Name: localization and quantification of begomoviruses in whitefly tissues by immunofluorescence and quantitative pcr
Uploaded: 2020-02-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי (מספר גרנט: 2017YFD0200600), הקרן מיועד למחקר החקלאות סין מערכת (מספר מענק: מכוניות 23-D07) ואת ביל & מלינדה גייטס קרן (מזהה השקעה OPP1149777 ). אנו מודים לפרופסור ג'יאן-שיאנג וו למתן נוגדנים TYLCV CP.

1. whitefly, וירוס, צמחים, ורכישת הווירוס
<ol><li>להלבין האחורי (MEAM1) על כותנה (Gossypium שעירות קורות חיים. zhemian 1793) בכלובים הוכחה חרקים בחממה ב 26 ± 1 ° צ' עם אור 14:10: מחזור כהה 60 ± 10% לחות יחסית.</li>
	<li>לבצע ה-PCR המקובלת על בסיס אוקסידאז מיטוכונדריאלי כרום הגנים כדי לקבוע את טוהר האוכלוסיה הלבנה.<ol>
<li>לאסו?...

<ol>
	<li>Rojas, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+management+of+geminiviruses.">World management of geminiviruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).</li><li>De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bemisia+tabaci:+a+statement+of+species+status.">Bemisia tabaci: a statement of species status.</a> Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).</li><li>Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+virus+diseases+transmitted+by+whiteflies.">Emerging virus diseases transmitted by whiteflies.</a> Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+infection+of+tobacco+plants+improves+performance+of+Bemisia+tabaci+but+more+so+for+an+invasive+than+for+an+indigenous+biotype+of+the+whitefly.">Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).</li><li>Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+effects+of+a+begomovirus+infection+and+host+plant+resistance+on+the+preference+and+development+of+an+insect+vector,+Bemisia+tabaci,+and+implications+for+epidemics.">Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics.</a> PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+alters+the+host+preferences+of+its+vector+Bemisia+tabaci.">Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci.</a> Scientific Reports. 3, 2876 (2013).</li><li>Guo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+transmission+of+papaya+leaf+curl+China+virus+among+four+cryptic+species+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+complex.">Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex.</a> Scientific Reports. 5, 15432 (2015).</li><li>Pan, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+efficiency+of+a+begomovirus+to+cross+the+midgut+of+different+species+of+whiteflies+results+in+variation+of+virus+transmission+by+the+vectors.">Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors.</a> Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).</li><li>Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+leaf+curl+disease:+which+whitefly+is+the+vector.">Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector.</a> Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).</li><li>Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+begomoviruses+and+other+whitefly-borne+viruses:+dependence+on+the+vector+species.">Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species.</a> Phytopathology. , (2019).</li><li>Cohen, S., Nitzany, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+and+host+range+of+the+tomato+yellow+leaf+curl+virus.">Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus.</a> Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).</li><li>Moriones, E., Navas-Castillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus,+an+emerging+virus+complex+causing+epidemics+worldwide.">Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide.</a> Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).</li><li>Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+mechanisms+and+components+that+determine+the+transmission+efficiency+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+(Geminiviridae;+Begomovirus)+by+its+whitefly+vector.">A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector.</a> Virus Research. 186, 47-54 (2014).</li><li>Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+-+a+whitefly-transmitted+geminivirus+with+a+single+genomic+component.">Tomato yellow leaf curl virus - a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component.</a> Virology. 185 (1), 151-161 (1991).</li><li>Sanchez-Campos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus:+No+evidence+for+replication+in+the+insect+vector+Bemisia+tabaci.">Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci.</a> Scientific Reports. 6, 30942 (2016).</li><li>Pakkianathan, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+its+whitefly+vector,+Bemisia+tabaci.">Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci.</a> Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).</li><li>Rodriguez-Negrete, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+the+quantification+of+virion-sense+and+complementary-sense+DNA+strands+of+circular+single-stranded+DNA+viruses.">A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses.</a> Scientific Reports. 4, 6438 (2014).</li><li>Gotz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+Bemisia+tabaci+heat+shock+protein+70+in+Begomovirus-whitefly+interactions.">Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).</li><li>Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+whitefly+vesicle+associated+membrane+protein-associated+protein+B+in+the+transmission+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus.">Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus.</a> Virology. 535, 210-217 (2019).</li><li>Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+benefits+population+growth+of+the+Q+biotype+of+Bemisia+tabaci+(Gennadius)+(Hemiptera:+Aleyrodidae).">Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).</li><li>Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incredible+journey+of+begomoviruses+in+their+whitefly+vector.">The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector.</a> Viruses. 9 (10), 273 (2017).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+development+and+vitellogenin+determine+the+transovarial+transmission+of+begomoviruses.">Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).</li><li>Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+transovarial+transmission+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+by+its+vector,+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci.</a> Virology. 240 (2), 295-303 (1998).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+serological+methods+for+detecting+tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+tomato+plants+and+whiteflies.">Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies.</a> Virology Journal. 10, 142 (2013).</li><li>Arya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+principles+of+real-time+quantitative+PCR.">Basic principles of real-time quantitative PCR.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+cells+in+the+primary+salivary+glands+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+control+retention+and+transmission+of+begomoviruses.">Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses.</a> Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).</li><li>Wang, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagy+pathway+participates+in+resistance+to+tomato+yellow+leaf+curl+virus+infection+in+whiteflies.">The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies.</a> Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).</li><li>Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+2(-Delta+Delta+Ct)+calculation+as+an+alternate+method+of+data+analysis+for+quantitative+PCR+of+BCR-ABL+P210+transcripts.">Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts.</a> Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+gene+selection+for+qRT-PCR+analysis+in+the+sweetpotato+whitefly,+Bemisia+tabaci+(Hemiptera:+Aleyrodidae).">Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).</li></ol>

כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור לוקליזציה וכימות של וירוס באגאוטיות ברקמות של וקטור להלבין שלה על ידי immunofluorescence סנס ו-qPCR. חיתוך מייצג את הצעד הראשון לוקליזציה ולכמת את הנגיף ברקמות להלבין. הגוף הלבן הוא כ 1 מ"מ באורך, כלומר הרקמות קטנות מאוד, וקשה לנתח אותם. חוץ מזה, יש קשרים. חזקים בין הרקמות לד...

בעשורים האחרונים, וירוסים (סוג של וירוסבימודוללי, משפחה גמניריתיים) גרמו נזק חמור לייצור של ירקות רבים, סיבים, וגידולים דקורטיביים ברחבי העולם1. וירוסים משודרים באופן מתמשך על ידי המיסיה הבוטטיות של הטבק , שהוא מינים מורכבים המכילים מעל 35 מינים מסתורית2,3. וירוסים יכול להשפיע ישירות או בעקיפין על פיזיולוגיה והתנהגות של כנימה, כגון פוריות4, אריכות ימים4, והעדפה מארחים5,6. יתר על כן, את היעילות השידור של מינים וירוסים מסוג מסוים/זן משתנה עבור מינים שונים הנסתר להלבין גם תחת אותם תנאים ניסיוני7,8,9,10, המציין כי יש אינטראקציה מורכבת בין וירוסים באגאוטיות ו כנימה. כדי להבין טוב יותר את המנגנונים שבבסיס האינטראקציות להלבין וירוס, לוקליזציה וכימות הווירוס ברקמות כנימה חיוניים.
עגבניות העלה צהוב וירוס תלתל (TYLCV) הוא וירוס באגאומודוללי שדווחו לראשונה בישראל אך כיום גורם נזק חמור לייצור עגבניות ברחבי העולם11,12. בשל חשיבותו הכלכלית, הוא אחד הווירוסים הטובים ביותר שנחקרו13. כמו אחרים וירוסים באגאופית אחרים, TYLCV הוא וירוס בודד ומעגלי DNA עם גודל הגנום של כ 2,800 נוקלאוטידים14. תוך כדי דיון, כמה שורות של ראיות תומכות השכפול של TYLCV ב whiteflies15,16,17. יתר על כן, האינטראקציה של חלקיקים TYLCV וחלבונים כנימה דווחו6,18,19,20. עבור העברת וירוסים, whiteflies לרכוש TYLCV על ידי האכלה על צמחים נגועים וירוס, הרימונים לעבור לאורך תעלת המזון כדי להגיע הוושט, לחדור את הקיר באמצע המעיים כדי להגיע המוליקמ, ולאחר מכן העברת לתוך בלוטות הרוק הראשי (PSGs). לבסוף, הריטונים מואגרים עם רוק לאורך תעלת הרוק לתוך הצמח שיפה21. יתרה מזאת, מספר מחקרים מראים כי TYLCV מסוגל להיות transovarially ששודרו נקבה whiteflies לצאצאיהם22,23. במילים אחרות, כדי להשיג שידור פרודוקטיבי, הווירוס יש להתגבר על מחסומים סלולריים בתוך הלבנה כדי לאתר מרקמה אחת לאחרת. במהלך המעבר של מחסומים אלה, האינטראקציות בין חלבונים להלבין ווירוסים צפויים להתרחש, כנראה קביעת היעילות שבה הווירוסים משודרים.
אימונואופלובורנציה היא טכניקה נפוצה לניתוח הפצת חלבונים. הספציפיות של כריכת נוגדנים לאנטיגן שלהם מהווים את הבסיס לאימונולובורנציה. בשל המשמעות הכלכלית של TYLCV, נוגדנים חד שבטיים נגד חלבון הפרווה TYLCV פותחו, המציע דרך רגישה מאוד כדי להתאים את הווירוס24. ה-PCR הכמותי (qPCR) מאפשר כימות רגישות וספציפיות של חומצות גרעין. טכניקה זו מבוססת בתדירות גבוהה על השימוש במחקר הידרוליזה (למשל, TaqMan) או צבע פלורסנט (למשל, SYBR גרין) זיהוי. עבור הידרוליזה