Name: localization and quantification of begomoviruses in whitefly tissues by immunofluorescence and quantitative pcr
Uploaded: 2020-02-08T12:00:00
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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das National Key Research and Development Program (Grant-Nummer: 2017YFD0200600), den zweckgebundenen Fonds für das China Agriculture Research System (Zuschussnummer: CARS-23-D07) und die Bill & Melinda Gates Foundation (Investment ID OPP1149777 ). Wir danken Prof. Jian-Xiang Wu für die Bereitstellung von TYLCV CP Antikörpern.

1. Whitefly, Virus, Pflanzen und Erwerb des Virus
<ol><li>Hintere Weißfliegen (MEAM1) auf Baumwolle (Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) in insektensicheren Käfigen in einem Gewächshaus bei 26 °C bei 14:10 Licht:Dunkel-Zyklus und 60 x 10% relativer Luftfeuchtigkeit.</li>
	<li>Führen Sie konventionelle PCR basierend auf Whitefly mitochondriale Cytochromoxidase I Gen, um die Reinheit der Whitefly-Population zu bestimmen.<ol>
<li>Sammeln Sie 20 erwachsene Weißfliegen und übertragen Sie sie einzeln in ein ...

<ol>
	<li>Rojas, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+management+of+geminiviruses.">World management of geminiviruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).</li><li>De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bemisia+tabaci:+a+statement+of+species+status.">Bemisia tabaci: a statement of species status.</a> Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).</li><li>Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+virus+diseases+transmitted+by+whiteflies.">Emerging virus diseases transmitted by whiteflies.</a> Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+infection+of+tobacco+plants+improves+performance+of+Bemisia+tabaci+but+more+so+for+an+invasive+than+for+an+indigenous+biotype+of+the+whitefly.">Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).</li><li>Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+effects+of+a+begomovirus+infection+and+host+plant+resistance+on+the+preference+and+development+of+an+insect+vector,+Bemisia+tabaci,+and+implications+for+epidemics.">Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics.</a> PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+alters+the+host+preferences+of+its+vector+Bemisia+tabaci.">Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci.</a> Scientific Reports. 3, 2876 (2013).</li><li>Guo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+transmission+of+papaya+leaf+curl+China+virus+among+four+cryptic+species+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+complex.">Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex.</a> Scientific Reports. 5, 15432 (2015).</li><li>Pan, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+efficiency+of+a+begomovirus+to+cross+the+midgut+of+different+species+of+whiteflies+results+in+variation+of+virus+transmission+by+the+vectors.">Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors.</a> Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).</li><li>Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+leaf+curl+disease:+which+whitefly+is+the+vector.">Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector.</a> Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).</li><li>Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+begomoviruses+and+other+whitefly-borne+viruses:+dependence+on+the+vector+species.">Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species.</a> Phytopathology. , (2019).</li><li>Cohen, S., Nitzany, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+and+host+range+of+the+tomato+yellow+leaf+curl+virus.">Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus.</a> Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).</li><li>Moriones, E., Navas-Castillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus,+an+emerging+virus+complex+causing+epidemics+worldwide.">Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide.</a> Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).</li><li>Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+mechanisms+and+components+that+determine+the+transmission+efficiency+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+(Geminiviridae;+Begomovirus)+by+its+whitefly+vector.">A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector.</a> Virus Research. 186, 47-54 (2014).</li><li>Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+-+a+whitefly-transmitted+geminivirus+with+a+single+genomic+component.">Tomato yellow leaf curl virus - a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component.</a> Virology. 185 (1), 151-161 (1991).</li><li>Sanchez-Campos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus:+No+evidence+for+replication+in+the+insect+vector+Bemisia+tabaci.">Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci.</a> Scientific Reports. 6, 30942 (2016).</li><li>Pakkianathan, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+its+whitefly+vector,+Bemisia+tabaci.">Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci.</a> Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).</li><li>Rodriguez-Negrete, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+the+quantification+of+virion-sense+and+complementary-sense+DNA+strands+of+circular+single-stranded+DNA+viruses.">A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses.</a> Scientific Reports. 4, 6438 (2014).</li><li>Gotz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+Bemisia+tabaci+heat+shock+protein+70+in+Begomovirus-whitefly+interactions.">Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).</li><li>Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+whitefly+vesicle+associated+membrane+protein-associated+protein+B+in+the+transmission+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus.">Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus.</a> Virology. 535, 210-217 (2019).</li><li>Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+benefits+population+growth+of+the+Q+biotype+of+Bemisia+tabaci+(Gennadius)+(Hemiptera:+Aleyrodidae).">Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).</li><li>Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incredible+journey+of+begomoviruses+in+their+whitefly+vector.">The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector.</a> Viruses. 9 (10), 273 (2017).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+development+and+vitellogenin+determine+the+transovarial+transmission+of+begomoviruses.">Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).</li><li>Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+transovarial+transmission+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+by+its+vector,+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci.</a> Virology. 240 (2), 295-303 (1998).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+serological+methods+for+detecting+tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+tomato+plants+and+whiteflies.">Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies.</a> Virology Journal. 10, 142 (2013).</li><li>Arya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+principles+of+real-time+quantitative+PCR.">Basic principles of real-time quantitative PCR.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+cells+in+the+primary+salivary+glands+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+control+retention+and+transmission+of+begomoviruses.">Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses.</a> Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).</li><li>Wang, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagy+pathway+participates+in+resistance+to+tomato+yellow+leaf+curl+virus+infection+in+whiteflies.">The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies.</a> Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).</li><li>Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+2(-Delta+Delta+Ct)+calculation+as+an+alternate+method+of+data+analysis+for+quantitative+PCR+of+BCR-ABL+P210+transcripts.">Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts.</a> Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+gene+selection+for+qRT-PCR+analysis+in+the+sweetpotato+whitefly,+Bemisia+tabaci+(Hemiptera:+Aleyrodidae).">Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).</li></ol>

