Name: localization and quantification of begomoviruses in whitefly tissues by immunofluorescence and quantitative pcr
Uploaded: 2020-02-08T12:00:00
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この研究は、国家主要研究開発プログラム(助成金番号:2017YFD0200600)、中国農業研究システム(助成金番号:CARS-23-D07)とビル&メリンダ・ゲイツ財団(投資ID OPP1149777)の目印基金によって支援されました。).TYLCV CP抗体を提供してくれたジャンシャン・ウー教授に感謝します。

1. ホワイトフライ、ウイルス、植物、ウイルスの獲得
<ol><li>綿の後部白身フライ(MEAM1)(Gosypiumhirsutum cv.Zhemian 1793)は、14:10の光:暗いサイクルと60±10%の相対湿度で26±1 °Cの温室の防虫ケージに入れた。</li>
	<li>ホワイトフライミトコンドリアシトクロムオキシダーゼI遺伝子に基づく従来のPCRを行い、ホワイトフライ集団の純度を決定する。<ol>
<li>20個の成体白いハエを集め、30 μLのリシス...

<ol>
	<li>Rojas, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+management+of+geminiviruses.">World management of geminiviruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).</li><li>De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bemisia+tabaci:+a+statement+of+species+status.">Bemisia tabaci: a statement of species status.</a> Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).</li><li>Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+virus+diseases+transmitted+by+whiteflies.">Emerging virus diseases transmitted by whiteflies.</a> Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+infection+of+tobacco+plants+improves+performance+of+Bemisia+tabaci+but+more+so+for+an+invasive+than+for+an+indigenous+biotype+of+the+whitefly.">Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).</li><li>Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+effects+of+a+begomovirus+infection+and+host+plant+resistance+on+the+preference+and+development+of+an+insect+vector,+Bemisia+tabaci,+and+implications+for+epidemics.">Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics.</a> PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+alters+the+host+preferences+of+its+vector+Bemisia+tabaci.">Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci.</a> Scientific Reports. 3, 2876 (2013).</li><li>Guo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+transmission+of+papaya+leaf+curl+China+virus+among+four+cryptic+species+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+complex.">Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex.</a> Scientific Reports. 5, 15432 (2015).</li><li>Pan, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+efficiency+of+a+begomovirus+to+cross+the+midgut+of+different+species+of+whiteflies+results+in+variation+of+virus+transmission+by+the+vectors.">Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors.</a> Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).</li><li>Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+leaf+curl+disease:+which+whitefly+is+the+vector.">Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector.</a> Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).</li><li>Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+begomoviruses+and+other+whitefly-borne+viruses:+dependence+on+the+vector+species.">Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species.</a> Phytopathology. , (2019).</li><li>Cohen, S., Nitzany, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+and+host+range+of+the+tomato+yellow+leaf+curl+virus.">Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus.</a> Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).</li><li>Moriones, E., Navas-Castillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus,+an+emerging+virus+complex+causing+epidemics+worldwide.">Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide.</a> Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).</li><li>Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+mechanisms+and+components+that+determine+the+transmission+efficiency+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+(Geminiviridae;+Begomovirus)+by+its+whitefly+vector.">A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector.</a> Virus Research. 186, 47-54 (2014).</li><li>Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+-+a+whitefly-transmitted+geminivirus+with+a+single+genomic+component.">Tomato yellow leaf curl virus - a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component.</a> Virology. 185 (1), 151-161 (1991).</li><li>Sanchez-Campos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus:+No+evidence+for+replication+in+the+insect+vector+Bemisia+tabaci.">Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci.</a> Scientific Reports. 6, 30942 (2016).</li><li>Pakkianathan, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+its+whitefly+vector,+Bemisia+tabaci.">Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci.</a> Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).</li><li>Rodriguez-Negrete, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+the+quantification+of+virion-sense+and+complementary-sense+DNA+strands+of+circular+single-stranded+DNA+viruses.">A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses.</a> Scientific Reports. 4, 6438 (2014).</li><li>Gotz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+Bemisia+tabaci+heat+shock+protein+70+in+Begomovirus-whitefly+interactions.">Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).</li><li>Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+whitefly+vesicle+associated+membrane+protein-associated+protein+B+in+the+transmission+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus.">Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus.</a> Virology. 535, 210-217 (2019).</li><li>Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+benefits+population+growth+of+the+Q+biotype+of+Bemisia+tabaci+(Gennadius)+(Hemiptera:+Aleyrodidae).">Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).</li><li>Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incredible+journey+of+begomoviruses+in+their+whitefly+vector.">The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector.</a> Viruses. 9 (10), 273 (2017).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+development+and+vitellogenin+determine+the+transovarial+transmission+of+begomoviruses.">Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).</li><li>Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+transovarial+transmission+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+by+its+vector,+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci.</a> Virology. 240 (2), 295-303 (1998).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+serological+methods+for+detecting+tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+tomato+plants+and+whiteflies.">Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies.</a> Virology Journal. 10, 142 (2013).</li><li>Arya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+principles+of+real-time+quantitative+PCR.">Basic principles of real-time quantitative PCR.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+cells+in+the+primary+salivary+glands+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+control+retention+and+transmission+of+begomoviruses.">Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses.</a> Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).</li><li>Wang, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagy+pathway+participates+in+resistance+to+tomato+yellow+leaf+curl+virus+infection+in+whiteflies.">The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies.</a> Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).</li><li>Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+2(-Delta+Delta+Ct)+calculation+as+an+alternate+method+of+data+analysis+for+quantitative+PCR+of+BCR-ABL+P210+transcripts.">Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts.</a> Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+gene+selection+for+qRT-PCR+analysis+in+the+sweetpotato+whitefly,+Bemisia+tabaci+(Hemiptera:+Aleyrodidae).">Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).</li></ol>

