Name: localization and quantification of begomoviruses in whitefly tissues by immunofluorescence and quantitative pcr
Uploaded: 2020-02-08T12:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional De Investigación y Desarrollo Clave (Número de subvención: 2017YFD0200600), el fondo destinado al Sistema de Investigación Agrícola de China (número de subvención: CARS-23-D07) y la Fundación Bill & Melinda Gates (Investment ID OPP11497777 ). Agradecemos al Profesor Jian-Xiang Wu por proporcionar anticuerpos TYLCV CP.

1. Whitefly, Virus, Plantas y Adquisición del Virus
<ol><li>Las moscas blancas traseras (MEAM1) sobre el algodón (Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) en jaulas a prueba de insectos en un invernadero a 26 oC con una luz de 14:10: ciclo oscuro y 60 a 10% de humedad relativa.</li>
	<li>Realizar PCR convencional basado en el gen de citocromo oxidasa I mitocondrial de mosca blanca para determinar la pureza de la población de mosca blanca.<ol>
<li>Recoger 20 moscas blancas adultas y transferirlas individualmente...

<ol>
	<li>Rojas, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+management+of+geminiviruses.">World management of geminiviruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).</li><li>De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bemisia+tabaci:+a+statement+of+species+status.">Bemisia tabaci: a statement of species status.</a> Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).</li><li>Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+virus+diseases+transmitted+by+whiteflies.">Emerging virus diseases transmitted by whiteflies.</a> Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+infection+of+tobacco+plants+improves+performance+of+Bemisia+tabaci+but+more+so+for+an+invasive+than+for+an+indigenous+biotype+of+the+whitefly.">Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).</li><li>Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+effects+of+a+begomovirus+infection+and+host+plant+resistance+on+the+preference+and+development+of+an+insect+vector,+Bemisia+tabaci,+and+implications+for+epidemics.">Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics.</a> PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+alters+the+host+preferences+of+its+vector+Bemisia+tabaci.">Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci.</a> Scientific Reports. 3, 2876 (2013).</li><li>Guo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+transmission+of+papaya+leaf+curl+China+virus+among+four+cryptic+species+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+complex.">Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex.</a> Scientific Reports. 5, 15432 (2015).</li><li>Pan, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+efficiency+of+a+begomovirus+to+cross+the+midgut+of+different+species+of+whiteflies+results+in+variation+of+virus+transmission+by+the+vectors.">Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors.</a> Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).</li><li>Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+leaf+curl+disease:+which+whitefly+is+the+vector.">Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector.</a> Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).</li><li>Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+begomoviruses+and+other+whitefly-borne+viruses:+dependence+on+the+vector+species.">Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species.</a> Phytopathology. , (2019).</li><li>Cohen, S., Nitzany, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+and+host+range+of+the+tomato+yellow+leaf+curl+virus.">Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus.</a> Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).</li><li>Moriones, E., Navas-Castillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus,+an+emerging+virus+complex+causing+epidemics+worldwide.">Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide.</a> Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).</li><li>Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+mechanisms+and+components+that+determine+the+transmission+efficiency+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+(Geminiviridae;+Begomovirus)+by+its+whitefly+vector.">A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector.</a> Virus Research. 186, 47-54 (2014).</li><li>Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+-+a+whitefly-transmitted+geminivirus+with+a+single+genomic+component.">Tomato yellow leaf curl virus - a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component.</a> Virology. 185 (1), 151-161 (1991).</li><li>Sanchez-Campos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus:+No+evidence+for+replication+in+the+insect+vector+Bemisia+tabaci.">Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci.</a> Scientific Reports. 6, 30942 (2016).</li><li>Pakkianathan, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+its+whitefly+vector,+Bemisia+tabaci.">Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci.</a> Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).</li><li>Rodriguez-Negrete, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+the+quantification+of+virion-sense+and+complementary-sense+DNA+strands+of+circular+single-stranded+DNA+viruses.">A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses.</a> Scientific Reports. 4, 6438 (2014).</li><li>Gotz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+Bemisia+tabaci+heat+shock+protein+70+in+Begomovirus-whitefly+interactions.">Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).</li><li>Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+whitefly+vesicle+associated+membrane+protein-associated+protein+B+in+the+transmission+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus.">Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus.</a> Virology. 535, 210-217 (2019).</li><li>Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+benefits+population+growth+of+the+Q+biotype+of+Bemisia+tabaci+(Gennadius)+(Hemiptera:+Aleyrodidae).">Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).</li><li>Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incredible+journey+of+begomoviruses+in+their+whitefly+vector.">The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector.</a> Viruses. 9 (10), 273 (2017).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+development+and+vitellogenin+determine+the+transovarial+transmission+of+begomoviruses.">Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).</li><li>Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+transovarial+transmission+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+by+its+vector,+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci.</a> Virology. 240 (2), 295-303 (1998).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+serological+methods+for+detecting+tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+tomato+plants+and+whiteflies.">Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies.</a> Virology Journal. 10, 142 (2013).</li><li>Arya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+principles+of+real-time+quantitative+PCR.">Basic principles of real-time quantitative PCR.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+cells+in+the+primary+salivary+glands+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+control+retention+and+transmission+of+begomoviruses.">Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses.</a> Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).</li><li>Wang, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagy+pathway+participates+in+resistance+to+tomato+yellow+leaf+curl+virus+infection+in+whiteflies.">The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies.</a> Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).</li><li>Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+2(-Delta+Delta+Ct)+calculation+as+an+alternate+method+of+data+analysis+for+quantitative+PCR+of+BCR-ABL+P210+transcripts.">Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts.</a> Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+gene+selection+for+qRT-PCR+analysis+in+the+sweetpotato+whitefly,+Bemisia+tabaci+(Hemiptera:+Aleyrodidae).">Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).</li></ol>