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Lokalisierung und Quantifizierung eines Begomovirus in den Geweben seines Whitefly-Vektors durch Immunfluoreszenz und qPCR. Die Dissektion stellt den ersten Schritt zur Lokalisierung und Quantifizierung des Virus in Weißfliegengeweben dar. Der Weißfliegenkörper ist etwa 1 mm lang, was bedeutet, dass die Gewebe extrem klein sind, und es ist schwierig, sie zu sezieren. Außerdem gibt es starke Verbindungen zwischen den Geweben. Zum Beispiel sind die Eierstöcke eng mit den Bakterio...

In den letzten Jahrzehnten haben Begomoviren (Gattung Begomovirus, Familie Geminiviridae) schwere Schäden an der Produktion von vielen Pflanzlichen, Fasern und Zierpflanzen weltweit verursacht1. Begomoviren werden in beharrlicher Weise durch die Weißfliege Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) übertragen, die eine komplexe Art mit über 35 kryptischen Arten2,3ist. Begomoviren können direkt oder indirekt Diephysiologie und das Verhalten von Weißfliegen beeinflussen, wie z. B. Fruchtbarkeit4, Langlebigkeit4und Wirtspräferenz5,6. Darüber hinaus variiert die Übertragungseffizienz einer bestimmten Begomovirus-Art/Stamm für verschiedene weißfliegende kryptische Arten auch unter den gleichen experimentellen Bedingungen7,8,9,10, was darauf hindeutet, dass es eine komplexe Wechselwirkung zwischen Begomoviren und Weißfliegen gibt. Um die Mechanismen, die den Wechselwirkungen zwischen Whitefly-Begomovirus zugrunde liegen, besser zu verstehen, sind Lokalisierung und Quantifizierung des Virus in Weißfliegengeweben unerlässlich.
Tomatengelbblatt-Curlvirus (TYLCV) ist ein Begomovirus, das zuerst in Israel berichtet wurde, aber heutzutage schwere Schäden an der Tomatenproduktion weltweit verursacht11,12. Aufgrund seiner wirtschaftlichen Bedeutung ist es eines der am besten untersuchten Begomoviren13. Wie andere monopartitige Begomoviren ist TYLCV ein einsträngiges kreisförmiges DNA-Virus mit einer Genomgröße von etwa 2.800 Nukleotiden14. Während noch diskutiert, mehrere Evidenzlinien unterstützen die Replikation von TYLCV in Weißfliegen15,16,17. Darüber hinaus wurde die Wechselwirkung von TYLCV-Partikeln und Whitefly-Proteinen6,18,19,20berichtet. Für die Virusübertragung erhalten Weißfliegen TYLCV, indem sie sich von virusinfizierten Pflanzen ernähren, Virionen passieren den Nahrungskanal, um die Speiseröhre zu erreichen, dringen in die Mitteldarmwand ein, um die Hämolymphe zu erreichen, und transortisieren sich dann in die primären Speicheldrüsen (PSGs). Schließlich werden Virionen mit Speichel entlang des Speichelkanals in Pflanzenphloem21aufgenommen. Darüber hinaus zeigen mehrere Studien, dass TYLCV transovarial von weiblichen Weißfliegen auf ihre Nachkommen übertragen werden kann22,23. Mit anderen Worten, um eine produktive Übertragung zu erreichen, muss das Virus zelluläre Barrieren innerhalb der Weißfliege überwinden, um sich von einem Gewebe zum anderen zu verlagern. Während des Überschreitens dieser Barrieren sind Wechselwirkungen zwischen Whitefly- und Virusproteinen wahrscheinlich, was wahrscheinlich die Effizienz bestimmt, mit der die Viren übertragen werden.
