Name: localization and quantification of begomoviruses in whitefly tissues by immunofluorescence and quantitative pcr
Uploaded: 2020-02-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door National Key Research and Development Program (Grant number: 2017YFD0200600), het geoormerkte fonds voor China Agriculture Research System (subsidienummer: CARS-23-D07) en de Bill & Melinda Gates Foundation (Investment ID OPP11497777 ). Wij danken Prof. Jian-Xiang Wu voor het verstrekken van TYLCV CP antilichamen.

1. Whitefly, Virus, Plants, en De verwerving van het Virus
<ol><li>Achterwitte vliegen (MEAM1) op katoen (Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) in insectenbestendige kooien in een kas bij 26 ± 1 °C met een licht-donkere cyclus van 14:10 uur en 60 ± 10% relatieve vochtigheid.</li>
	<li>Voer conventionele PCR uit op basis van wittevliegmitochondrial cytochroomoxidase I-gen om de zuiverheid van de wittevliegpopulatie te bepalen.<ol>
<li>Verzamel 20 volwassen witvliegen en breng ze individueel over naar een PCR-...

<ol>
	<li>Rojas, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+management+of+geminiviruses.">World management of geminiviruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).</li><li>De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bemisia+tabaci:+a+statement+of+species+status.">Bemisia tabaci: a statement of species status.</a> Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).</li><li>Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+virus+diseases+transmitted+by+whiteflies.">Emerging virus diseases transmitted by whiteflies.</a> Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+infection+of+tobacco+plants+improves+performance+of+Bemisia+tabaci+but+more+so+for+an+invasive+than+for+an+indigenous+biotype+of+the+whitefly.">Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).</li><li>Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+effects+of+a+begomovirus+infection+and+host+plant+resistance+on+the+preference+and+development+of+an+insect+vector,+Bemisia+tabaci,+and+implications+for+epidemics.">Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics.</a> PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+alters+the+host+preferences+of+its+vector+Bemisia+tabaci.">Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci.</a> Scientific Reports. 3, 2876 (2013).</li><li>Guo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+transmission+of+papaya+leaf+curl+China+virus+among+four+cryptic+species+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+complex.">Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex.</a> Scientific Reports. 5, 15432 (2015).</li><li>Pan, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+efficiency+of+a+begomovirus+to+cross+the+midgut+of+different+species+of+whiteflies+results+in+variation+of+virus+transmission+by+the+vectors.">Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors.</a> Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).</li><li>Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+leaf+curl+disease:+which+whitefly+is+the+vector.">Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector.</a> Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).</li><li>Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+begomoviruses+and+other+whitefly-borne+viruses:+dependence+on+the+vector+species.">Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species.</a> Phytopathology. , (2019).</li><li>Cohen, S., Nitzany, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+and+host+range+of+the+tomato+yellow+leaf+curl+virus.">Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus.</a> Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).</li><li>Moriones, E., Navas-Castillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus,+an+emerging+virus+complex+causing+epidemics+worldwide.">Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide.</a> Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).</li><li>Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+mechanisms+and+components+that+determine+the+transmission+efficiency+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+(Geminiviridae;+Begomovirus)+by+its+whitefly+vector.">A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector.</a> Virus Research. 186, 47-54 (2014).</li><li>Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+-+a+whitefly-transmitted+geminivirus+with+a+single+genomic+component.">Tomato yellow leaf curl virus - a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component.</a> Virology. 185 (1), 151-161 (1991).</li><li>Sanchez-Campos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus:+No+evidence+for+replication+in+the+insect+vector+Bemisia+tabaci.">Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci.</a> Scientific Reports. 6, 30942 (2016).</li><li>Pakkianathan, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+its+whitefly+vector,+Bemisia+tabaci.">Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci.</a> Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).</li><li>Rodriguez-Negrete, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+the+quantification+of+virion-sense+and+complementary-sense+DNA+strands+of+circular+single-stranded+DNA+viruses.">A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses.</a> Scientific Reports. 4, 6438 (2014).</li><li>Gotz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+Bemisia+tabaci+heat+shock+protein+70+in+Begomovirus-whitefly+interactions.">Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).</li><li>Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+whitefly+vesicle+associated+membrane+protein-associated+protein+B+in+the+transmission+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus.">Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus.</a> Virology. 535, 210-217 (2019).</li><li>Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+benefits+population+growth+of+the+Q+biotype+of+Bemisia+tabaci+(Gennadius)+(Hemiptera:+Aleyrodidae).">Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).</li><li>Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incredible+journey+of+begomoviruses+in+their+whitefly+vector.">The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector.</a> Viruses. 9 (10), 273 (2017).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+development+and+vitellogenin+determine+the+transovarial+transmission+of+begomoviruses.">Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).</li><li>Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+transovarial+transmission+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+by+its+vector,+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci.</a> Virology. 240 (2), 295-303 (1998).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+serological+methods+for+detecting+tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+tomato+plants+and+whiteflies.">Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies.</a> Virology Journal. 10, 142 (2013).</li><li>Arya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+principles+of+real-time+quantitative+PCR.">Basic principles of real-time quantitative PCR.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+cells+in+the+primary+salivary+glands+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+control+retention+and+transmission+of+begomoviruses.">Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses.</a> Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).</li><li>Wang, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagy+pathway+participates+in+resistance+to+tomato+yellow+leaf+curl+virus+infection+in+whiteflies.">The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies.</a> Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).</li><li>Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+2(-Delta+Delta+Ct)+calculation+as+an+alternate+method+of+data+analysis+for+quantitative+PCR+of+BCR-ABL+P210+transcripts.">Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts.</a> Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+gene+selection+for+qRT-PCR+analysis+in+the+sweetpotato+whitefly,+Bemisia+tabaci+(Hemiptera:+Aleyrodidae).">Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).</li></ol>

