Name: localization and quantification of begomoviruses in whitefly tissues by immunofluorescence and quantitative pcr
Uploaded: 2020-02-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Key Research and Development Program (Grant number: 2017YFD0200600), den øremærkede fond for China Agriculture Research System (tilskudsnummer: CARS-23-D07) og Bill & Melinda Gates Foundation (Investment ID OPP1149777 ). Vi takker prof. Jian-Xiang Wu for at give TYLCV CP antistoffer.

1. Whitefly, Virus, Planter, og erhvervelse af virus
<ol><li>Bageste hvidfluer (MEAM1) på bomuld(Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) i insektsikre bure i et drivhus ved 26 ± 1 °C med en 14:10 lys:mørk cyklus og 60 ± 10% relativ luftfugtighed.</li>
	<li>Udfør konventionelle PCR baseret på whitefly mitokondriel cytokrom oxidase jeg gen til at bestemme renheden af whitefly befolkning.<ol>
<li>Saml 20 voksne hvidfluer og overfør dem individuelt til et PCR-rør, der indeholder 30 μL lysisbuffer (10 mM Tri...

<ol>
	<li>Rojas, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+management+of+geminiviruses.">World management of geminiviruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).</li><li>De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bemisia+tabaci:+a+statement+of+species+status.">Bemisia tabaci: a statement of species status.</a> Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).</li><li>Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+virus+diseases+transmitted+by+whiteflies.">Emerging virus diseases transmitted by whiteflies.</a> Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+infection+of+tobacco+plants+improves+performance+of+Bemisia+tabaci+but+more+so+for+an+invasive+than+for+an+indigenous+biotype+of+the+whitefly.">Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).</li><li>Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+effects+of+a+begomovirus+infection+and+host+plant+resistance+on+the+preference+and+development+of+an+insect+vector,+Bemisia+tabaci,+and+implications+for+epidemics.">Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics.</a> PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+alters+the+host+preferences+of+its+vector+Bemisia+tabaci.">Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci.</a> Scientific Reports. 3, 2876 (2013).</li><li>Guo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+transmission+of+papaya+leaf+curl+China+virus+among+four+cryptic+species+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+complex.">Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex.</a> Scientific Reports. 5, 15432 (2015).</li><li>Pan, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+efficiency+of+a+begomovirus+to+cross+the+midgut+of+different+species+of+whiteflies+results+in+variation+of+virus+transmission+by+the+vectors.">Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors.</a> Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).</li><li>Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+leaf+curl+disease:+which+whitefly+is+the+vector.">Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector.</a> Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).</li><li>Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+begomoviruses+and+other+whitefly-borne+viruses:+dependence+on+the+vector+species.">Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species.</a> Phytopathology. , (2019).</li><li>Cohen, S., Nitzany, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+and+host+range+of+the+tomato+yellow+leaf+curl+virus.">Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus.</a> Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).</li><li>Moriones, E., Navas-Castillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus,+an+emerging+virus+complex+causing+epidemics+worldwide.">Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide.</a> Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).</li><li>Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+mechanisms+and+components+that+determine+the+transmission+efficiency+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+(Geminiviridae;+Begomovirus)+by+its+whitefly+vector.">A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector.</a> Virus Research. 186, 47-54 (2014).</li><li>Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+-+a+whitefly-transmitted+geminivirus+with+a+single+genomic+component.">Tomato yellow leaf curl virus - a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component.</a> Virology. 185 (1), 151-161 (1991).</li><li>Sanchez-Campos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus:+No+evidence+for+replication+in+the+insect+vector+Bemisia+tabaci.">Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci.</a> Scientific Reports. 6, 30942 (2016).</li><li>Pakkianathan, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+its+whitefly+vector,+Bemisia+tabaci.">Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci.</a> Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).</li><li>Rodriguez-Negrete, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+the+quantification+of+virion-sense+and+complementary-sense+DNA+strands+of+circular+single-stranded+DNA+viruses.">A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses.</a> Scientific Reports. 4, 6438 (2014).</li><li>Gotz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+Bemisia+tabaci+heat+shock+protein+70+in+Begomovirus-whitefly+interactions.">Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).</li><li>Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+whitefly+vesicle+associated+membrane+protein-associated+protein+B+in+the+transmission+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus.">Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus.</a> Virology. 535, 210-217 (2019).</li><li>Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+benefits+population+growth+of+the+Q+biotype+of+Bemisia+tabaci+(Gennadius)+(Hemiptera:+Aleyrodidae).">Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).</li><li>Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incredible+journey+of+begomoviruses+in+their+whitefly+vector.">The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector.</a> Viruses. 9 (10), 273 (2017).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+development+and+vitellogenin+determine+the+transovarial+transmission+of+begomoviruses.">Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).</li><li>Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+transovarial+transmission+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+by+its+vector,+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci.</a> Virology. 240 (2), 295-303 (1998).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+serological+methods+for+detecting+tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+tomato+plants+and+whiteflies.">Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies.</a> Virology Journal. 10, 142 (2013).</li><li>Arya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+principles+of+real-time+quantitative+PCR.">Basic principles of real-time quantitative PCR.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+cells+in+the+primary+salivary+glands+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+control+retention+and+transmission+of+begomoviruses.">Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses.</a> Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).</li><li>Wang, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagy+pathway+participates+in+resistance+to+tomato+yellow+leaf+curl+virus+infection+in+whiteflies.">The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies.</a> Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).</li><li>Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+2(-Delta+Delta+Ct)+calculation+as+an+alternate+method+of+data+analysis+for+quantitative+PCR+of+BCR-ABL+P210+transcripts.">Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts.</a> Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+gene+selection+for+qRT-PCR+analysis+in+the+sweetpotato+whitefly,+Bemisia+tabaci+(Hemiptera:+Aleyrodidae).">Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).</li></ol>