Immunfluoreszenz ist eine häufig verwendete Technik für die Proteinverteilungsanalyse. Die Spezifität von Antikörpern, die an ihr Antigen binden, bilden die Grundlage der Immunfluoreszenz. Aufgrund der wirtschaftlichen Bedeutung von TYLCV wurden monoklonale Antikörper gegen das TYLCV-Beschichtungsprotein entwickelt, die eine hochempfindliche Möglichkeit bieten, das Virus zu lokalisieren24. Quantitative PCR (qPCR) ermöglicht eine empfindliche und spezifische Quantifizierung von Nukleinsäuren. Diese Technik basiert am häufigsten auf der Verwendung von Hydrolysesonden (z. B. TaqMan) oder Fluoreszenzfarbstoff (z. B. SYBR Green) Detektion. Für hydrolysesondenbasierte qPCR werden spezifische Sonden benötigt, die die Kosten erhöhen. Fluoreszierende Farbstoff-basierte qPCR ist einfacher und kostengünstiger, da markierte ampliconspezifische Hybridisierungssonden nicht erforderlich sind25. Bisher wurden in mehreren Studien Immunfluoreszenz und qPCR zusammen mit anderen Methoden zur Untersuchung der komplexen Begomovirus-Whitefly-Wechselwirkungen verwendet. Zum Beispiel führten Pan et al. qPCR und Immunfluoreszenzanalyse des Virus in Weißfliegengeweben durch und fanden heraus, dass der Unterschied in der Fähigkeit, Tabak-Curly-Shoot-Virus (TbCSV) zwischen den Whitefly-Arten AsiaII 1 und Middle East Asia Minor 1 (MEAM1) zu übertragen, darauf zurückzuführen war, dass das Virus in der Lage war, effizient die Mittelgutwand von AsiaII1, aber nicht MEAM18zu überqueren. In ähnlicher Weise können mediterrane (MED) Weißfliegen tYLCV leicht übertragen, aber sie können das tomatengelbe Blatt Curl China Virus (TYLCCNV) nicht übertragen. Die selektive Übertragung wurde mit Hilfe des Immunfluoreszenznachweises von Viren in den PSGs untersucht, was zeigte, dass TYLCCNV die PSGs von MED Whiteflies26nicht leicht kreuzen. Die Immunfluoreszenzkolokalisierung von TYLCV CP und dem autophagy Marker Protein ATG8-II in Whitefly Midguts zeigt, dass die Autophagie eine entscheidende Rolle bei der Unterdrückung der Infektion von TYLCV im Whitefly27spielt.
Hier beschreiben wir am Beispiel TYLCV ein Protokoll zur Lokalisierung von Begomoviren in Weißfliegen-Midguts, PSGs und Eierstöcken durch eine Immunfluoreszenztechnik. Die Technik umfasst Sezieren, Fixieren und Inkubation mit primären und farbstoffmarkierten sekundären Antikörpern. Fluoreszenzsignale, die die Position viraler Proteine im Weißfliegengewebe anzeigen, können dann unter einem konfokalen Mikroskop nachgewiesen werden. Noch wichtiger ist, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um begomovirale und Whitefly-Proteine zu kolokalisieren. Wir beschreiben ferner ein Protokoll zur Quantifizierung von TYLCV mit SYBR Green-based qPCR in Whitefly Midguts, PSGs, Hämolymphe und Eierstöcken, das verwendet werden kann, um die Virusmenge in verschiedenen Whitefly-Gewebeproben zu vergleichen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>MultiSciences</td>
			<td>F0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole (DAPI)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>MultiSciences</td>
			<td>A3828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>185-5201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-goat anti-mouse</td>
			<td>Earthox</td>
			<td>E032310-02</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody (MAb 1C4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B548119-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820A</td>
			<td>qPCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A41182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissuelyzer</td>
			<td>Shaghai jingxin</td>
			<td>Tissuelyser-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization and quantification of begomoviruses in whitefly tissues by immunofluorescence and quantitative pcr