בדיקה qPCR מבוססי, הבדיקות הספציפיות הם נחוצים, אשר כתוצאה מכך להגדיל את העלות. פלורסנט מבוססי לצבוע qPCR הוא פשוט יותר וחסכוני יותר, כי התווית בדיקה היברידיתים ספציפיים של הכלאה אינם נדרשים25. עד כה, מספר מחקרים השתמשו immunofluorescence ו qPCR יחד עם שיטות אחרות כדי לחקור את הקשר המורכב וירוס מורכב ולהלבין. לדוגמה, פאן et al ביצע qpcr ניתוח אימונוoforסנס של הנגיף ברקמות כנימה ומצא כי ההבדל ביכולת לשדר טבק מתולתל לירות וירוס (tbcsv) בין מינים כנימה asiaii 1 ואת המזרח התיכון אסיה מינור 1 (MEAM1) היה בשל הווירוס להיות מסוגל ביעילות לחצות אתהקיר פיתול של באופן דומה, בעוד הים התיכון (MED) להלבין יכול בקלות להעביר TYLCV, הם נכשלים לשדר עגבניות עלה צהוב תלתל וירוס בסין (TYLCCNV). שידור סלקטיבי נחקר באמצעות זיהוי immunofluorescence של וירוס ב-PSGs, אשר הראה כי TYLCCNV לא בקלות לחצות את PSGs של MED להלבין26. Immunofluorescence לוקליזציה של TYLCV CP ואת החלבון האוטומטי סמן הסימון ATG8-II ב-midefly המעיים מראה כי באופן אוטומטי משחק תפקיד קריטי ב לדכא את הזיהום של TYLCV ב-27whitly.
כאן, באמצעות TYLCV כדוגמה, אנו מתארים פרוטוקול עבור הלוקליזציה של וירוסים באגאוטיות ב מידולי מידות, PSGs, והשחלות על ידי טכניקה immunofluorescence. הטכניקה כוללת ניתוח, קיבוע ודגירה עם נוגדנים משניים בעלי התווית הראשית והצבע. אותות פלואורסצנטית מראה את המיקום של חלבונים ויראלי ברקמות להלבין ניתן לזהות במיקרוסקופ קונפוקלית וקד. חשוב מכך, פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי להתאים את החלבונים באמצעות ויראלי להלבין. אנחנו עוד לתאר את הפרוטוקול עבור כימות TYLCV באמצעות מבוססי sybr הירוק qpcr ב-midefly מידות, psgs, המוליקמ, והשחלות, כי ניתן להשתמש כדי להשוות את כמות הווירוס בדגימות שונות רקמת כנימה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>MultiSciences</td>
			<td>F0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole (DAPI)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>MultiSciences</td>
			<td>A3828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>185-5201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-goat anti-mouse</td>
			<td>Earthox</td>
			<td>E032310-02</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody (MAb 1C4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B548119-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820A</td>
			<td>qPCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A41182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissuelyzer</td>
			<td>Shaghai jingxin</td>
			<td>Tissuelyser-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization and quantification of begomoviruses in whitefly tissues by immunofluorescence and quantitative pcr

