Name: localization and quantification of begomoviruses in whitefly tissues by immunofluorescence and quantitative pcr
Uploaded: 2020-02-08T12:00:00
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Este trabalho foi apoiado pelo National Key Research and Development Program (Número de subvenção: 2017YFD0200600), o fundo destinado ao Sistema de Pesquisa agropecuária da China (número de subvenção: CARS-23-D07) e pela Fundação Bill & Melinda Gates (ID de Investimento OPP1149777777 ). Agradecemos ao Prof. Jian-Xiang Wu por fornecer anticorpos TYLCV CP.

1. Whitefly, Vírus, Plantas e Aquisição do Vírus
<ol><li>Moscas brancas traseiras (MEAM1) em algodão (Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) em gaiolas à prova de insetos em uma estufa a 26 ± 1 °C com um ciclo claro:escuro 14:10 e 60 ± 10% umidade relativa.</li>
	<li>Executar PCR convencional com base no gene oxidase citocrocito mitocondrial whitefly I para determinar a pureza da população whitefly.<ol>
<li>Colete 20 moscas brancas adultas e transfira-as individualmente para um tubo PCR contendo 30 μ...

<ol>
	<li>Rojas, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+management+of+geminiviruses.">World management of geminiviruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).</li><li>De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bemisia+tabaci:+a+statement+of+species+status.">Bemisia tabaci: a statement of species status.</a> Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).</li><li>Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+virus+diseases+transmitted+by+whiteflies.">Emerging virus diseases transmitted by whiteflies.</a> Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+infection+of+tobacco+plants+improves+performance+of+Bemisia+tabaci+but+more+so+for+an+invasive+than+for+an+indigenous+biotype+of+the+whitefly.">Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).</li><li>Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+effects+of+a+begomovirus+infection+and+host+plant+resistance+on+the+preference+and+development+of+an+insect+vector,+Bemisia+tabaci,+and+implications+for+epidemics.">Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics.</a> PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+alters+the+host+preferences+of+its+vector+Bemisia+tabaci.">Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci.</a> Scientific Reports. 3, 2876 (2013).</li><li>Guo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+transmission+of+papaya+leaf+curl+China+virus+among+four+cryptic+species+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+complex.">Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex.</a> Scientific Reports. 5, 15432 (2015).</li><li>Pan, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+efficiency+of+a+begomovirus+to+cross+the+midgut+of+different+species+of+whiteflies+results+in+variation+of+virus+transmission+by+the+vectors.">Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors.</a> Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).</li><li>Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+leaf+curl+disease:+which+whitefly+is+the+vector.">Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector.</a> Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).</li><li>Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+begomoviruses+and+other+whitefly-borne+viruses:+dependence+on+the+vector+species.">Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species.</a> Phytopathology. , (2019).</li><li>Cohen, S., Nitzany, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+and+host+range+of+the+tomato+yellow+leaf+curl+virus.">Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus.</a> Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).</li><li>Moriones, E., Navas-Castillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus,+an+emerging+virus+complex+causing+epidemics+worldwide.">Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide.</a> Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).</li><li>Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+mechanisms+and+components+that+determine+the+transmission+efficiency+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+(Geminiviridae;+Begomovirus)+by+its+whitefly+vector.">A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector.</a> Virus Research. 186, 47-54 (2014).</li><li>Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+-+a+whitefly-transmitted+geminivirus+with+a+single+genomic+component.">Tomato yellow leaf curl virus - a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component.</a> Virology. 185 (1), 151-161 (1991).</li><li>Sanchez-Campos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus:+No+evidence+for+replication+in+the+insect+vector+Bemisia+tabaci.">Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci.</a> Scientific Reports. 6, 30942 (2016).</li><li>Pakkianathan, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+its+whitefly+vector,+Bemisia+tabaci.">Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci.</a> Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).</li><li>Rodriguez-Negrete, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+the+quantification+of+virion-sense+and+complementary-sense+DNA+strands+of+circular+single-stranded+DNA+viruses.">A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses.</a> Scientific Reports. 4, 6438 (2014).</li><li>Gotz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+Bemisia+tabaci+heat+shock+protein+70+in+Begomovirus-whitefly+interactions.">Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).</li><li>Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+whitefly+vesicle+associated+membrane+protein-associated+protein+B+in+the+transmission+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus.">Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus.</a> Virology. 535, 210-217 (2019).</li><li>Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+benefits+population+growth+of+the+Q+biotype+of+Bemisia+tabaci+(Gennadius)+(Hemiptera:+Aleyrodidae).">Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).</li><li>Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incredible+journey+of+begomoviruses+in+their+whitefly+vector.">The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector.</a> Viruses. 9 (10), 273 (2017).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+development+and+vitellogenin+determine+the+transovarial+transmission+of+begomoviruses.">Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).</li><li>Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+transovarial+transmission+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+by+its+vector,+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci.</a> Virology. 240 (2), 295-303 (1998).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+serological+methods+for+detecting+tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+tomato+plants+and+whiteflies.">Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies.</a> Virology Journal. 10, 142 (2013).</li><li>Arya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+principles+of+real-time+quantitative+PCR.">Basic principles of real-time quantitative PCR.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+cells+in+the+primary+salivary+glands+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+control+retention+and+transmission+of+begomoviruses.">Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses.</a> Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).</li><li>Wang, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagy+pathway+participates+in+resistance+to+tomato+yellow+leaf+curl+virus+infection+in+whiteflies.">The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies.</a> Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).</li><li>Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+2(-Delta+Delta+Ct)+calculation+as+an+alternate+method+of+data+analysis+for+quantitative+PCR+of+BCR-ABL+P210+transcripts.">Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts.</a> Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+gene+selection+for+qRT-PCR+analysis+in+the+sweetpotato+whitefly,+Bemisia+tabaci+(Hemiptera:+Aleyrodidae).">Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).</li></ol>