ここでは、免疫蛍光およびqPCRによるホワイトフライベクターの組織におけるベゴモウイルスの局在化および定量化のためのプロトコルについて説明する。解剖は、ホワイトフライ組織におけるウイルスを局所化し、定量化するための最初のステップを表す。ホワイトフライの体は長さが約1mmで、組織が非常に小さく、解剖することが困難であることを意味します。その上、組織間には強いつ...

過去数十年で、ベゴモウイルス(属ベゴモウイルス、ファミリージェミニビリダ)は、世界中の多くの野菜、繊維、および観賞用作物の生産に深刻な損害を与えました1.ベゴモウイルスは、35以上の不可解な種2、3を含む複雑な種である白飛ベミシアタバチ(ヘミプテラ:アレイロジダエ)によって永続的に伝えられる。ベゴモウイルスは、直接的または間接的に、フェクンディティ4、長寿4、および宿主の好み5、6などのホワイトフライの生理学および行動に影響を及ぼし得る。さらに、与えられたベゴモウイルス種/株の伝達効率は、同じ実験条件の下でも異なるホワイトフライの不可解種に対して異なり、7,8,9,10であり、ベゴモウイルスとホワイエとの間に複雑な相互作用があることを示す。ホワイトフライとベゴモウイルスの相互作用の根底にあるメカニズムをよりよく理解するためには、ホワイトフライ組織におけるウイルスの局在化および定量化が不可欠です。
トマト黄色葉カールウイルス(TYLCV)はイスラエルで最初に報告されたベゴモウイルスですが、今日では世界的にトマト生産に深刻な被害を引き起こします11,12.経済的に重要なため、最もよく研究されているベゴモウイルス13の1つです。他のモノアルタイ人ベゴモウイルスと同様に、TYLCVは、14の約2,800ヌクレオチドのゲノムサイズを有する一本鎖環状DNAウイルスである。まだ議論中ですが、いくつかの証拠行は、ホワイトフライ15、16、17でTYLCVの複製をサポートしています。また、TYLCV粒子とホワイトフライタンパク質との相互作用は6,18,19,20と報告されている。ウイルス感染の場合、シロナフライはウイルス感染植物に餌を与えてTYLCVを獲得し、ニビオンは食道に沿って食道に到達し、中腸壁を貫通してヘモリンフに到達し、次に一次唾液腺(PSG)に移動する。最後に、ビリオンは唾液管に沿って唾液を植物フロム21に沿って唾液で排出される。さらに、いくつかの研究は、TYLCVが雌の白いハエからその子孫22、23にトランスボリーで伝染することができることを示している。言い換えれば、生産的な伝染を達成するために、ウイルスはホワイトフライ内の細胞障壁を克服し、ある組織から別の組織に移動しなければならない。これらの障壁の交差中に、ホワイトフライとウイルスタンパク質の相互作用が起こりやすく、おそらくウイルスが伝染する効率を決定する。
免疫蛍光はタンパク質分布解析に一般的に使用される手法です。抗体の抗原への結合の特異性は、免疫蛍光の基礎を形成する。TYLCVの経済的意義のために、TYLCVコートタンパク質に対するモノクローナル抗体が開発されており、ウイルス24を局所化する非常に敏感な方法を提供している。定量 PCR (qPCR) は、核酸の感度と特異的な定量を可能にします。この技術は、加水分解プローブ(例えば、TaqMan)または蛍光色素(例えば、SYBR Green)検出の使用に最も頻繁に基づく。加水分解プローブベースのqPCRでは、特定のプローブが必要となり、その結果、コストが増加します。蛍光色素ベースのqPCRは、標識アンプリコン特異的ハイブリダイゼーションプローブが25を必要としないため、より簡単でコスト効率が高い。これまでに、いくつかの研究では、複雑なベゴモウイルスとホワイトフライの相互作用を調査するために、他の方法と共に免疫蛍光およびqPCRを使用してきました。