Begomoviren (Gattung Begomovirus, Geminiviridae)werden von Weißfliegen des Bemisia Tabaci-Komplexes in einer anhaltenden, zirkulierenden Weise übertragen. Angesichts der umfangreichen Schäden, die begomoviren weltweit durch Begomoviren verursacht werden, ist es unerlässlich, die Wechselwirkung zwischen Begomoviren und ihrem Whitefly-Vektor zu verstehen. Dazu ist die Lokalisierung und Quantifizierung des Virus in den Vektorgeweben von entscheidender Bedeutung. Hier beschreiben wir am Beispiel des Tomaten-Gelbblattcurlvirus (TYLCV) ein detailliertes Protokoll zur Lokalisierung von Begomoviren in Weißfliegen-Midguts, primären Speicheldrüsen und Eierstöcken durch Immunfluoreszenz. Die Methode basiert auf der Verwendung spezifischer Antikörper gegen ein Virusbeschichtungsprotein, mit Farbstoff gekennzeichnete Sekundärantikörper und ein konfokales Mikroskop. Das Protokoll kann auch verwendet werden, um begomovirale und Whitefly-Proteine zu kolokalisieren. Wir beschreiben ferner ein Protokoll zur Quantifizierung von TYLCV in Weißfliegen-Midguts, primären Speicheldrüsen, Hämolymphen und Eierstöcken nach quantitativer PCR (qPCR). Mit Primern, die speziell für TYLCV entwickelt wurden, ermöglichen die Protokolle zur Quantifizierung den Vergleich der TYLCV-Menge in verschiedenen Geweben der Weißfliege. Das beschriebene Protokoll ist potenziell nützlich für die Quantifizierung von Begomoviren im Körper einer Weißfliege und einer virusinfizierten Pflanze. Diese Protokolle können verwendet werden, um den Zirkulationsweg von Begomoviren in der Weißfliege zu analysieren oder als Ergänzung zu anderen Methoden zur Untersuchung von Whitefly-Begomovirus-Wechselwirkungen.

Die MEAM1 Whiteflies des B. tabaci Komplexes und TYLCV wurden hier als Beispiel verwendet, um die Verfahren zu beschreiben. Abbildung 1zeigt die in diesem Manuskript beschriebenen Immunfluoreszenz- und viralen Quantifizierungsverfahren. Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse des Immunfluoreszenznachweises von TYLCV- und DAPI-Färbung in PSGs, Mittelgut und Eierstöcken, was darauf hindeutet, dass sich TYLCV in den PSGs und Midguts mehr angesammelt...

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Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

Wir beschreiben eine Immunfluoreszenz und quantitative PCR-Methode zur Lokalisierung und Quantifizierung von Begomoviren in Insektengeweben. Das Immunfluoreszenzprotokoll kann zur Kolokalisierung viraler und vektorieller Proteine verwendet werden. Das quantitative PCR-Protokoll kann erweitert werden, um Viren in ganzen Weißfliegenkörpern und virusinfizierten Pflanzen zu quantifizieren.