Her beskriver vi en protokol for lokalisering og kvantificering af en begomovirus i væv af sin whitefly vektor ved immunfluorescens og qPCR. Dissektion repræsenterer det første skridt til at lokalisere og kvantificere virus i whitefly væv. Den whitefly krop er omkring 1 mm i længden, hvilket betyder, at væv er ekstremt små, og det er svært at dissekere dem. Desuden er der stærke forbindelser mellem væv. For eksempel er æggestokkene tæt forbundet med bakteriokytter, hvilket gør dem vanskelige at isolere. Her ...

I de sidste årtier, begomovirus (slægten Begomovirus, familie Geminiviridae)har forårsaget alvorlige skader på produktionen af mange vegetabilske, fiber, og prydafgrøder på verdensplan1. Begomovirus overføres på en vedvarende måde af whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), som er en kompleks art, der indeholder over 35 kryptiske arter2,3. Begomovirus kan direkte eller indirekte påvirke whitefly fysiologi og adfærd, såsom frugtbarhed4,levetid4,og vært præference5,6. Desuden varierer transmissionseffektiviteten af en given begomovirusart/stamme for forskellige hvidflyvekryptiske arter, selv under de samme forsøgsbetingelser7,8,9,10, hvilket indikerer, at der er et komplekst samspil mellem begomovirus og hvidfluer. For bedre at forstå de mekanismer, der ligger til grund for whitefly-begomovirus interaktioner, lokalisering og kvantificering af virus i whitefly væv er afgørende.
Tomat gul blad krølle virus (TYLCV) er en begomovirus, der først blev rapporteret i Israel, men i dag forårsager alvorlige skader på tomat produktion på verdensplan11,12. På grund af sin økonomiske betydning, det er en af de bedst undersøgte begomovirus13. Ligesom andre monopartit begomovirus er TYLCV en cirkulær DNA-virus med en enkeltstrengs cirkulær DNA-virus med en genomstørrelse på ca. 2.800 nukleotider14. Mens der stadig er under debat, flere linjer af beviser understøtter replikering af TYLCV i whiteflies15,16,17. Desuden er samspillet mellem TYLCV-partikler og whiteflyproteiner rapporteret6,18,19,20. For virus transmission, whiteflies erhverve TYLCV ved fodring på virus-inficerede planter, virioner passere langs fødevarekanalen for at nå spiserøret, trænge ind i midgut væggen for at nå hæmolymfen, og derefter flytte ind i den primære spytkirtler (PSGs). Endelig er virioner egested med spyt langs spytkanalen i plantphloem21. Endvidere viser flere undersøgelser, at TYLCV er i stand til at overføres fra kvindelige hvidefluer til deres afkom22,23. Med andre ord, for at opnå produktiv transmission, virus har til at overvinde cellulære barrierer i whitefly at flytte fra et væv til et andet. Under passagen af disse barrierer, interaktioner mellem whitefly og virus proteiner vil sandsynligvis forekomme, sandsynligvis bestemme den effektivitet, hvormed virus overføres.
