الأوسط آسيا الصغرى 1 (MEAM1) كان بسبب قدرة الفيروس على عبور جدار منتصف الأمعاء في آسيا1 ولكن ليس MEAM18. وبالمثل، في حين أن الذباب الأبيض المتوسط (MED) يمكن أن ينقل بسهولة TYLCV، فإنها تفشل في نقل الطماطم الصفراء ورقة حليقة الصين فيروس (TYLCCNV). تم التحقيق في انتقال انتقائي باستخدام الكشف عن الفلورالمناعي للفيروس في PSGs ، والتي أظهرت أن TYLCCNV لا تعبر بسهولة PSGs من الذباب الأبيض MED26. الفلورة المناعية colocalizationمن TYLCV CP وعلامة autophagy البروتين ATG8-II في الذبابة البيضاء midguts يظهر أن autophagy يلعب دورا حاسما في قمع عدوى TYLCV في الذبابة البيضاء27.
هنا ، باستخدام TYLCV كمثال ، نصف بروتوكولًا لتوطين فيروسات البجومو في الأحشاء البيضاء ، PSGs ، والمبايض بواسطة تقنية الفلورسة المناعية. وتشمل هذه التقنية تشريح، والتثبيت، والحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية الأولية والصبغية. يمكن بعد ذلك الكشف عن إشارات الفلورسينس التي تظهر موقع البروتينات الفيروسية في أنسجة الذبابة البيضاء تحت المجهر البؤري. والأهم من ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتوطين بروتينات البيجوموفيروسات والذبابة البيضاء. كما وصفنا بروتوكولًا للقياس الكمي لـ TYLCV باستخدام QPCR المستند إلى SYBR الأخضر في وسط الذبابة البيضاء ، PSGs ، الهيموليمف ، والمبيضين ، التي يمكن استخدامها لمقارنة كمية الفيروس في عينات أنسجة الذبابة البيضاء المختلفة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>MultiSciences</td>
			<td>F0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole (DAPI)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>MultiSciences</td>
			<td>A3828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>185-5201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-goat anti-mouse</td>
			<td>Earthox</td>
			<td>E032310-02</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody (MAb 1C4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B548119-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820A</td>
			<td>qPCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A41182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissuelyzer</td>
			<td>Shaghai jingxin</td>
			<td>Tissuelyser-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization and quantification of begomoviruses in whitefly tissues by immunofluorescence and quantitative pcr

تنتقل فيروسات البيجومو (جنس Begomovirus، Geminiviridaeالأسرة) عن طريق الذباب الأبيض من مجمع بيميسيا tabaci بطريقة مستمرة وتعميمية. وبالنظر إلى الضرر الواسع النطاق الذي تسببه فيروسات البجومو لإنتاج المحاصيل في جميع أنحاء العالم، لا بد من فهم التفاعل بين فيروسات البجومو وناقل الذبابة البيضاء. وللقيام بذلك، فإن توطين الفيروس والقياس الكمي له في أنسجة النواقل أمر بالغ الأهمية. هنا، باستخدام الطماطم الصفراء ورقة حليقة فيروس (TYLCV) كمثال، ونحن نصف بروتوكول مفصل لتوطين فيروسات البجومو في وسط الذبابة البيضاء، والغدد اللعابية الأولية، والمبايض عن طريق الفلور المناعي. وتستند هذه الطريقة على استخدام أجسام مضادة محددة ضد بروتين معطف الفيروس، والأجسام المضادة الثانوية المسماة بالصبغة، والمجهر البؤري. ويمكن أيضا أن تستخدم البروتوكول لcolocalize بروتينات البيجوموفيروسات والذبابة البيضاء. كما وصفنا بروتوكولًا للقياس الكمي لـ TYLCV في وسط الذبابة البيضاء والغدد اللعابية الأولية والهيموليمف والمبيضين بواسطة PCR الكمي (qPCR). باستخدام المبادئ التمهيدية المصممة خصيصًا لـ TYLCV ، تسمح بروتوكولات القياس الكمي بمقارنة كمية TYLCV في أنسجة الذبابة البيضاء المختلفة. ومن المحتمل أن يكون البروتوكول الموصوف مفيداً للقياس الكمي لفيروسات البجومو في جسم الذبابة البيضاء والنبات المصاب بالفيروس. ويمكن استخدام هذه البروتوكولات لتحليل مسار الدورة الدموية لفيروسات البجومو في الذبابة البيضاء أو كمكمل لطرق أخرى لدراسة التفاعلات بين الذبابة البيضاء والفيروسات.