Hier beschrijven we een protocol voor de lokalisatie en kwantificering van een begomovirus in de weefsels van zijn wittevliegvector door immunofluorescentie en qPCR. Dissectie is de eerste stap om het virus in wittevliegweefsels te lokaliseren en te kwantificeren. De wittevlieg lichaam is ongeveer 1 mm lang, wat betekent dat de weefsels zijn zeer klein, en het is moeilijk om ze te ontleden. Bovendien zijn er sterke verbindingen tussen de weefsels. De eierstokken zijn bijvoorbeeld nauw verbonden met de bacteriocyten, waar...

In de afgelopen decennia hebben begomovirussen (geslacht Begomovirus, familie Geminiviridae)ernstige schade toegebracht aan de productie van vele plantaardige, vezel- en siergewassen wereldwijd1. Begomovirussen worden op een hardnekkige manier overgedragen door de witte vlieg Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), een complexe soort met meer dan 35 cryptische soorten2,3. Begomovirussen kunnen direct of indirect invloed hebben op de fysiologie en het gedrag van witte vlieg, zoals vruchtbaarheid4,levensduur4en gastheervoorkeur5,6. Bovendien varieert de transmissie-efficiëntie van een bepaalde begomovirussoort/-soort voor verschillende wittevliegcryptische soorten, zelfs onder dezelfde experimentele omstandigheden7,8,9,10, wat aangeeft dat er een complexe interactie is tussen begomovirussen en witte vliegen. Om de mechanismen die ten grondslag liggen aan wittevlieg-begomovirus interacties beter te begrijpen, lokalisatie en kwantificering van het virus in wittevliegweefsels zijn essentieel.
Tomaat geel blad krul virus (TYLCV) is een begomovirus dat voor het eerst werd gemeld in Israël, maar tegenwoordig veroorzaakt ernstige schade aan de tomatenproductie wereldwijd11,12. Vanwege het economische belang is het een van de best bestudeerde begomovirussen13. Net als andere monopartite begomovirussen, TYLCV is een single-streng cirkel-DNA-virus met een genoom grootte van ongeveer 2.800 nucleotiden14. Hoewel nog steeds in debat, verschillende lijnen van bewijs ondersteunen de replicatie van TYLCV in whiteflies15,16,17. Bovendien is de interactie van TYLCV-deeltjes en wittevliegeiwitten gerapporteerd6,18,19,20. Voor virusoverdracht verwerven witte vliegen TYLCV door zich te voeden met virusgeïnfecteerde planten, passeren virions langs het voedselkanaal om de slokdarm te bereiken, dringen ze de midgutwand binnen om de hemolymph te bereiken en vervolgens over te plaatsen in de primaire speekselklieren (PSG's). Ten slotte worden virions met speeksel langs het speekselkanaal in plantenphloem21ingenomen. Bovendien tonen verschillende studies aan dat TYLCV transovarially kan worden overgedragen van vrouwelijke wittevliegen naar hun nakomelingen22,23. Met andere woorden, om productieve transmissie te bereiken, moet het virus cellulaire barrières binnen de witte vlieg overwinnen om van het ene weefsel naar het andere te translokaliseren. Tijdens het oversteken van deze barrières zullen interacties tussen wittevlieg- en viruseiwitten waarschijnlijk optreden, waarschijnlijk het bepalen van de efficiëntie waarmee de virussen worden overgedragen.