Immunfluorescens er en almindeligt anvendt teknik til proteinfordelingsanalyse. Specificiteten af antistoffer, der er bindende for deres antigen, danner grundlag for immunfluorescens. På grund af den økonomiske betydning af TYLCV, monoklonale antistoffer mod TYLCV pels protein er blevet udviklet, tilbyder en meget følsom måde at lokalisere virus24. Kvantitativ PCR (qPCR) muliggør følsom og specifik kvantificering af nukleinsyrer. Denne teknik er oftest baseret på anvendelse af hydrolysesonde (f.eks. TaqMan) eller fluorescerende farvestof (f.eks. For hydrolyse sonde-baserede qPCR, er der behov for specifikke sonder, hvilket derfor øger omkostningerne. Fluorescerende farvestof-baserede qPCR er enklere og mere omkostningseffektiv, fordi mærket amplicon-specifikke hybridisering sonder ikke er påkrævet25. Hidtil, flere undersøgelser har brugt immunfluorescens og qPCR sammen med andre metoder til at undersøge de komplekse begomovirus-whitefly interaktioner. For eksempel udførte Pan et al. qPCR og immunfluorescensanalyse af virus i whiteflyvæv og fandt, at forskellen i evnen til at overføre tobak krøllet skyde virus (TbCSV) mellem whitefly arter AsiaII 1 og Mellemøsten Asien Minor 1 (MEAM1) skyldtes virus er i stand til effektivt at krydse midgut væggen i AsiaII1, men ikke MEAM18. Tilsvarende, mens Middelhavet (MED) whiteflies let kan overføre TYLCV, de undlader at overføre tomat gul blad krølle Kina virus (TYLCCNV). Selektiv overførsel blev undersøgt ved hjælp af immunfluorescenspåvisning af virus i PSG'erne, som viste, at TYLCCNV ikke let krydser PSG'erne i MED whiteflies26. Immunfluorescens colokalisering af TYLCV CP og autofagi markør protein ATG8-II i whitefly midguts viser, at autofagi spiller en afgørende rolle i at undertrykke infektionen af TYLCV i whitefly27.
Her, ved hjælp af TYLCV som et eksempel, beskriver vi en protokol for lokalisering af begomovirus i whitefly midguts, PSGs, og æggestokke ved en immunfluorescens teknik. Teknikken omfatter dissektion, fiksering og inkubation med primære og farvemærkemærkede sekundære antistoffer. Fluorescenssignaler, der viser placeringen af virale proteiner i whitefly-vævene, kan derefter påvises under et konfokalmikroskop. Endnu vigtigere, denne protokol kan bruges til at colocalize begomovirale og whitefly proteiner. Vi beskriver endvidere en protokol for kvantificering af TYLCV ved hjælp af SYBR Green-baserede qPCR i whitefly midguts, PSGs, hæmolymfe og æggestokke, der kan bruges til at sammenligne mængden af virus i forskellige whitefly vævsprøver.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>MultiSciences</td>
			<td>F0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole (DAPI)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>MultiSciences</td>
			<td>A3828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>185-5201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-goat anti-mouse</td>
			<td>Earthox</td>
			<td>E032310-02</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody (MAb 1C4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B548119-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820A</td>
			<td>qPCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A41182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissuelyzer</td>
			<td>Shaghai jingxin</td>
			<td>Tissuelyser-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization and quantification of begomoviruses in whitefly tissues by immunofluorescence and quantitative pcr

