Name: localization and quantification of begomoviruses in whitefly tissues by immunofluorescence and quantitative pcr
Uploaded: 2020-02-08T12:00:00
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이 작품은 국가 주요 연구 개발 프로그램 (보조금 번호 : 2017YFD0200600), 중국 농업 연구 시스템 (보조금 번호 : CARS-23-D07) 및 빌 & 멜린다 게이츠 재단 (투자 ID OPP1149777)에 의해 지원되었습니다. ). TYLCV CP 항체를 제공한 지안샹 우 교수님께 감사드립니다.

1. 화이트 플라이, 바이러스, 식물, 바이러스의 취득
<ol><li>면에 있는 후방 흰살파리(MEAM1)는 26±1°C에서 온실에서 곤충 방지 케이지에서 14:10의 빛:암주기 및 60±10% 상대 습도에 있는 곤충 방지 케이지에 있다.</li>
	<li>백두미토콘드리아 시토크롬 산화아제 I 유전자에 기초한 종래의 PCR을 수행하여 백파리 집단의 순도를 결정한다.<ol>
<li>20 마리의 성인 흰파리를 수집하고 30 μL의 라시스 버퍼?...

<ol>
	<li>Rojas, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+management+of+geminiviruses.">World management of geminiviruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).</li><li>De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bemisia+tabaci:+a+statement+of+species+status.">Bemisia tabaci: a statement of species status.</a> Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).</li><li>Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+virus+diseases+transmitted+by+whiteflies.">Emerging virus diseases transmitted by whiteflies.</a> Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+infection+of+tobacco+plants+improves+performance+of+Bemisia+tabaci+but+more+so+for+an+invasive+than+for+an+indigenous+biotype+of+the+whitefly.">Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).</li><li>Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+effects+of+a+begomovirus+infection+and+host+plant+resistance+on+the+preference+and+development+of+an+insect+vector,+Bemisia+tabaci,+and+implications+for+epidemics.">Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics.</a> PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+alters+the+host+preferences+of+its+vector+Bemisia+tabaci.">Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci.</a> Scientific Reports. 3, 2876 (2013).</li><li>Guo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+transmission+of+papaya+leaf+curl+China+virus+among+four+cryptic+species+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+complex.">Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex.</a> Scientific Reports. 5, 15432 (2015).</li><li>Pan, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+efficiency+of+a+begomovirus+to+cross+the+midgut+of+different+species+of+whiteflies+results+in+variation+of+virus+transmission+by+the+vectors.">Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors.</a> Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).</li><li>Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+leaf+curl+disease:+which+whitefly+is+the+vector.">Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector.</a> Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).</li><li>Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+begomoviruses+and+other+whitefly-borne+viruses:+dependence+on+the+vector+species.">Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species.</a> Phytopathology. , (2019).</li><li>Cohen, S., Nitzany, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+and+host+range+of+the+tomato+yellow+leaf+curl+virus.">Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus.</a> Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).</li><li>Moriones, E., Navas-Castillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus,+an+emerging+virus+complex+causing+epidemics+worldwide.">Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide.</a> Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).</li><li>Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+mechanisms+and+components+that+determine+the+transmission+efficiency+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+(Geminiviridae;+Begomovirus)+by+its+whitefly+vector.">A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector.</a> Virus Research. 186, 47-54 (2014).</li><li>Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+-+a+whitefly-transmitted+geminivirus+with+a+single+genomic+component.">Tomato yellow leaf curl virus - a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component.</a> Virology. 185 (1), 151-161 (1991).</li><li>Sanchez-Campos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus:+No+evidence+for+replication+in+the+insect+vector+Bemisia+tabaci.">Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci.</a> Scientific Reports. 6, 30942 (2016).</li><li>Pakkianathan, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+its+whitefly+vector,+Bemisia+tabaci.">Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci.</a> Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).</li><li>Rodriguez-Negrete, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+the+quantification+of+virion-sense+and+complementary-sense+DNA+strands+of+circular+single-stranded+DNA+viruses.">A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses.</a> Scientific Reports. 4, 6438 (2014).</li><li>Gotz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+Bemisia+tabaci+heat+shock+protein+70+in+Begomovirus-whitefly+interactions.">Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).</li><li>Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+whitefly+vesicle+associated+membrane+protein-associated+protein+B+in+the+transmission+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus.">Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus.</a> Virology. 535, 210-217 (2019).</li><li>Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+benefits+population+growth+of+the+Q+biotype+of+Bemisia+tabaci+(Gennadius)+(Hemiptera:+Aleyrodidae).">Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).</li><li>Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incredible+journey+of+begomoviruses+in+their+whitefly+vector.">The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector.</a> Viruses. 9 (10), 273 (2017).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+development+and+vitellogenin+determine+the+transovarial+transmission+of+begomoviruses.">Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).</li><li>Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+transovarial+transmission+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+by+its+vector,+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci.</a> Virology. 240 (2), 295-303 (1998).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+serological+methods+for+detecting+tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+tomato+plants+and+whiteflies.">Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies.</a> Virology Journal. 10, 142 (2013).</li><li>Arya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+principles+of+real-time+quantitative+PCR.">Basic principles of real-time quantitative PCR.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+cells+in+the+primary+salivary+glands+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+control+retention+and+transmission+of+begomoviruses.">Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses.</a> Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).</li><li>Wang, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagy+pathway+participates+in+resistance+to+tomato+yellow+leaf+curl+virus+infection+in+whiteflies.">The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies.</a> Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).</li><li>Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+2(-Delta+Delta+Ct)+calculation+as+an+alternate+method+of+data+analysis+for+quantitative+PCR+of+BCR-ABL+P210+transcripts.">Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts.</a> Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+gene+selection+for+qRT-PCR+analysis+in+the+sweetpotato+whitefly,+Bemisia+tabaci+(Hemiptera:+Aleyrodidae).">Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).</li></ol>