Immunofluorescentie is een veelgebruikte techniek voor eiwitdistributieanalyse. De specificiteit van antilichamen die aan hun antigeen zijn gebonden, vormt de basis van immunofluorescentie. Vanwege de economische betekenis van TYLCV zijn monoklonale antilichamen tegen het TYLCV-vachteiwit ontwikkeld, die een zeer gevoelige manier bieden om het virus te lokaliseren24. Kwantitatieve PCR (qPCR) maakt gevoelige en specifieke kwantificering van nucleïnezuren mogelijk. Deze techniek is het vaakst gebaseerd op het gebruik van hydrolyse sonde (bijvoorbeeld TaqMan) of fluorescerende kleurstof (bijvoorbeeld SYBR Green) detectie. Voor qPCR op basis van hydrolysesonis zijn specifieke sondes nodig, waardoor de kosten stijgen. Fluorescerende kleurstof gebaseerde qPCR is eenvoudiger en kosteneffectiever, omdat gelabeld amplicon-specifieke hybridisatie sondes zijn niet vereist25. Tot nu toe hebben verschillende studies immunofluorescentie en qPCR gebruikt, samen met andere methoden om de complexe interacties tussen begomovirus-whitefly te onderzoeken. Pan et al. voerde bijvoorbeeld qPCR- en immunofluorescentieanalyse van het virus in wittevliegweefsels uit en constateerde dat het verschil in vermogen om tabakskrullend scheutvirus (TbCSV) tussen wittevliegsoorten AsiaII 1 en Minor 1 in Het Midden-Oosten (MEAM1) over te brengen, te wijten was aan het feit dat het virus efficiënt de midgutwall van AsiaII1 maar meam18kon oversteken. Op dezelfde manier, terwijl mediterrane (MED) witte vliegen gemakkelijk Kan verzenden TYLCV, ze niet aan tomaat gele blad krul China virus (TYLCCNV) overbrengen. Selectieve overdracht werd onderzocht aan de hand van immunofluorescentiedetectie van het virus in de PSG's, waaruit bleek dat TYLCCNV niet gemakkelijk de PSGs van MED-witvliegen kruist26. Immunofluorescentie colokalisatie van TYLCV CP en de autofagie marker eiwit ATG8-II in wittevlieg midguts blijkt dat autofagie speelt een cruciale rol bij het onderdrukken van de infectie van TYLCV in de wittevlieg27.
Hier beschrijven we met Behulp van TYLCV als voorbeeld een protocol voor de lokalisatie van begomovirussen in wittevliegdwergen, PSGs en eierstokken door middel van een immunofluorescentietechniek. De techniek omvat dissectie, fixatie, en incubatie met primaire en kleurstof-gelabeldsecundaire antilichamen. Fluorescentiesignalen die de locatie van virale eiwitten in de wittevliegweefsels laten zien, kunnen vervolgens worden gedetecteerd onder een confocale microscoop. Wat nog belangrijker is, kan dit protocol worden gebruikt om begomovirale en wittevliegproteïnen colocaliseren. We beschrijven verder een protocol voor de kwantificering van TYLCV met behulp van SYBR Green-based qPCR in whitefly midguts, PSGs, hemolymph, en eierstokken, die kunnen worden gebruikt om de hoeveelheid virus te vergelijken in verschillende wittevliegweefsel monsters.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>MultiSciences</td>
			<td>F0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole (DAPI)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>MultiSciences</td>
			<td>A3828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>185-5201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-goat anti-mouse</td>
			<td>Earthox</td>
			<td>E032310-02</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody (MAb 1C4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B548119-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820A</td>
			<td>qPCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A41182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissuelyzer</td>
			<td>Shaghai jingxin</td>
			<td>Tissuelyser-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization and quantification of begomoviruses in whitefly tissues by immunofluorescence and quantitative pcr