例えば、Pan et al. ホワイトフライ組織におけるウイルスのqPCRおよび免疫蛍光分析を行い、シロナリ種のアジアII1と中東アジアマイナー1(MEAM1)の間でタバコ巻き毛シュートウイルス(TbCSV)を送信する能力の違いは、ウイルスがアジアII1の中腸壁を効率的に横断できることによるものであることがわかった。同様に、地中海(MED)ホワイエはTYLCVを容易に伝播できるが、トマト黄色葉カール中国ウイルス(TYLCCNV)を伝播することができない。選択的伝達は、PSGにおけるウイルスの免疫蛍光検出を用いて調査されたが、これはTYLCCNVがMEDホワイトホエ26のPSGを容易に横断しないことを示した。ホワイトフライ中腸におけるTYLCV CPとオートファジーマーカータンパク質ATG8-IIの免疫蛍光共局在化は、オートファジーがホワイトフライ27におけるTYLCVの感染を抑える上で重要な役割を果たしていることを示している。
ここで、TYLCVを例に用いて、免疫蛍光技術によるホワイトフライ中腸、PSG、卵巣におけるベゴモウイルスの局在化に関するプロトコルを説明する。この技術は、一次抗体および色素標識二次抗体による解剖、固定、およびインキュベーションを含む。ホワイトフライ組織中のウイルスタンパク質の位置を示す蛍光シグナルは、共焦点顕微鏡下で検出できます。さらに重要なことに、このプロトコルは、ベゴモウイルスおよびホワイトフライタンパク質を共局化するために使用することができる。さらに、ホワイトフライ中腸、PSG、ヘモリオン、卵巣におけるSYBRグリーンベースのqPCRを用いたTYLCVの定量のプロトコルについて説明し、異なるホワイトフライ組織サンプル中のウイルス量を比較するために使用することができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>MultiSciences</td>
			<td>F0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole (DAPI)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>MultiSciences</td>
			<td>A3828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>185-5201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-goat anti-mouse</td>
			<td>Earthox</td>
			<td>E032310-02</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody (MAb 1C4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B548119-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820A</td>
			<td>qPCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A41182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissuelyzer</td>
			<td>Shaghai jingxin</td>
			<td>Tissuelyser-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization and quantification of begomoviruses in whitefly tissues by immunofluorescence and quantitative pcr