וירוסים (סוג של וירוס, משפחה גמביתיים) משודרים על ידי ויטאווניים של מתחם הטבק הבומיסיה באופן מתמשך, circulative. בהתחשב בנזק הנרחב שנגרם על-ידי וירוסים לחיתוך הייצור ברחבי העולם, זה הכרחי להבין את האינטראקציה בין וירוסים באגאוטיות לבין וקטור כנימה שלהם. לשם כך, לוקליזציה וקוונפיקציה של הנגיף ברקמות וקטורי הוא קריטי. כאן, באמצעות עגבניה צהוב עלה וירוס תלתל (TYLCV) כדוגמה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט כדי להתאים וירוסים בתוך מידות בינוני, בלוטות הרוק הראשי, והשחלות על ידי immunofluorescence. השיטה מבוססת על שימוש בנוגדנים ספציפיים נגד חלבון מעיל וירוס, נוגדנים משניים המסומנים בצבע, ו מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. הפרוטוקול יכול לשמש גם כדי להתאים את החלבונים באמצעות ויראלי להלבין. אנו מתארים עוד פרוטוקול עבור כימות של TYLCV ב midefly מידות, בלוטות הרוק הראשי, המוליקמ, והשחלות על ידי ה-PCR כמותי (qPCR). באמצעות התחל שתוכנן במיוחד עבור TYLCV, הפרוטוקולים עבור כימות לאפשר השוואה של כמות TYLCV ברקמות שונות של הלבנה. הפרוטוקול המתואר הוא שימושי פוטנציאל לכמת של וירוסים בתוך הגוף של להלבין ומפעל נגוע בווירוס. פרוטוקולים אלה ניתן להשתמש כדי לנתח את מסלול המחזור של וירוסים בהאגאוטיות ב כנימה או כהשלמה לשיטות אחרות כדי ללמוד אינטראקציות וירוס להלבין.

MEAM1 להלבין את מורכבות B. עש ו TYLCV שימשו לדוגמה כאן כדי לתאר את ההליכים. הסקירה של התהליכים האימונולואוליים והליכי הקוונפיקציה המתוארים בכתב יד זה מוצגים באיור 1. איור 2 מציג את התוצאות הייצוגיות של זיהוי immunofluorescence של TYLCV ו dapi הצביעת ב psgs, מידות המעיים, והשח...

Watch this Scientific Journal Video about Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR at JoVE.com

Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

אנו מתארים שיטת ה-PCR הכמותית וכמותית ללוקליזציה וכימות של וירוסים ברקמות החרקים. ניתן להשתמש בפרוטוקול האימונוללונציה כדי להתאים חלבונים וקטוריים ומוקטורים. הפרוטוקול PCR כמותי ניתן להאריך כדי לכמת וירוסים בגופים שלמים כנימה וצמחים נגועים בווירוס.