Begomovirussen (geslacht Begomovirus, familie Geminiviridae) worden overgedragen door witte vliegen van de Bemisia tabaci complex in een aanhoudende, circulerende manier. Gezien de grote schade veroorzaakt door begomovirussen aan de productie van gewassen wereldwijd, is het noodzakelijk om de interactie tussen begomovirussen en hun wittevliegvector te begrijpen. Om dit te doen, lokalisatie en kwantificering van het virus in de vectorweefsels is van cruciaal belang. Hier, met behulp van tomaat geel blad krul virus (TYLCV) als voorbeeld, beschrijven we een gedetailleerd protocol om begomovirussen lokaliseren in wittevlieg midguts, primaire speekselklieren, en eierstokken door immunofluorescentie. De methode is gebaseerd op het gebruik van specifieke antilichamen tegen een viruscoat eiwit, kleurstof-gelabeldsecundaire antilichamen, en een confocale microscoop. Het protocol kan ook worden gebruikt om begomovirale en wittevliegeiwitten te colocaliseren. We beschrijven verder een protocol voor de kwantificering van TYLCV in wittevliegmiddeningewanden, primaire speekselklieren, hemolymph en eierstokken door kwantitatieve PCR (qPCR). Met behulp van primers speciaal ontworpen voor TYLCV, de protocollen voor kwantificering maken de vergelijking van de hoeveelheid TYLCV in verschillende weefsels van de wittevlieg. Het beschreven protocol is potentieel nuttig voor de kwantificering van begomovirussen in het lichaam van een wittevlieg en een met virussen geïnfecteerde plant. Deze protocollen kunnen worden gebruikt om de circulatieroute van begomovirussen in de wittevlieg te analyseren of als aanvulling op andere methoden om wittevlieg-begomovirus interacties te bestuderen.

De MEAM1 whiteflies van het B. tabaci complex en TYLCV werden hier als voorbeeld gebruikt om de procedures te beschrijven. Het overzicht van de immunofluorescentie- en virale kwantificeringsprocedures die in dit manuscript worden beschreven, is weergegeven in figuur 1. Figuur 2 toont representatieve resultaten van immunofluorescentiedetectie van TYLCV- en DAPI-vlekken in PSG's, midguts en eierstokken, wat aangeeft dat TYLCV meer heeft opgehoopt in de PS...

Watch this Scientific Journal Video about Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR at JoVE.com

Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

We beschrijven een immunofluorescentie en kwantitatieve PCR-methode voor de lokalisatie en kwantificering van begomovirussen in insectenweefsels. Het immunofluorescentieprotocol kan worden gebruikt om virale en vectoreiwitten samen te lokaliseren. Het kwantitatieve PCR-protocol kan worden uitgebreid om virussen in hele wittevlieglichamen en met virussen geïnfecteerde planten te kwantificeren.

Lokalisatie en kwantificering van Begomovirussen in Whitefly Weefsels door immunofluorescentie en kwantitatieve PCR

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. ...