تم استخدام الذباب الأبيض MEAM1 لمجمع B. tabaci وTYLCV كمثال هنا لوصف الإجراءات. تظهر النظرة العامة لإجراءات الفلور المناعي والقياس الكمي الفيروسي الموصوفة في هذه المخطوطة في الشكل 1. يوضح الشكل 2 النتائج التمثيلية للكشف عن الفلور المناعي لتلطيخ TYLCV وDAPI في PSGs وmid...

Watch this Scientific Journal Video about Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR at JoVE.com

Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

نحن نصف الفلور المناعي وطريقة PCR الكمية لتوطين والقياس الكمي لفيروسات البجومو في أنسجة الحشرات. يمكن استخدام بروتوكول الفلورسينس المناعي لتوطين البروتينات الفيروسية والنواقل. ويمكن توسيع نطاق بروتوكول PCR الكمي لتحديد الفيروسات في أجسام الذبابة البيضاء الكاملة والنباتات المصابة بالفيروس.

توطين والقياس الكمي لفيروسات البيجومو في أنسجة الذبابة البيضاء عن طريق الفلورة المناعية وPCR الكمي

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. ...

ويمكن أن يساعد توضيح المكانية وكمية الفيروس في ناقلات الحمى البيضاء في فهم التفاعلات البيرغوموفيروس وايتفل وفي وضع استراتيجيات جديدة للسيطرة على الأمراض الخطيرة البغوموفيروسية. مزايا هذه التقنية هي أننا يمكن أن نعزل بسرعة أنسجة الفلعة البيضاء ، والمشاركة في توطين البروتينات الفيروسية والفلعة البيضاء ، وقياس الفيروسات في الأجسام البيضاء بأكملها والنباتات المصابة بالفيروسات. في الوقت المناسب في وقت تجريبي، بعد اكتساب الفيروس، ضع الذباب الأبيض الأنثوي المُجَبَّر في قطرة من برنامج تلفزيوني على شريحة مجهر واستخدم إبرة الوخز بالإبر الدقيقة لفتح بطن الذباب الأبيض تحت مجهر ستيريو.استخدام إبرة لاستخراج midgut ووضع منتصف في طبق جمع من برنامج تلفزيوني. لجمع PSGs، وتقسيم الجسم في الصدر من الجانب الظهري بالقرب من الرأس وإصلاحرفل الأبيض مع إبرة من خلال الصدر. استخدام إبرة ثانية لهزة الفلات حتى يتم فصل الغدد اللعابية اثنين من الجسم ونقل الغدد إلى طبق جديد من برنامج تلفزيوني.لجمع المبيضين، افتح البطن تمامًا واستخدم إبرة لفصل المبيضين عن الأنسجة الأخرى. استخدام ماصة لإزالة الأنسجة الزائدة ونقل المبيضين إلى طبق جديد من برنامج تلفزيوني. لجمع عينة من الهيموليم، إضافة 10 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني على شريحة مجهر جديدة ووضعرففلي جديد في قطرات.استخدم إبرة الوخز بالإبر الدقيقة لإحداث ثقب في البطن. ثم تطبيق ضغط طفيف على البطن للافراج عن الهيمولى في المخزن المؤقت وجمع عينة من السائل ثمانية ميكرولتر. لتصور توطين TYLCV في حصادها whitefly PSG، midgut، أو أنسجة المبيض، ونقل 15 إلى 20 عينات في كوب 3.5 سم طبق بيتري وpirpirate العازلة الزائدة.إصلاح الأنسجة في ملليلتر واحد من 4٪ شبهformaldehyde لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة قبل غسل العينات بعناية ثلاث مرات لمدة دقيقتين في ملليلتر واحد من TBS الطازجة في الغسيل. بعد الغسيل الأخير، Permeabilize عينات مع ملليلتر واحد من 0.5٪ تريتون X-100 لمدة 30 دقيقة قبل غسل ثلاث مرات كما أظهرت فقط مع ملليلتر واحد من TBST في غسل. بعد الغسيل الأخير، كتلة أي ربط غير محددة مع ملليلتر واحد من 1٪ البوم مصل البقر لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة تليها ثلاثة يغسل في TBST كما هو موضح.بعد الغسيل الأخير، قم بتسمية الخلايا بالأجسام المضادة الأولية ذات الأهمية بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية محمية من الضوء. في صباح اليوم التالي، قم بغسل العينات ثلاث مرات باستخدام TBST قبل إضافة الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. في نهاية الحضانة، وغسل midguts ثلاث مرات ونقل العينات إلى شريحة المجهر نظيفة.إزالة أكبر قدر ممكن من العازلة وصمة عار النوى مع قطرة واحدة من DAPI قبل تركيب مع غطاء وفحص الأنسجة المسماة عن طريق المجهر confocal. بالنسبة لتكميم TYLCV ، قم بغسل عينات أنسجة الفلعة البيضاء المقطوعة مرتين إلى ثلاث مرات في PBS جديدة ونقل 20 midguts ، 20 PSGs ، أو مبيض واحد في خمسة ميكرولترات من PBS إلى أنابيب PCR الفردية التي تحتوي على 25 ميكرولترات من محلول التحلل. إضافة خمسة إلى سبعة اثنين من الخرز السيراميك ملليمتر قطرها إلى كل أنبوب وطحن العينات في التجانس.إضافة عينة واحدة ثمانية ميكرولتر من الهيموليتف في أنبوب PCR جديد وإضافة 10 ميكرولترات من التحلل إلى الأنبوب مع خلط شامل. احتضان جميع العينات في 65 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة تليها حضانة لمدة 10 دقيقة في 100 درجة مئوية وطرد المركزية وجيزة. بعد ذلك، أضف 18 ميكرولترات من المزيج الرئيسي في قوارير أنابيب قطاع PCR الكمية وإضافة اثنين من ميكرولترات من كل عينة الحمض النووي إلى ثلاث قوارير على الأقل.عندما يتم تحميل جميع العينات، أغلق الأنابيب والطرد المركزي إلى الرواسب الحل في الجزء السفلي من كل قارورة. تحميل قارورة على دورة الحرارية في الوقت الحقيقي لPCR الكمية، واختيار الانترنت وصبغة الفلوروفور وغير معروف كنوع العينة. ثم تصدير البيانات الكمية إلى جدول بيانات لتحليل الكمية النسبية من الحمض النووي الفيروسي في كل عينة.هنا، يتم عرض صور تمثيلية من TYLCV في DAPI تلطيخ في PSGs اللافرف الأبيض، midguts، والمبايض. كما لوحظ، TVLCV يدل على تراكم أكبر داخل PSGs و midguts مما كانت عليه في المبيضين. يشير القياس الكمي للفيروس في PSGs، منتصف السجائر، الهيملmph، والمبايض بعد التغذية على الطماطم المصابة TYLCV لمدة 24 و 48 و 72 ساعة إلى أن كمية الفيروس تزيد في أنسجةرفيل بيضاء مختلفة في ارتباط مباشر مع الزيادة في فترة الوصول إلى الاكتساب.فمن الأفضل لاستخدام الذباب الأبيض الطازج ، والحشرات الميتة سوف تزيد من صعوبة تشريح. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء تحليلات أخرى، مثل النشاف الغربي والمشارك في المناعة، للإجابة على أسئلة إضافية حول التعبير البروتين الفيروسي والتفاعلات الفيروسية والبروتين المتجه.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