여기서 우리는 면역형광 및 qPCR에 의한 백비행 벡터의 조직에서 베고모바이러스의 국소화 및 정량화를 위한 프로토콜을 기술한다. 해부는 흰파리 조직에서 바이러스를 현지화하고 정량화하는 첫 번째 단계를 나타냅니다. 화이트플라이 몸체는 길이가 약 1mm이며, 이는 조직이 매우 작으며 해부하기가 어렵습니다. 게다가, 조직 사이 강한 연결이 있습니다. 예를 들면, 난소는 박테리오시테와 단단히...

지난 수십 년 동안, 베고모바이러스(Begomovirus, 가족 쌍둥이자리)는전 세계적으로 많은 채소, 섬유질 및 장식용 작물의 생산에 심각한 손상을 입혔습니다1. 베고모바이러스는 35종 이상을 포함하는 복합종인 흰파리 베미시아 타바치(Hemiptera: Aleyrodidae)에 의해 지속적으로전달된다. 베고모바이러스는 백딧항 4, 장수4,호스트 선호도5,6과 같은 백딧물 생리학 및 행동에 직간접적으로 영향을 미칠 수 있다. 더욱이, 주어진 베고모바이러스 종/균주의 투과 효율은 동일한 실험조건7,8,9,10하에서도다른 흰동비 비밀 종에 대해 다양하며, 이는 베고모바이러스와 흰파리 사이에 복잡한 상호작용이 있음을 나타낸다. 화이트플라이-베고모바이러스 상호 작용의 근본적인 메커니즘을 더 잘 이해하려면, 흰파리 조직에서 바이러스의 국소화 및 정량화가 필수적입니다.
토마토 노란 잎 컬 바이러스(TYLCV)는 이스라엘에서 처음 보고되었지만 요즘에는 전 세계적으로 토마토 생산에 심각한 손상을 입히는 베고모바이러스(TYLCV)이다. 경제적 중요성으로 인해 가장 잘 연구 된 베고모 바이러스13중 하나입니다. 다른 모노파르트 베고모바이러스와 마찬가지로, TYLCV는 약 2,800개의 뉴클레오티드14의게놈 크기를 가진 단일 가닥 원형 DNA 바이러스이다. 여전히 논쟁 중, 증거의 여러 줄은 흰 파리에서 TYLCV의 복제를 지원15,16,17. 더욱이, TYLCV 입자와 흰플라이 단백질의 상호작용은6,18,19,20으로보고되었다. 바이러스 전염을 위해, 흰파리는 바이러스에 감염된 식물에 공급하여 TYLCV를 취득하고, 비리온은 식도에 도달하기 위해 음식 운하를 따라 통과하고, 헤모 림프에 도달하기 위해 중구 벽을 관통한 다음, 1 차 적인 침샘 (PSGs)으로 옮겨갑니다. 마지막으로, 비리온은 침관을 따라 침을 식물 phloem21로예시한다. 게다가, 몇몇 연구 결과는 TYLCV가 그들의 자손22,23에암컷 흰파리에서 transovarially 전달될 수 있다는 것을 보여줍니다. 즉, 생산적인 전염을 달성하기 위해, 바이러스는 한 조직에서 다른 조직으로 옮기기 위해 백색가비 내의 세포 장벽을 극복해야 한다. 이 장벽의 교차 도중, whitefly와 바이러스 단백질 사이 상호 작용은 아마 바이러스가 전송되는 효율성을 결정하는, 일어날 확률이 높습니다.
면역형광은 단백질 분포 분석을 위해 일반적으로 사용되는 기술입니다. 그들의 항원과 결합하는 항체의 특이성은 면역 형광의 기초를 형성한다. TYLCV의 경제적 중요성으로 인해, TYLCV 코트 단백질에 대한 단일 클론 항체가 개발되어 바이러스24를국소화하는 매우 민감한 방법을 제공합니다. 정량적 PCR(qPCR)은 핵산의 민감하고 구체적인 정량화를 가능하게 합니다. 이 기술은 가수분해 프로브(예를 들어, TaqMan) 또는 형광 염료(예를 들어, SYBR Green) 검출의 사용에 가장 자주 기초한다. 가수분해 프로브 기반 qPCR의 경우 특정 프로브가 필요하므로 비용이 증가합니다. 형광 염료 기반 qPCR은 라벨이 부착된 앰플리톤 특이적 혼성화 프로브가25를필요로 하지 않기 때문에 더 간단하고 비용 효율적입니다. 지금까지, 몇몇 연구 결과는 복잡한 begomovirus-흰파리 상호 작용을 조사하기 위하여 그밖 방법과 더불어 면역 형광 및 qPCR를 이용했습니다. 