Het verduidelijken van de ruimtelijkheid en de hoeveelheid virus in wittevliegvectoren kan helpen bij het begrijpen van begomovirus-wittevlieginteracties en bij de ontwikkeling van nieuwe strategieën voor het beheersen van ernstige begomovirale ziekten. De voordelen van deze techniek zijn dat we snel wittevliegweefsels kunnen isoleren, virale en wittevliegeiwitten kunnen colokaliseren en virussen kunnen kwantificeren in wittevliegn en met virussen geïnfecteerde planten. Op het juiste experimentele tijdstip, na virusverwerving, plaats ijsverdoofde vrouwelijke wittevliegen in een druppel PBS op een microscoopdia en gebruik een fijne acupunctuurnaald om de buik van de wittevlieg onder een stereomicroscoop te openen.Gebruik de naald om de midgut te extraheren en plaats de midgut in een collectie schotel van PBS. Om de PSG's te verzamelen, splits het lichaam aan de thorax van de rugzijde in de buurt van het hoofd en bevestig de wittevlieg met een naald door de thorax. Gebruik een tweede naald om de wittevlieg te schudden totdat de twee speekselklieren zijn gescheiden van het lichaam en breng de klieren naar een nieuwe schotel van PBS.Om de eierstokken te verzamelen, open de buik volledig en gebruik een naald om de eierstokken van de andere weefsels te scheiden. Gebruik een pipet om het overtollige weefsel te verwijderen en de eierstokken over te brengen in een nieuwe schotel van PBS. Om een hemolymph monster te verzamelen, voeg 10 microliter PBS op een nieuwe microscoop dia en plaats een nieuwe wittevlieg in de druppel.Gebruik een fijne acupunctuur naald om voorzichtig een gat in de buik te maken. Breng vervolgens lichte druk op de buik om de hemolymph los te laten in de buffer en het verzamelen van een acht microliter monster van de vloeistof. Om TYLCV lokalisatie in geoogste wittevlieg PSG, midgut, of eierstokweefsels te visualiseren, breng 15 tot 20 exemplaren in een glas 3.5 centimeter Petri schotel en aspirate de overtollige buffer.Bevestig de weefsels in een milliliter van 4%paraformaldehyde gedurende twee uur bij kamertemperatuur voordat u de monsters drie keer gedurende twee minuten zorgvuldig wast in één milliliter verse tbs per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, permeabilize de monsters met een milliliter van 0,5%Triton X-100 gedurende 30 minuten voor het wassen drie keer zoals net aangetoond met een milliliter tbs per wasbeurt. Blokkeer na de laatste wasbeurt elke niet-specifieke binding met één milliliter van 1%runderserum albumine gedurende twee uur bij kamertemperatuur, gevolgd door drie wasbeurten in tbst zoals aangetoond.Na de laatste wasbeurt, label de cellen met de primaire antilichamen van belang 's nachts op vier graden Celsius beschermd tegen licht. De volgende ochtend, was de monsters drie keer met TBST voor het toevoegen van de juiste secundaire antilichamen gedurende twee uur bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, was de midguts drie keer en breng de exemplaren naar een schone microscoop dia.Verwijder zoveel mogelijk buffer en bevlek de kernen met een druppel DAPI voordat u met een coverslip wordt gemonteerd en de gelabelde weefsels door confocale microscopie onderzoekt. Voor tylcv kwantificering, was de geoogste wittevlieg weefsel monsters twee tot drie keer in verse PBS en breng 20 midguts, 20 PSGs, of een eierstok in vijf microliter PBS in individuele PCR buizen met 25 microliter lyse oplossing. Voeg vijf tot zeven twee millimeter diameter keramische kralen aan elke buis en maal de monsters in een homogenisator.Voeg een acht microliter monster van hemolymph in een nieuwe PCR buis en voeg 10 microliter lyse aan de buis met grondig mengen. Broed alle monsters op 65 graden Celsius gedurende een uur, gevolgd door een 10-minuten incubatie bij 100 graden Celsius en een korte centrifugatie. Voeg vervolgens 18 microliters van master mix in de flacons van kwantitatieve PCR strip buizen en voeg twee microliters van elk DNA monster aan ten minste drie flesjes.Wanneer alle monsters zijn geladen, sluit u de buizen en centrifuge de oplossing op de bodem van elke flacon. Laad de flacons op een real-time thermische cycler voor kwantitatieve PCR, het selecteren van cyber als de fluorofophore kleurstof en onbekend als het monster type. Exporteer vervolgens de kwantitatieve gegevens naar een spreadsheet voor analyse van de relatieve hoeveelheid viraal DNA in elk monster.Hier worden representatieve afbeeldingen van TYLCV in DAPI-vlekken in wittevlieg-PSG's, midguts en eierstokken getoond. Zoals waargenomen, tvLCV toont een grotere accumulatie binnen de PSG's en midguts dan in de eierstokken. Kwantificering van het virus in wittevliegSgs, midguts, hemolymph en eierstokken na het voeden met met TYLCV geïnfecteerde tomaat gedurende 24, 48 en 72 uur geeft aan dat de hoeveelheid virus toeneemt in verschillende wittevliegweefsels in directe correlatie met de toename van de toegang tot de verwerving.Het is het beste om verse wittevliegen te gebruiken, omdat dode insecten de moeilijkheidsgraad van dissectie zullen verhogen. Na deze procedure kunnen andere analyses, zoals westerse blotting en co-immunoprecipitatie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen over virale eiwitexpressie en virale en vectoreiwitinteracties te beantwoorden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Detectie van microRNA&#39;s in Microglia door Real-time PCR in Normal CNS en tijdens ontstekingsprocessen

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescentie<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisaties (FISH) voor de lokalisatie van Virussen en Endosymbiotic Bacteriën in Plant en Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Gelijktijdige Kwantificering van de T-cel receptor Excisie cirkels (TRECS) en K-verwijderen recombinatie Excisie cirkels (KRECs) van Real-time PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Ontwikkeling en validatie van een kwantitatieve PCR-methode voor equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotypering van<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Door Ribosomaal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

High-throughput detectie van respiratoire pathogene in dierlijke specimens door nanoschaal PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Metabole Mapping: Kwantitatieve enzym cytochemie en histochemie te bepalen van de activiteit van Dehydrogenases in cellen en weefsels

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

Kwantitatieve PCR van T7 bacteriofaag van Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Inductie en scoren van transplantaat-versus-gastheer ziekte in een xenogene Murine model en kwantificering van menselijke T cellen in muizen weefsels met behulp van digitale PCR

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...