ベゴモウイルス(属ベゴモウイルス、ファミリーゲミニビリダ)は、ベミシアタバチ複合体の白飛によって永続的な循環的な方法で伝染する。世界中で生産されるベゴモウイルスによる大規模な被害を考慮すると、ベゴモウイルスとそのホワイトフライベクターとの相互作用を理解することが不可欠です。そのためには、ベクター組織におけるウイルスの局在化および定量化が重要である。ここでは、例としてトマト黄色葉カールウイルス(TYLCV)を用い、免疫蛍光法によるホワイトフライ中腸、一次唾液腺、および卵巣中のベゴモウイルスを局ース化するための詳細なプロトコルを記載する。この方法は、ウイルス被覆タンパク質、色素標識二次抗体、および共焦点顕微鏡に対する特異的抗体の使用に基づいている。このプロトコルは、ベゴモウイルスタンパク質とホワイトフライタンパク質の共局性化にも使用できます。さらに、定量PCR(qPCR)によるホワイトフライ中腸、一次唾液腺、ヘモリフ、卵巣におけるTYLCVの定量に関するプロトコルについて説明します。TYLCV用に特別に設計されたプライマーを使用して、定量のためのプロトコルは、ホワイトフライの異なる組織におけるTYLCVの量の比較を可能にする。記載されたプロトコルは、ホワイトフライおよびウイルス感染植物の体内におけるベゴモウイルスの定量化に有用である可能性がある。これらのプロトコルは、ホワイトフライ中のベゴモウイルスの循環経路を分析したり、ホワイトフライとベゴモウイルスの相互作用を研究する他の方法を補完するものとして使用することができる。

ここでは、B.タバチ複合体とTYLCVのMEAM1ホワイエを例として、手順を説明するために使用しました。本稿に記載されている免疫蛍光およびウイルス定量手順の概要を図1に示す。図2は、PSG、中腸、および卵巣におけるTYLCVおよびDAPI染色の免疫蛍光検出の代表的な結果を示し、TYLCVがPSGおよび中腸においてより多く蓄積し、卵巣に少ないことを示...

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Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

昆虫組織におけるベゴモウイルスの局在化および定量化のための免疫蛍光法および定量PCR法について述べている。免疫蛍光プロトコルは、ウイルスタンパク質とベクタータンパク質を共局化するために使用することができる。定量PCRプロトコルを拡張して、ホワイトフライ体全体やウイルス感染植物のウイルスを定量化することができます。

ホワイトフライ組織におけるベゴモウイルスの免疫蛍光および定量PCRによる局在化と定量化

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. ...