예를 들어, Pan et al.은 백색파리 조직에서 바이러스의 qPCR 및 면역형광 분석을 수행하고 백색파리 종 아시아II 1과 중동 아시아 소소1(MEAM1) 사이의 담배 경투 바이러스(TbCSV)를 전송하는 능력의 차이가 아시아II1하지만MEAM1이아닌 아시아II1의 중거벽을 효율적으로 교차할 수 있는 바이러스에 기인한다는 것을 발견하였다. 유사하게, 지중해 (MED) 흰파리는 쉽게 TYLCV를 전송할 수 있지만, 그들은 토마토 노란 잎 컬 중국 바이러스 (TYLCCNV)를 전송하는 데 실패합니다. 선택적 전염은 PSGs에서 바이러스의 면역형광 검출을 사용하여 조사되었으며, 이는 TYLCCNV가 MED흰파리(26)의PSG를 쉽게 교차하지 않는 것으로 나타났다. 백색파리 미드구트에서 TYLCV CP 및 자가포식 마커 단백질 ATG8-II의 면역형광 동국화는 자가포식이 화이트플라이27에서TYLCV의 감염을 억제하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다.
여기서, 예를 들어 TYLCV를 사용하여, 우리는 면역형광 기술에 의한 백비행 중거트, PSG 및 난소에서 베고모바이러스의 국소화를 위한 프로토콜을 기술한다. 이 기술은 1 차및 염료 표지된 이차 항체를 가진 해부, 고정 및 배양을 포함합니다. 흰파리 조직에서 바이러스 성 단백질의 위치를 보여주는 형광 신호는 공초점 현미경으로 검출 될 수 있습니다. 더 중요한 것은, 이 프로토콜은 베고모바이러스 및 흰파리 단백질을 국소화하는 데 사용될 수 있다. 우리는 또한 다른 whitefly 조직 견본에 있는 바이러스의 양을 비교하기 위하여 이용될 수 있는 백색파리 midguts, PSGs, hemolymph 및 난소에 있는 SYBR 녹색 기지를 둔 qPCR를 사용하여 TYLCV의 정량화를 위한 프로토콜을 기술합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>MultiSciences</td>
			<td>F0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole (DAPI)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>MultiSciences</td>
			<td>A3828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>185-5201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-goat anti-mouse</td>
			<td>Earthox</td>
			<td>E032310-02</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody (MAb 1C4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B548119-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820A</td>
			<td>qPCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A41182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissuelyzer</td>
			<td>Shaghai jingxin</td>
			<td>Tissuelyser-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization and quantification of begomoviruses in whitefly tissues by immunofluorescence and quantitative pcr