Aqui descrevemos um protocolo para localização e quantificação de um begomovírus nos tecidos de seu vetor whitefly por imunofluorescência e qPCR. A dissecação representa o primeiro passo para localizar e quantificar o vírus em tecidos whitefly. O corpo de mosca branca tem cerca de 1 mm de comprimento, o que significa que os tecidos são extremamente pequenos, e é difícil dissecá-los. Além disso, há fortes conexões entre os tecidos. Por exemplo, os ovários estão fortemente conectados com os bacteriócitos...

Nas últimas décadas, as begomovírus (gênero Begomovirus, família Geminiviridae) causaram sérios danos à produção de muitas culturas vegetais, fibras e ornamentais em todo o mundo1. Os begomovírus são transmitidos de forma persistente pela mosca branca Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), que é uma espécie complexa que contém mais de 35 espécies enigmáticas2,3. Begomovírus podem afetar direta ou indiretamente a fisiologia e o comportamento da mosca branca, como fecundidade4, longevidade4, e preferência hospedeira5,6. Além disso, a eficiência de transmissão de uma determinada espécie/cepa de begomovírus varia para diferentes espécies enigmáticas whitefly mesmo as mesmas condições experimentais7,8,9,10,indicando que há uma interação complexa entre begomovírus e moscas brancas. Para entender melhor os mecanismos subjacentes às interações whitefly-begomovírus, localização e quantificação do vírus em tecidos whitefly são essenciais.
O vírus do enrolamento da folha amarela de tomate (TYLCV) é um begomovírus que foi relatado pela primeira vez em Israel, mas hoje causa sérios danos à produção de tomate em todo o mundo11,12. Devido à sua importância econômica, é uma das begomovírus mais bem estudadas13. Como outros begomovírus monopartitanos, TYLCV é um vírus de DNA circular de uma única cadeia com um tamanho de genoma de cerca de 2.800 nucleotídeos14. Enquanto ainda estão em debate, várias linhas de evidências apoiam a replicação do TYLCV em moscas brancas15,16,17. Além disso, a interação de partículas TYLCV e proteínas whitefly foi relatada6,18,19,20. Para a transmissão do vírus, moscas brancas adquirem TYLCV alimentando-se de plantas infectadas pelo vírus, virões passam pelo canal de alimentos para chegar ao esôfago, penetrar na parede do intestino para alcançar o hemolinsina e, em seguida, translocalizar-se nas glândulas salivares primárias (PSGs). Finalmente, as viriões são espumeded com saliva ao longo do ducto salivar em phloem vegetal21. Além disso, vários estudos mostram que o TYLCV é capaz de ser transmitido transovarialmente de moscas brancas femininas para seus filhos22,23. Em outras palavras, para alcançar a transmissão produtiva, o vírus tem que superar barreiras celulares dentro da mosca branca para translocalizar de um tecido para outro. Durante o cruzamento dessas barreiras, é provável que ocorram interações entre whitefly e proteínas do vírus, provavelmente determinando a eficiência com que os vírus são transmitidos.