לוקליזציה וקוונפיקציה של וירוסים באגאוטיות ברקמות Whitefly על ידי Immunofluorescence ו-PCR כמותי

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. ...

הבהרת המרחביות וכמות הנגיף בווקטורים לבנים יכולה לסייע בהבנת אינטראקציות begomovirus-whitefly ובפיתוח אסטרטגיות חדשניות לשליטה במחלות begomoviral חמורות. היתרונות של טכניקה זו הם שאנחנו יכולים לבודד במהירות רקמות whitefly, שיתוף לוקליזציה חלבונים ויראליים לבןfly, ולכרות וירוסים בגופים שלמים לבן וצמחים נגועים בווירוסים. בנקודת הזמן הניסיונית המתאימה, לאחר רכישת הנגיף, מניחים את הגחליליות הלבנות שעברו הרדמה בקרח לטיפה של PBS בשקופית מיקרוסקופ ולהשתמש במחט דיקור עדין כדי לפתוח את הבטן של הגחלילית הלבנה תחת מיקרוסקופ סטריאו.השתמש במחט כדי לחלץ את midgut ולהניח את midgut לתוך צלחת אוסף של PBS. כדי לאסוף את PSGs, לפצל את הגוף בבית החזה מהצד הגבי ליד הראש ולתקן את whitefly עם מחט דרך בית החזה. השתמש מחט שנייה כדי לנער את הזבוב הלבן עד שתי בלוטות הרוק מופרדים מהגוף ולהעביר את הבלוטות לצלחת חדשה של PBS.כדי לאסוף את השחלות, לפתוח לחלוטין את הבטן ולהשתמש במחט כדי להפריד את השחלות מן הרקמות האחרות. השתמש פיפטה כדי להסיר את הרקמה העודפת ולהעביר את השחלות לתוך צלחת חדשה של PBS. כדי לאסוף מדגם המולימפה, להוסיף 10 microliters של PBS על שקופית מיקרוסקופ חדש ולמקום לבן חדש לתוך טיפה.השתמש מחט דיקור עדין בעדינות לעשות חור בבטן. לאחר מכן להחיל לחץ קל על הבטן כדי לשחרר את ההמולימפות לתוך החיץ ולאסוף מדגם שמונה microliter של הנוזל. כדי לדמיין לוקליזציה של TYLCV ברקמות פ.ס.ז', מידגוט או השחלות שנקטפו, העבר 15 עד 20 דגימות לצלחת פטרי זכוכית באורך 3.5 ס"מ ושאוף את המאגר העודף.תקן את הרקמות במיליליטר אחד של 4% paraformaldehyde במשך שעתיים בטמפרטורת החדר לפני בזהירות לשטוף את הדגימות שלוש פעמים במשך שתי דקות במיליליטר אחד של TBS טרי לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, לחלחל את הדגימות עם מיליליטר אחד של 0.5% טריטון X-100 במשך 30 דקות לפני הכביסה שלוש פעמים כפי שהוכח רק עם מיליליטר אחד של TBST לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, לחסום כל כריכה לא ספציפית עם מיליליטר אחד של אלבומין סרום 1%bovine במשך שעתיים בטמפרטורת החדר ואחריו שלוש שטיפות ב- TBST כפי שהוכח.לאחר הכביסה האחרונה, תייג את התאים בנוגדנים העיקריים המעניינים בן לילה בארבע מעלות צלזיוס המוגנים מפני אור. למחרת בבוקר, לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם TBST לפני הוספת נוגדנים משניים המתאימים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, לשטוף את midguts שלוש פעמים ולהעביר את הדגימות לשקופית מיקרוסקופ נקי.הסר מאגר רב ככל האפשר ולהכתים את הגרעינים עם טיפה אחת של DAPI לפני הרכבה עם כיסוי ובחינת הרקמות המסוותוויות על ידי מיקרוסקופיה קונפוקאלית. לכימות TYLCV, שטפו את דגימות רקמת הזבוב הלבן שנקטפו פעמיים עד שלוש פעמים ב-PBS טרי והעבירו 20 מיקרו-רובוטים, 20 PSGs או שחלה אחת בחמישה מיקרוליטרים של PBS לצינורות PCR בודדים המכילים 25 מיקרוליטרים של תותבת. מוסיפים חמישה עד שבעה חרוזים קרמיים בקוטר 2 מ"מ לכל צינור וטוחנים את הדגימות בהומוגניזר.