Begomovirus (slægten Begomovirus, familie Geminiviridae)overføres af whiteflies af Bemisia tabaci kompleks i en vedvarende, cirkulerende måde. I betragtning af de omfattende skader forårsaget af begomovirus til afgrødeproduktion på verdensplan, er det bydende nødvendigt at forstå samspillet mellem begomovirus og deres whitefly vektor. For at gøre dette, lokalisering og kvantificering af virus i vektorvæv er afgørende. Her, ved hjælp af tomat gul blad krølle virus (TYLCV) som et eksempel, beskriver vi en detaljeret protokol til at lokalisere begomovirus i whitefly midguts, primære spytkirtler, og æggestokke ved immunfluorescens. Metoden er baseret på brugen af specifikke antistoffer mod et viruscoatprotein, farvemærkede sekundære antistoffer og et konfokalmikroskop. Protokollen kan også bruges til at colocalize begomovirale og whitefly proteiner. Vi beskriver endvidere en protokol for kvantificering af TYLCV i whitefly midguts, primære spytkirtler, hæmolymfe og æggestokke efter kvantitativ PCR (qPCR). Ved hjælp af primere specielt designet til TYLCV, protokollerne til kvantificering tillader sammenligning af mængden af TYLCV i forskellige væv af whitefly. Den beskrevne protokol er potentielt nyttig til kvantificering af begomovirus i kroppen af en whitefly og en virus-inficeret plante. Disse protokoller kan bruges til at analysere cirkulation stil en begomovirus i whitefly eller som et supplement til andre metoder til at studere whitefly-begomovirus interaktioner.

MEAM1 whiteflies af B. tabaci kompleks og TYLCV blev brugt som et eksempel her til at beskrive procedurerne. Oversigten over de immunfluorescens- og virale kvantificeringsprocedurer , der er beskrevet i dette manuskript , er vist i figur 1. Figur 2 viser repræsentative resultater af immunfluorescenspåvisning af TYLCV og DAPI farvning i PSGs, midguts og æggestokke, hvilket indikerer, at TYLCV akkumuleret mere i PSGs og midguts, og mindre i æggestokke...

Watch this Scientific Journal Video about Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR at JoVE.com

Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

Vi beskriver en immunfluorescens og kvantitativ PCR-metode til lokalisering og kvantificering af begomovirus i insektvæv. Immunofluorescensprotokollen kan bruges til at colocalize virale og vektorproteiner. Den kvantitative PCR-protokol kan udvides til at kvantificere virus i hele whitefly organer og virus-inficerede planter.

Lokalisering og kvantificering af Begomovirus i Whitefly Væv ved immunfluorescens og kvantitativ PCR

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. ...