白飛球のウイルスの空間性と量を明らかにすることは、ベゴモウイルスと白飛の相互作用を理解し、重篤なベゴモウイルス疾患を制御するための新しい戦略の開発に役立ちます。この技術の利点は、ホワイトフライ組織を迅速に分離し、ウイルスおよびホワイトフライタンパク質を共にローカライズし、ホワイトフライ全身およびウイルス感染植物のウイルスを定量化できることです。適切な実験時点で、ウイルス取得後、氷を麻酔した雌の白身エを顕微鏡スライド上のPBSの滴に入れ、細かい鍼針を使用して、ステレオ顕微鏡下で白ホフライの腹部を開く。注射針を使用して中腸を抽出し、中腸をPBSのコレクション皿に入れます。PSGを収集するには、頭の近くの後側から胸郭で体を分割し、胸郭を通して針でホワイトフライを固定します。2つの唾液腺が体から分離されるまでホワイトフライを振り、PBSの新しい皿に腺を移すために2番目の針を使用してください。卵巣を採取するには、腹部を完全に開き、針を使って卵巣を他の組織から分離する。余分な組織を除去し、PBSの新しい皿に卵巣を移すためにピペットを使用してください。溶水サンプルを採取するには、10マイクロリットルのPBSを新しい顕微鏡スライドに加え、新しいホワイトフライを液滴に入れる。細かい鍼針を使って腹部に穴を開けます。その後、腹部にわずかな圧力を加え、ヘモリンパを緩衝液に放出し、液体の8マイクロリットルのサンプルを採取する。収穫されたホワイトフライPSG、ミドグ、または卵巣組織におけるTYLCV局在化を可視化するには、15〜20個の標本をガラス3.5センチメートルのペトリ皿に移し、余分な緩衝液を吸引する。1回の洗浄ごとに新鮮な結核の1ミリリットルでサンプルを2分間2分間慎重に洗浄する前に、室温で2時間4%パラホルムアルデヒドの1ミリリットルで組織を固定します。最後の洗浄後、1回の洗浄につき1ミリリットルのTBSTで実証したように、3回洗浄する前に30分間0.5%トリトンX-100の1ミリリットルでサンプルを透過させます。最後の洗浄後、1%ウシ血清アルブミンの1ミリリットルを室温で2時間、続いてTBSTで3回の洗浄を行い、非特異的結合をブロックします。最後の洗浄後、細胞に一次抗体を一晩で光から保護した摂氏4度で標識します。翌朝、サンプルをTBSTで3回洗浄してから、適切な二次抗体を光から保護された室温で2時間添加します。インキュベーションの終わりに、中腸を3回洗い、標本をきれいな顕微鏡スライドに移します。できるだけ多くのバッファーを取り出し、カバースリップで取り付け、共焦点顕微鏡で標識された組織を調べる前に、DAPIの1滴で核を染色します。TYLCV定量の場合、採取したホワイトフライ組織サンプルを新鮮なPBSで2〜3回洗浄し、25マイクロリットルの溶解溶液を含む個々のPCRチューブにPBSの5マイクロリットルで20ミドグ、20 PSG、または1つの卵巣を移します。各チューブに直径2ミリメートルのセラミックビーズを5~7個加え、ホモジナイザーでサンプルを粉砕します。新しいPCRチューブに8マイクロリットルのヘモリンパサンプルを1つ加え、10マイクロリットルのライシスをチューブに完全に混合します。すべてのサンプルを摂氏65度で1時間インキュベートし、続いて摂氏100度で10分間のインキュベーションを行い、短い遠心分離を行います。次に、定量PCRストリップチューブのバイアルに18マイクロリットルのマスターミックスを加え、各DNAサンプルの2マイクロリットルを少なくとも3つのバイアルに加えます。すべてのサンプルがロードされたら、チューブと遠心分離機を閉じて、各バイアルの底部に溶液を沈めます。バイアルを定量PCR用のリアルタイムサーマルサイクラーにロードし、フッ素色素としてサイバーを選択し、サンプルタイプとして不明です。次に、定量データをスプレッドシートにエクスポートして、各サンプル内のウイルスDNAの相対量を分析します。ここでは、ホワイトフライPSG、中腸、卵巣におけるDAPI染色におけるTYLCVの代表的な画像が示されている。観察されるように、TVLCVは卵巣よりもPSGおよび中腸内でより大きな蓄積を示す。TYLCV感染トマトを24時間、48時間、72時間食べた後のホワイトフライPSG、中腸、ヘモリンフ、卵巣におけるウイルスの定量化は、取得アクセス期間の増加と直接相関して異なる白飛組織のウイルス量が増加することを示している。死んだ昆虫は解剖の難しさを増すので、新鮮なホタルを使用するのが最善です。この手順に従って、他の分析は、ウェスタンブロッティングおよび共免疫沈降法のような、ウイルスタンパク質発現およびウイルスおよびベクタータンパク質相互作用に関する追加の質問に答えるために行うことができる。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

ノーマルCNSのリアルタイムPCRによると神経炎症時のミクログリアにおけるマイクロRNAの検出

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

蛍光<em&gt;その場での</emウイルスと植物及び昆虫組織における共生細菌の局在化のための&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

リアルタイムPCRによるT細胞受容体切除サークル（TRECs）とK-削除換え切除サークル（KRECs）の同時定量

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

呼吸器流体におけるウマヘルペスウイルス-2の診断のための定量的PCR法の開発と検証

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

のジェノタイピング<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;によってリボソームスペーサーPCR（RS-PCR）

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

ナノスケールPCRによる動物標本における呼吸器病原体のハイスループット検出

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Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

代謝のマッピング: 定量的酵素組織化学および組織化学細胞や組織における脱水素酵素の活性を決定するには

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

バイオパニングから T7 バクテリオファージの量的な PCR

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

デジタルPCRを用いたマウス組織における異種マウスモデルにおける移植片対宿主病の誘導とスコア付け

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...