Lokalisation und Quantifizierung von Begomoviren in Whitefly-Geweben durch Immunfluoreszenz und quantitative PCR

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. ...

Die Klärung der Räumlichkeit und Menge des Virus in Whitefly-Vektoren kann helfen, Begomovirus-Whitefly-Wechselwirkungen zu verstehen und neuartige Strategien zur Bekämpfung schwerer begomoviraler Erkrankungen zu entwickeln. Die Vorteile dieser Technik sind, dass wir Whitefly-Gewebe schnell isolieren, virale und Whitefly-Proteine kolokalisieren und Viren in Weißenfliegen-Ganzenkörpern und virusinfizierten Pflanzen quantifizieren können. Zum entsprechenden experimentellen Zeitpunkt, nach der Viruserfassung, legen Sie eisbetäuste weibliche Weißfliegen in einen Tropfen PBS auf einem Mikroskopschlitten und verwenden Sie eine feine Akupunkturnadel, um den Bauch der Weißfliege unter einem Stereomikroskop zu öffnen.Verwenden Sie die Nadel, um das Midgut zu extrahieren und legen Sie das Midgut in eine Sammelschale von PBS. Um die PSGs zu sammeln, teilen Sie den Körper am Thorax von der Rückenseite in der Nähe des Kopfes und fixieren Sie die Weißfliege mit einer Nadel durch den Thorax. Verwenden Sie eine zweite Nadel, um die Weißfliege zu schütteln, bis die beiden Speicheldrüsen vom Körper getrennt sind und übertragen Sie die Drüsen auf eine neue Schale von PBS.Um die Eierstöcke zu sammeln, öffnen Sie den Bauch vollständig und verwenden Sie eine Nadel, um die Eierstöcke von den anderen Geweben zu trennen. Verwenden Sie eine Pipette, um das überschüssige Gewebe zu entfernen und die Eierstöcke in eine neue Schale von PBS zu übertragen. Um eine Hämolympierprobe zu sammeln, fügen Sie 10 Mikroliter PBS auf ein neues Mikroskopschlitten und legen Sie eine neue Weißfliege in das Tröpfchen.Verwenden Sie eine feine Akupunkturnadel, um sanft ein Loch im Bauch zu machen. Dann einen leichten Druck auf den Bauch ausüben, um die Hämolymphe in den Puffer freizusetzen und eine acht Mikroliter Probe der Flüssigkeit zu sammeln. Um die TYLCV-Lokalisation in geernteten Weißfliegen PSG, Midgut oder Eierstockgeweben zu visualisieren, übertragen Sie 15 bis 20 Exemplare in eine 3,5 Zentimeter lange Glas-Petrischale und saugen den überschüssigen Puffer ab.Fixieren Sie das Gewebe in einem Milliliter 4%Paraformaldehyd für zwei Stunden bei Raumtemperatur, bevor Sie die Proben dreimal für zwei Minuten in einem Milliliter frischer TBS pro Wäsche sorgfältig waschen. Nach der letzten Wäsche die Proben mit einem Milliliter 0,5%Triton X-100 30 Minuten lang permeabilisieren, bevor sie dreimal gewaschen werden, wie gerade mit einem Milliliter TBST pro Wäsche gezeigt wurde. Nach der letzten Wäsche jede unspezifische Bindung mit einem Milliliter 1%Rinderserumalbumin für zwei Stunden bei Raumtemperatur blockieren, gefolgt von drei Wäschen in TBST, wie gezeigt.Nach der letzten Wäsche die Zellen mit den primären Antikörpern von Interesse über Nacht bei vier Grad Celsius vor Licht geschützt kennzeichnen. Am nächsten Morgen die Proben dreimal mit TBST waschen, bevor Sie die entsprechenden Sekundärantikörper für zwei Stunden bei Lichtschutz im Raum hinzufügen. Am Ende der Inkubation die Mittelguts dreimal waschen und die Proben auf ein sauberes Mikroskopschlitten übertragen.Entfernen Sie so viel Puffer wie möglich und färben Sie die Kerne mit einem Tropfen DAPI, bevor Sie mit einem Deckelbeschlag montieren und die beschrifteten Gewebe durch konfokale Mikroskopie untersuchen. Für die TYLCV-Quantifizierung die geernteten Weißfliegengewebeproben zwei- bis dreimal in frischem PBS waschen und 20 Mittelguts, 20 PSGs oder einen Eierstock in fünf Mikroliter PBS in einzelne PCR-Röhren mit 