Afklaring af rumlighed og mængden af virus i whitefly vektorer kan hjælpe med at forstå begomovirus-whitefly interaktioner og i udviklingen af nye strategier til bekæmpelse af alvorlige begomoviral sygdomme. Fordelene ved denne teknik er, at vi hurtigt kan isolere whitefly væv, co-lokalisere virale og whitefly proteiner, og kvantificere virus i whitefly hele organer og virus-inficerede planter. På det relevante eksperimentelle tidspunkt, efter virus erhvervelse, placere is bedøvet kvindelige whiteflies i en dråbe PBS på et mikroskop dias og bruge en fin akupunktur nål til at åbne maven af whitefly under et stereomikroskop.Brug nålen til at udtrække midgut og placere midgut i en samling parabol af PBS. For at indsamle PSGs, opdele kroppen på brystkassen fra brystsiden nær hovedet og fastgør whitefly med en nål gennem brystkassen. Brug en anden nål til at ryste whitefly indtil de to spytkirtler er adskilt fra kroppen og overføre kirtler til en ny skål af PBS.For at indsamle æggestokkene, helt åbne maven og bruge en nål til at adskille æggestokkene fra de andre væv. Brug en pipette til at fjerne det overskydende væv og overføre æggestokkene til en ny skål af PBS. For at indsamle en hæmolymfe prøve, tilføje 10 mikroliter af PBS på et nyt mikroskop dias og placere en ny whitefly i dråben.Brug en fin akupunktur nål til forsigtigt at lave et hul i maven. Derefter anvende let tryk på maven for at frigive hæmolymfen i bufferen og indsamle en otte mikroliter prøve af væsken. At visualisere TYLCV lokalisering i høstet whitefly PSG, midgut, eller æggestokkene væv, overføre 15 til 20 prøver i et glas 3,5 centimeter Petriskål og aspirere den overskydende buffer.Væv i en milliliter 4% paraformaldehyd i to timer ved stuetemperatur, før prøverne vaskes omhyggeligt tre gange i to minutter i en milliliter frisk TBS pr. vask. Efter den sidste vask skal prøverne permeabiliseres med en milliliter på 0,5 % Triton X-100 i 30 minutter, før de vaskes tre gange som blot påvist med en milliliter TBST pr. vask. Efter den sidste vask blokeres enhver uspecifik binding med en milliliter 1 % kvægserumalbumin i to timer ved stuetemperatur efterfulgt af tre vask i TBST som påvist.Efter den sidste vask, mærke cellerne med de primære antistoffer af interesse natten over ved fire grader Celsius beskyttet mod lys. Næste morgen vaskes prøverne tre gange med TBST, før de relevante sekundære antistoffer tilsættes i to timer ved stuetemperatur, der er beskyttet mod lys. Ved inkubationens afslutning vaskes midguterne tre gange, og prøverne overføres til et rent mikroskopdias.Fjern så meget buffer som muligt og plette kernerne med en dråbe DAPI før montering med en coverslip og undersøge de mærkede væv ved konfokal mikroskopi. Ved tylcv-kvantificering vaskes de høstede whitefly-vævsprøver to til tre gange i frisk PBS, og der overføres 20 midguts, 20 PSG'er eller en æggestr. Tilføj fem til syv to millimeter diameter keramiske perler til hvert rør og male prøverne i en homogenisator.Tilføj en otte mikroliter prøve af hæmolymfe i en ny PCR rør og tilsæt 10 mikroliter lysis til røret med grundig blanding. Inkuber alle prøverne ved 65 grader Celsius i en time efterfulgt af en 10-minutters inkubation ved 100 grader Celsius og en kort centrifugering. Dernæst tilsættes 18 mikroliter master mix i hætteglas af kvantitative PCR striprør og tilsæt to mikroliter af hver DNA-prøve til mindst tre hætteglas.Når alle prøverne er blevet lastet, lukkes rørene og centrifugeres for at sedimentere opløsningen i bunden af hvert hætteglas. Læg hætteglassene på en termisk cyklusr i realtid til kvantitativ PCR, vælge cyber som fluorophore farvestof og ukendt som prøven type. Eksportér derefter de kvantitative data til et regneark til analyse af den relative mængde viralt DNA i hver prøve.Her vises repræsentative billeder af TYLCV i DAPI-farvning i hvidflues psgs, midguts og æggestokke. Som det er konstateret, viser TVLCV en større akkumulering inden for psg'erne og midguts end i æggestokkene. Kvantificering af virus i whitefly PSGs, midguts, hæmolymfe, og æggestokke efter fodring på TYLCV-inficerede tomat for 24, 48 og 72 timer viser, at mængden af virus stiger i forskellige whitefly væv i direkte sammenhæng med stigningen i erhvervelse adgangsperiode.Det er bedst at bruge friske hvidfluer, som døde insekter vil øge vanskeligheden ved dissektion. Efter denne procedure kan andre analyser, såsom vestlig blotting og co-immunoprecipitation, udføres for at besvare yderligere spørgsmål om viralt proteinudtryk og virale og vektorproteininteraktioner.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Påvisning af MicroRNA i Mikroglia af Real-time PCR i Normal CNS og under neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridiseringer (FISH) til lokalisering af vira og Endosymbiotic Bakterier i plante-og insektliv Væv

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Samtidig Kvantificering af T-celle receptor Resektion cirkler (TRECs) og K-Sletning Recombination Resektion cirkler (KRECs) af Real-time PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Udvikling og validering af en kvantitativ PCR Metode til hovdyrets herpesvirus-2 Diagnose i Respiratory Væsker

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotypebestemmelse af<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; ved Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

High-throughput Påvisning af respiratoriske patogener i Animal Prøver af Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Metaboliske kortlægning: Kvantitative enzym Cytochemistry og histokemi at bestemme aktiviteten af Dehydrogenases i celler og væv

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Kvantificering af Efferocytosis af encellede Fluorescens mikroskopi

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

Kvantitativ PCR af T7 Bacteriophage fra Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Induktion og scoring af graft-versus-Host-sygdom i en xenogen Murinmodel og kvantificering af humane T-celler i muse væv ved hjælp af digital PCR

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...