הוסף דגימה אחת של שמונה מיקרוליטר של המולימפה לתוך צינור PCR חדש ולהוסיף 10 microliters של תזה לצינור עם ערבוב יסודי. דגירה כל הדגימות ב 65 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת ואחריו דגירה של 10 דקות ב 100 מעלות צלזיוס וצנטריפוגה קצרה. לאחר מכן, הוסיפו 18 מיקרוליטרים של תערובת אב לבקבוקונים של צינורות פס PCR כמותיים והוסיפו שני מיקרוליטרים של כל דגימת דנ"א לשלושה בקבוקונים לפחות.כאשר כל הדגימות נטענו, סגור את הצינורות ואת הצנטריפוגה כדי להזרים את הפתרון בתחתית כל בקבוקון. לטעון את הבקבוקונים על רוכב מחזור תרמי בזמן אמת עבור PCR כמותי, בחירת סייבר כצבע פלואורופור ולא ידוע כמו סוג המדגם. לאחר מכן לייצא את הנתונים הכמותיים לגיליון אלקטרוני לניתוח הכמות היחסית של DNA ויראלי בכל דגימה.כאן, תמונות מייצגות של TYLCV בכתמי DAPI ב PSGs לבן, midguts, ושחלות מוצגים. כפי שנצפה, TVLCV מדגים הצטברות גדולה יותר בתוך PSGs ו midguts מאשר בשחלות. כימות הנגיף ב- PSGs לבן, midguts, hemolymph, ושחלות לאחר האכלה על עגבניות נגועות TYLCV במשך 24, 48, ו 72 שעות עולה כי כמות הנגיף עולה ברקמות שונות של לבןfly בקורלציה ישירה לעלייה בתקופת הגישה לרכישה.עדיף להשתמש לבנים טריים, כמו חרקים מתים יגדיל את הקושי של ניתוח. בעקבות הליך זה, ניתוחים אחרים, כמו כתמים מערביים ושיתוף immunoprecipitation, ניתן לבצע כדי לענות על שאלות נוספות על ביטוי חלבון ויראלי אינטראקציות חלבון ויראלי וקטור.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

זיהוי של מיקרו RNA ב microglia על ידי Real-time PCR ב CNS רגיל ובמהלך Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

פלואורסצנציה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאות (דגים) ללוקליזציה של וירוסים וחיידקים Endosymbiotic בצמח ורקמות חרקים

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

כימות סימולטני של מעגלי קולטן כריתת T-Cell (TRECs) ומעגלי K-מחיקת רקומבינציה כריתה (KRECs) על ידי בזמן אמת PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

פיתוח ותיקוף של שיטת ה- PCR כמותי עבור Equid ההרפס-2 אבחון בנוזלי הנשימה

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotyping של<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; על ידי ריבוזומלי Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

איתור תפוקה גבוהה של פתוגנים הנשימה בדגימות בעלי חיים על ידי ננו PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

מיפוי מטבולית: אנזים כמותית Cytochemistry ו להסטולוגיה כדי לקבוע את הפעילות של Dehydrogenases של תאים ורקמות

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

PCR כמותי של T7 Bacteriophage מ- Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

אינדוקציה והבקיע של מחלת השתל מול מארחים ב מודל Murine מורה Xenoic ו כימות האדם תאים T ברקמות העכבר באמצעות PCR דיגיטלי

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...