베고모바이러스(베고모바이러스,가족 쌍둥이자리)는 베미시아 타바치 복합체의 흰파리에 의해 지속적이고 순환적인 방식으로 전달된다. 전 세계적으로 작물 생산에 베고모 바이러스로 인한 광범위한 손상을 고려, 베고모 바이러스와 그들의 흰 파리 벡터 사이의 상호 작용을 이해하는 것이 필수적이다. 이렇게 하려면 벡터 조직에서 바이러스의 국소화 및 정량화가 중요합니다. 여기서, 예를 들어 토마토 노란 잎 컬 바이러스(TYLCV)를 사용하여, 우리는 면역형광에 의한 백딧지, 1차 타액선 및 난소에서 베고모바이러스를 국소화하는 상세한 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 바이러스 코트 단백질, 염료 표지 이차 항체 및 공초점 현미경에 대한 특정 항체의 사용에 기초한다. 프로토콜은 또한 베고모바이러스 및 흰플라이 단백질을 국소화하는데 사용될 수 있다. 우리는 또한 양적 PCR (qPCR)에 의하여 흰살 파리 중두, 1 차 적인 타액 선, 헤모 림프 및 난소에 있는 TYLCV의 정량화를 위한 프로토콜을 기술합니다. TYLCV를 위해 특별히 설계된 프라이머를 사용하여 정량화를 위한 프로토콜은 화이트플라이의 상이한 조직에서 TYLCV의 양을 비교하는 것을 허용한다. 기재된 프로토콜은 화이트플라이 및 바이러스에 감염된 식물의 체내에서 베고모바이러스의 정량화에 잠재적으로 유용하다. 이 프로토콜은 화이트플라이에서 베고모바이러스의 순환 경로를 분석하거나 화이트플라이-베고모바이러스 상호작용을 연구하는 다른 방법에 대한 보완으로 사용될 수 있다.

B. 타바치 복합체 및 TYLCV의 MEAM1 흰파리는 절차를 설명하기 위해 여기에 예로 사용되었다. 본 원고에 기재된 면역형광 및 바이러스 정량화 절차의 개요는 도 1에나타내고 있다. 도 2는 PSGs, midguts 및 난소에서 TYLCV 및 DAPI 염색의 면역 형광 검출의 대표적인 결과를 나타내며, TYLCV가 PSG 및 midguts에서 더 많이 축적되고 난소에서 덜 축적되었음을 나타?...