الكشف عن MicroRNAs في الخلايا الدبقية الصغيرة من قبل في الوقت الحقيقي PCR في الجهاز العصبي المركزي للمعلمين وأثناء Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

مضان<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH) لتوطين الفيروسات والبكتيريا Endosymbiotic في النبات والحشرات مناديل

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

الكمي في وقت واحد T-خلية الدوائر مستقبلات الختان (TRECs) والدوائر K-حذف إعادة التركيب الختان (KRECs) من قبل في الوقت الحقيقي PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

التنمية والتحقق من طريقة PCR الكمي لEquid الفيروسة-2 التشخيص في الجهاز التنفسي السوائل

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

التنميط الجيني ل<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; من جانب خاص بالريبوسوم فاصل PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

كشف الإنتاجية العالية للجهاز التنفسي مسببات الأمراض في العينات الحيوانية التي كتبها النانو PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

الأيضي رسم الخرائط ذات الصلة: سيتوتشيميستري كمية إنزيم وهيستوتشيميستري لتحديد نشاط ديهيدروجيناسيس في الخلايا والأنسجة

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

التحديد الكمي افيروسيتوسيس بالفحص المجهري Fluorescence خلية واحدة

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

PCR الكمي من عاثية T7 من بيوبانينج

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

الحث والتهديف من مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف في نموذج المورين Xenogeneic والقياس الكمي للخلايا تي البشرية في أنسجة الماوس باستخدام PCR الرقمية

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...