25 Mikroliter Lyselösung übertragen. Fügen Sie fünf bis sieben Zwei-Millimeter-Keramikperlen zu jedem Rohr hinzu und schleifen Sie die Proben in einem Homogenisator.Fügen Sie eine Acht-Mikroliter-Probe Hämolympium in eine neue PCR-Röhre und fügen Sie 10 Mikroliter Lyse in das Rohr mit gründlicher Mischung. Inkubieren Sie alle Proben bei 65 Grad Celsius für eine Stunde, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei 100 Grad Celsius und einer kurzen Zentrifugation. Als nächstes fügen Sie 18 Mikroliter Master-Mix in die Durchstechflaschen der quantitativen PCR-Streifenröhren und fügen Sie zwei Mikroliter jeder DNA-Probe zu mindestens drei Durchstechflaschen hinzu.Wenn alle Proben geladen sind, schließen Sie die Rohre und zentrifugen, um die Lösung am Boden jeder Durchstechflasche zu sedimentieren. Laden Sie die Durchstechflaschen auf einen Echtzeit-Thermocycler für quantitative PCR, indem Sie Cyber als Fluorophorfarbstoff und unbekannt als Probentyp auswählen. Exportieren Sie dann die quantitativen Daten in eine Tabelle zur Analyse der relativen Menge der viralen DNA in jeder Probe.Hier werden repräsentative Bilder von TYLCV in DAPI-Färbung in Whitefly PSGs, Midguts und Eierstöcken gezeigt. Wie beobachtet, zeigt TVLCV eine größere Akkumulation innerhalb der PSGs und Midguts als in den Eierstöcken. Die Quantifizierung des Virus in Whitefly PSGs, Midguts, Hämolymphe und Eierstöcken nach der Fütterung mit TYLCV-infizierten Tomaten für 24, 48 und 72 Stunden zeigt an, dass die Virusmenge in verschiedenen Weißfliegengeweben in direkter Korrelation mit der Zunahme des Zugangszeitraums für den Erwerb zunimmt.Es ist am besten, frische Weißfliegen zu verwenden, da tote Insekten die Schwierigkeit der Sezieren erhöhen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Analysen, wie Western Blotting und Co-Immunoprecipitation, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur viralen Proteinexpression und viralen und Vektorprotein-Wechselwirkungen zu beantworten.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Nachweis von microRNAs in Mikroglia durch Real-time PCR in Normal-und ZNS Während Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluoreszenz<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierungen (FISH) für die Lokalisierung von Viren und Bakterien in Endosymbiotic Pflanzen-und Insekten Gewebe

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Simultane Quantifizierung von T-Zell-Rezeptor-Excision Kreis (TRECs) und K-Löschen Rekombination Excision Kreis (KRECs) durch Echtzeit-PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Entwicklung und Validierung einer quantitativen PCR-Methode für Equiden Herpesvirus-2-Diagnose in Atem Flüssigkeiten

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Genotypisierung<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Durch ribosomalen Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Hochdurchsatz-Nachweis von Respiratory Pathogens in Tier Proben durch nanoskalige PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Metabolische Mapping: Quantitative Enzym Cytochemistry und Histochemie die Aktivität des Dehydrogenases in Zellen und Geweben zu bestimmen

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

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Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

Quantitative PCR von Bakteriophagen T7 aus Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Induktion und Bewertung der Graft-Versus-Host-Krankheit in einem xenogenen Murine-Modell und Quantifizierung menschlicher T-Zellen in Mausgeweben mit digitaler PCR

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...