Imunofluorescência é uma técnica comumente utilizada para análise de distribuição de proteínas. A especificidade dos anticorpos ligados ao seu antígeno forma a base da imunofluorescência. Devido à importância econômica do TYLCV, anticorpos monoclonais contra a proteína do casaco TYLCV foram desenvolvidos, oferecendo uma maneira altamente sensível de localizar o vírus24. O PCR Quantitativo (qPCR) permite quantificação sensível e específica de ácidos nucleicos. Esta técnica é mais frequentemente baseada no uso de sonda de hidrolise (por exemplo, TaqMan) ou corante fluorescente (por exemplo, SYBR Green). Para qPCR à base de sondas de hidrólise, são necessárias sondas específicas, o que consequentemente aumenta o custo. QPCR fluorescente baseado em corante é mais simples e econômico, porque as sondas de hibridização específicas de amplicon rotuladas não são necessárias25. Até agora, vários estudos têm usado imunofluorescência e qPCR, juntamente com outros métodos para investigar as complexas interações begomovírus-whitefly. Por exemplo, Pan et al. realizaram análise spcr e imunofluorescência do vírus em tecidos whitefly e descobriram que a diferença na capacidade de transmitir o vírus de tiro encaracolado (TbCSV) entre as espécies whitefly AsiaII 1 e Oriente Médio Asia Minor 1 (MEAM1) foi devido ao vírus ser capaz de atravessar eficientemente a parede midgut da AsiaII1, mas não MEAM18. Da mesma forma, enquanto moscas brancas do Mediterrâneo (MED) podem transmitir facilmente TYLCV, eles não conseguem transmitir o vírus chinês de folha amarela de tomate (TYLCCNV). A transmissão seletiva foi investigada por meio da imunofluorescência de detecção de vírus nos PSGs, o que mostrou que o TYLCCNV não cruza facilmente os PSGs de moscas brancas MED26. A colocalização da imunofluorescência do TYLCV CP e a proteína do marcador de autofagia ATG8-II em midguts whitefly mostra que a autofagia desempenha um papel crítico na repressão da infecção de TYLCV no whitefly27.
Aqui, usando o TYLCV como exemplo, descrevemos um protocolo para a localização de begomovírus em midguts, PSGs e ovários de mosca-branca por uma técnica de imunofluorescência. A técnica inclui dissecação, fixação e incubação com anticorpos secundários de rótulos primários e de tinta. Sinais de fluorescência mostrando a localização de proteínas virais nos tecidos whitefly podem então ser detectados um microscópio confocal. Mais importante, este protocolo pode ser usado para colocalizar proteínas begomoviral e whitefly. Descrevemos ainda um protocolo para a quantificação do TYLCV usando qPCR à base de verde da SYBR em midguts whitefly, PSGs, hemolymph e ovários, que podem ser usados para comparar a quantidade de vírus em diferentes amostras de tecido whitefly.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>MultiSciences</td>
			<td>F0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole (DAPI)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>MultiSciences</td>
			<td>A3828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>185-5201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-goat anti-mouse</td>
			<td>Earthox</td>
			<td>E032310-02</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody (MAb 1C4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B548119-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820A</td>
			<td>qPCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A41182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissuelyzer</td>
			<td>Shaghai jingxin</td>
			<td>Tissuelyser-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization and quantification of begomoviruses in whitefly tissues by immunofluorescence and quantitative pcr