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Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

우리는 곤충 조직에서 베고모바이러스의 국소화 및 정량화를 위한 면역형광 및 정량적 PCR 방법을 기술한다. 면역형광 프로토콜은 바이러스 및 벡터 단백질을 국소화하는데 사용될 수 있다. 정량적 PCR 프로토콜은 전체 화이트플라이 바디 및 바이러스 감염 식물에서 바이러스를 정량화하기 위해 확장될 수 있다.

면역형광 및 정량적 PCR에 의한 화이트플라이 조직에서 베고모바이러스의 국소화 및 정량화

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. ...

백색 파리 벡터에서 바이러스의 공간성과 양을 명확히하는 것은 begomovirus-whitefly 상호 작용을 이해하고 심각한 begomoviral 질병을 통제하기위한 새로운 전략의 개발에 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 화이트플라이 조직을 신속하게 분리하고, 바이러스 및 백색 도단백질을 공동 으로 국한하며, 백색 파리 전신 및 바이러스감염 식물의 바이러스를 정량화할 수 있다는 것입니다. 적절한 실험 시점에서, 바이러스 획득 후, 현미경 슬라이드에 PBS의 방울에 얼음 마취 여성 흰파리를 배치하고 스테레오 현미경에서 백색 파리의 복부를 열기 위해 미세 침술 바늘을 사용합니다.바늘을 사용하여 미드구트를 추출하고 MIDgut를 PBS컬렉션 접시에 넣습니다. PSG를 수집하려면 머리 근처의 등쪽에서 흉부에서 몸을 분할하고 흉부를 통해 바늘로 백색 도면을 고정합니다. 두 번째 바늘을 사용하여 두 타액 선이 몸에서 분리 될 때까지 백색 도선을 흔들고 땀샘을 PBS의 새로운 접시로 옮긴다.난소를 수집하려면 복부를 완전히 열고 바늘을 사용하여 난소를 다른 조직으로부터 분리하십시오. 파이펫을 사용하여 과도한 조직을 제거하고 난소를 PBS의 새로운 접시로 옮기는다. 혈청량 샘플을 수집하려면 새로운 현미경 슬라이드에 PBS 10 마이크로리터를 추가하고 새로운 백색 도면을 액적에 넣습니다.미세침술 바늘을 사용하여 복부에 구멍을 부드럽게 만듭니다. 그런 다음 복부에 약간의 압력을 가하여 혈류를 완충제로 방출하고 액체의 8개의 마이크로리터 샘플을 수집합니다. 수확된 화이트플라이 PSG, 미드구트 또는 난소 조직에서 TYLCV 현지화를 시각화하려면 15~20개의 표본을 3.5센티미터 페트리 접시에 옮기고 과잉 버퍼를 흡인시합니다.정산용 시료를 세척당 1밀리리터에서 2분 동안 3회 세 번 세척하기 전에 실온에서 2시간 동안 4%의 파라포름알데히드1밀리리터로 티슈를 수정합니다. 마지막 세척 후, 세척 당 TBST의 1 밀리리터로 입증 된 것처럼 세 번 세척하기 전에 30 분 동안 0.5 %의 Triton X-100의 1 밀리리터로 샘플을 permeabilize하십시오. 마지막 세척 후, 실온에서 2시간 동안 1%소 세럼 알부민 1밀리리터로 비특이적 결합을 차단한 다음 TBST에서 3개의 세척을 시연합니다.마지막 세척 후, 빛으로부터 보호 섭씨 4도에서 하룻밤 관심의 주요 항체로 세포를 레이블. 다음 날 아침, TBST로 샘플을 세 번 세척한 후 빛으로부터 보호되는 실온에서 2시간 동안 적절한 이차 항체를 첨가합니다. 인큐베이션이 끝나면 중간구스를 세 번 씻고 시편을 깨끗한 현미경 슬라이드로 옮겨보십시오.가능한 한 많은 버퍼를 제거하고 커버 슬립으로 장착하고 공초점 현미경 검사에 의해 표지 된 조직을 검사하기 전에 DAPI의 한 방울로 핵을 얼룩. TYLCV 정량화를 위해, 수확된 백색파리 조직 샘플을 신선한 PBS에서 2~3회 세척하고 PBS의 5개의 마이크로리터에서 20개의 midguts, 20 PSG 또는 1개의 난소를 용해 용액25마이크로리터를 포함하는 개별 PCR 튜브로 이송한다. 각 튜브에 직경 5~7밀리미터 의 세라믹 구슬을 추가하고 균질화로 샘플을 갈아냅니다.새로운 PCR 튜브에 혈몰리프 의 8 마이크로 리터 샘플을 추가하고 철저한 혼합튜브에 10 마이크로 리터의 리시스를 추가합니다. 모든 샘플을 섭씨 65도에서 1시간 동안 배양한 다음 100°C에서 10분 간 배양하고 간단한 원심분리를 합니다. 다음으로, 양적 PCR 스트립 튜브의 바이알에 마스터 믹스 18 마이크로리터를 추가하고 적어도 3개의 바이알에 각 DNA 샘플의 2개의 마이크로리터를 추가합니다.모든 샘플이 로드되면 튜브와 원심분리기를 닫아 각 바이알 의 하단에 있는 용액을 퇴적시하십시오. 바이알을 정량적 PCR용 실시간 열 순환기위에 로드하여 사이버를 불소 염색물로 선택하고 시료 유형으로 알려지지 않았습니다. 그런 다음 각 샘플에서 바이러스 DNA의 상대적 양을 분석하기 위해 정량 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.여기서, 백색 플라이 PSGs, midguts 및 난소에서 염색하는 DAPI에서 TYLCV의 대표적인 이미지가 표시됩니다. 관찰된 바와 같이, TVLCV는 난소보다 PSG 및 midguts 내의 더 큰 축적을 보여줍니다. 24, 48 및 72 시간 동안 TYLCV 감염 토마토에 공급 한 후 백색 플라이 PSG, midguts, 혈청및 난소에서 바이러스의 정량화는 취득 액세스 기간의 증가와 직접적인 상관 관계에 있는 다른 백색 파리 조직에서 바이러스의 양이 증가한다는 것을 나타냅니다.죽은 곤충이 해부의 어려움을 증가시킬 것이기 때문에 신선한 흰파리를 사용하는 것이 가장 좋습니다. 이 절차에 따라, 서양 블로팅 및 공동 면역 침전과 같은 다른 분석은 바이러스 성 단백질 발현 및 바이러스 성 및 벡터 단백질 상호 작용에 대한 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