Begomovírus (gênero Begomovirus, família Geminiviridae) são transmitidos por moscas brancas do complexo Bemisia tabaci de forma persistente e circulativa. Considerando os extensos danos causados pelas begomovírus à produção em todo o mundo, é imperativo entender a interação entre begomovírus e seu vetor whitefly. Para isso, a localização e quantificação do vírus nos tecidos vetoris é crucial. Aqui, usando o vírus do cacho de folha amarela de tomate (TYLCV) como exemplo, descrevemos um protocolo detalhado para localizar begomovírus em midguts whitefly, glândulas salivares primárias e ovários por imunofluorescência. O método baseia-se no uso de anticorpos específicos contra uma proteína de casaco de vírus, anticorpos secundários rotulados com tinta de tinta e um microscópio confocal. O protocolo também pode ser usado para colocalizar proteínas begomoviral e whitefly. Descrevemos ainda um protocolo para a quantificação do TYLCV em midguts whitefly, glândulas salivares primárias, hemolinsina e ovários por PCR quantitativo (qPCR). Usando primers especificamente projetados para TYLCV, os protocolos de quantificação permitem a comparação da quantidade de TYLCV em diferentes tecidos da mosca branca. O protocolo descrito é potencialmente útil para a quantificação de begomovírus no corpo de uma mosca branca e de uma planta infectada pelo vírus. Esses protocolos podem ser usados para analisar a via de circulação das begomovírus no whitefly ou como um complemento a outros métodos para estudar interações whitefly-begomovírus.

As moscas brancas MEAM1 do complexo B. tabaci e tylcv foram usadas como exemplo aqui para descrever os procedimentos. A visão geral dos procedimentos de imunofluorescência e quantificação viral descritos neste manuscrito é mostrada na Figura 1. A Figura 2 mostra resultados representativos da detecção de imunofluorescência da coloração TYLCV e DAPI em PSGs, midguts e ovários, indicando que o TYLCV acumulou mais nos PSGs e midguts, e menos nos ...

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Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

Descrevemos um método de imunofluorescência e PCR quantitativo para localização e quantificação de begomovírus em tecidos de insetos. O protocolo de imunofluorescência pode ser usado para colocalizar proteínas virais e vetores. O protocolo quantitativo PCR pode ser estendido para quantificar vírus em corpos inteiros de moscas brancas e plantas infectadas por vírus.

Localização e Quantificação de Begomovírus em Tecidos Whitefly por Imunofluorescência e PCR Quantitativo

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. ...

Esclarecer a espacialidade e a quantidade de vírus nos vetores da mosca branca pode ajudar na compreensão das interações begomovírus-mosca branca e no desenvolvimento de novas estratégias para o controle de doenças begomovirais graves. As vantagens desta técnica são que podemos rapidamente isolar tecidos de mosca branca, co-localizar proteínas virais e de mosca branca, e quantificar vírus em corpos inteiros e plantas infectadas por vírus. No momento experimental apropriado, após a aquisição do vírus, coloque moscas brancas anestesiadas no gelo em uma gota de PBS em um slide de microscópio e use uma agulha de acupuntura fina para abrir o abdômen da mosca branca sob um microscópio estéreo.Use a agulha para extrair o midgut e coloque o midgut em um prato de coleta de PBS. Para coletar os PSGs, divida o corpo no tórax do lado dorsal perto da cabeça e fixe a mosca branca com uma agulha através do tórax. Use uma segunda agulha para agitar a mosca branca até que as duas glândulas salivares sejam separadas do corpo e transfira as glândulas para um novo prato de PBS.Para coletar os ovários, abra completamente o abdômen e use uma agulha para separar os ovários dos outros tecidos. Use uma pipeta para remover o excesso de tecido e transfira os ovários para um novo prato de PBS. Para coletar uma amostra de hemolímph, adicione 10 microlitros de PBS em um novo slide de microscópio e coloque uma nova mosca branca na goteta.Use uma agulha de acupuntura fina para fazer um buraco suavemente no abdômen. Em seguida, aplique uma leve pressão no abdômen para liberar o hemisfão no buffer e coletar uma amostra de oito microliter do líquido. Para visualizar a localização do TYLCV em tecidos pedais colhidos, midgut ou ovário, transfira de 15 a 20 espécimes em uma placa de Petri de vidro de 3,5 centímetros e aspire o excesso de tampão.Fixar os tecidos em um mililitro de 4% de paraformaldeído por duas horas à temperatura ambiente antes de lavar cuidadosamente as amostras três vezes por dois minutos em um mililitro de TBS fresco por lavagem. Após a última lavagem, permeabilize as amostras com um mililitro de 0,5% Triton X-100 por 30 minutos antes de lavar três vezes como apenas demonstrado com um mililitro de TBST por lavagem. Após a última lavagem, bloqueie qualquer ligação inespecífica com um mililitro de 1%de albumina de soro bovino por duas horas em temperatura ambiente, seguido por três lavagens em TBST, como demonstrado.Após a última lavagem, rotule as células com os anticorpos primários de interesse durante a noite a quatro graus Celsius protegidos da luz. Na manhã seguinte, lave as amostras três vezes com TBST antes de adicionar os anticorpos secundários apropriados por duas horas à temperatura ambiente protegidos da luz. No final da incubação, lave os pontões médios três vezes e transfira os espécimes para um slide de microscópio limpo.Remova o máximo de tampão possível e manche os núcleos com uma gota de DAPI antes de montar com um tapa de cobertura e examinar os tecidos rotulados por microscopia confocal. Para quantificação TYLCV, lave as amostras de tecido de mosca branca colhidas duas a três vezes em PBS fresco e transfira 20 múguês médios, 20 PSGs ou um ovário em cinco microliters de PBS em tubos PCR individuais contendo 25 microliters de solução de lise. Adicione de cinco a sete contas de cerâmica de dois milímetros de diâmetro em cada tubo e triture as amostras em um homogeneizador.Adicione uma amostra de oito microlitrais de hemóglifo em um novo tubo PCR e adicione 10 microliters de lise ao tubo com uma mistura completa. Incubar todas as amostras a 65 graus Celsius por uma hora seguida de uma incubação de 10 minutos a 100 graus Celsius e uma breve centrifugação. Em seguida, adicione 18 microliters de mistura mestra nos frascos de tubos quantitativos de tiras PCR e adicione dois microliters de cada amostra de DNA a pelo menos três frascos.Quando todas as amostras tiverem sido carregadas, feche os tubos e centrífuga para sedimentar a solução na parte inferior de cada frasco. Carregue os frascos em um cicloviário térmico em tempo real para PCR quantitativo, selecionando o cyber como o corante fluoróforo e desconhecido como o tipo de amostra. Em seguida, exporte os dados quantitativos para uma planilha para análise da quantidade relativa de DNA viral em cada amostra.Aqui, imagens representativas de TYLCV em coloração DAPI em PSGs de mosca branca, midguts e ovários são mostradas. Como observado, o TVLCV demonstra um maior acúmulo dentro dos PSGs e dos múguês médios do que nos ovários. A quantificação do vírus em PSGs de mosca branca, mífios, hemofísicas e ovários após se alimentar de tomate infectado por TYLCV por 24, 48 e 72 horas indica que a quantidade de vírus aumenta em diferentes tecidos de mosca branca em correlação direta com o aumento do período de acesso à aquisição.É melhor usar moscas brancas frescas, pois insetos mortos aumentarão a dificuldade de dissecção. Após esse procedimento, outras análises, como manchas ocidentais e co-imunoprecipitação, podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais sobre expressão de proteína viral e interações de proteínas virais e vetoriais.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Detecção de MicroRNAs em Microglia por PCR em tempo real no SNC normal e durante Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Imunologia e Infecção

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Hibridizações in situ de fluorescêncica (FISH) para localização de vírus e bactérias endossimbióticas em tecidos de plantas e insetos

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Quantificação simultânea de T-célula receptora Excisão Circles (TRECs) e K-Excluindo Recombinação Excisão Circles (KRECs) por PCR em tempo real

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Desenvolvimento e validação de um método PCR quantitativa para equídeo herpesvírus 2 Diagnostics em fluidos respiratórios

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotipagem de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; por Ribossômico Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Detecção de alto rendimento de patógenos respiratórios em espécimes animais por Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Mapeamento metabólico: Citoquímica quantitativa enzimática e histoquímica para determinar a atividade de desidrogenases em células e tecidos

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

PCR quantitativo do bacteriófago T7 de Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Indução e pontuação da doença do enxerto versus hospedeiro em modelo murino Xenogeneico e quantificação de células T humanas em tecidos de camundongo utilizando PCR digital

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...