일반 CNS의 실시간 PCR에 의한과 Neuroinflammation 동안 Microglia에 MicroRNAs의 탐지

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

연구

면역학 및 감염병학

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

형광<em&gt; 현장에서</em바이러스 및 식물과 곤충 조직에서 Endosymbiotic 박테리아의 지역화를위한&gt; 혼성화 (FISH)

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

T 세포 수용체 절제술 원의 동시 정량 (TRECs)와 K-삭제 재조합 절제술 원 (KRECs) 실시간 PCR에 의한

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

호흡기 유체의 Equid 헤르페스 바이러스-2 진단에 대한 정량적 PCR 방법의 개발 및 검증

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

의 유전자형<em&gt; 황색 포도상 구균</em&gt;에 의해 리보솜 스페이서 PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

나노 PCR에 의한 동물 표본의 호흡기 병원체의 높은 처리량 검출

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

신진 대사 매핑: 양적 효소 Cytochemistry 및 Histochemistry Dehydrogenases 세포와 조직에서의 활동을 결정 하

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

Biopanning에서 t 7 살 균 소의 양이 많은 PCR

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

디지털 PCR을 사용하여 마우스 조직에서 인간 T 세포의 Xegeneic Murine 모델 및 정량화에서 이식편 대 숙주 질환의 유도 및 채점

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...