Aquí describimos un protocolo para la localización y cuantificación de un begomovirus en los tejidos de su vector de mosca blanca por inmunofluorescencia y qPCR. La disección representa el primer paso para localizar y cuantificar el virus en los tejidos de mosca blanca. El cuerpo de la mosca blanca es de aproximadamente 1 mm de longitud, lo que significa que los tejidos son extremadamente pequeños, y es difícil diseccionarlos. Además, hay fuertes conexiones entre los tejidos. Por ejemplo, los ovarios están estrec...

En las últimas décadas, los begomovirus (género Begomovirus,familia Geminiviridae)han causado graves daños a la producción de muchos cultivos vegetales, de fibra y ornamentales en todo el mundo1. Los begomovirus son transmitidos de manera persistente por la mosca blanca Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), que es una especie compleja que contiene más de 35 especies crípticas2,3. Los begomovirus pueden afectar directa o indirectamente a la fisiología y el comportamiento de las moscas blancas, como la fecundidad4,la longevidad4y la preferencia del huésped5,6. Además, la eficiencia de transmisión de una especie/cepa de begomovirus determinada varía para diferentes especies crípticas de mosca blanca incluso en las mismas condiciones experimentales7,8,9,10, lo que indica que hay una interacción compleja entre begomovirus y moscas blancas. Para comprender mejor los mecanismos subyacentes a las interacciones entre mosca blanca y begomovirus, la localización y cuantificación del virus en los tejidos de mosca blanca son esenciales.
El virus del rizo de hoja amarilla de tomate (TYLCV) es un begomovirus que se notificó por primera vez en Israel pero que hoy en día causa graves daños a la producción de tomate en todo el mundo11,12. Debido a su importancia económica, es uno de los begomovirus13mejor estudiados. Al igual que otros begomovirus monopartitos, TYLCV es un virus de ADN circular de una sola cadena con un tamaño de genoma de aproximadamente 2.800 nucleótidos14. Mientras todavía está en debate, varias líneas de evidencia apoyan la replicación de TYLCV en las moscas blancas15,16,17. Además, se ha notificado la interacción de partículas TYLCV y proteínas de mosca blanca6,18,19,20. Para la transmisión del virus, las moscas blancas adquieren TYLCV alimentándose de plantas infectadas por virus, los viriones pasan a lo largo del canal de alimentos para llegar al esófago, penetran en la pared del intestino medio para llegar a la hemolinfa y luego se translocan en las glándulas salivales primarias (PSG). Finalmente, los viriones se egasíd con saliva a lo largo del conducto salival en el phloem vegetal21. Además, varios estudios muestran que TYLCV es capaz de ser transmitido transovarialmente de las moscas blancas hembras a su descendencia22,23. En otras palabras, para lograr una transmisión productiva, el virus tiene que superar las barreras celulares dentro de la mosca blanca para transubicarse de un tejido a otro. Durante el cruce de estas barreras, es probable que se produzcan interacciones entre las moscas blancas y las proteínas del virus, probablemente determinando la eficiencia con la que se transmiten los virus.
La inmunofluorescencia es una técnica comúnmente utilizada para el análisis de distribución de proteínas. La especificidad de los anticuerpos que se unen a su antígeno forman la base de la inmunofluorescencia. Debido a la importancia económica de TYLCV, se han desarrollado anticuerpos monoclonales contra la proteína de recubrimiento TYLCV, ofreciendo una forma altamente sensible de localizar el virus24. El PCR cuantitativo (qPCR) permite la cuantificación sensible y específica de los ácidos nucleicos. Esta técnica se basa con mayor frecuencia en el uso de sonda de hidrólisis (por ejemplo, TaqMan) o detección de tinte fluorescente (por ejemplo, SYBR Green). Para el qPCR basado en sondas de hidrólisis, se necesitan sondas específicas, lo que en consecuencia aumenta el costo. El qPCR basado en tintes fluorescentes es más simple y rentable, ya que las sondas de hibridación específicas del amplificador etiquetadas no son necesarias25. Hasta ahora, varios estudios han utilizado inmunofluorescencia y qPCR junto con otros métodos para investigar las complejas interacciones begomovirus-mosca blanca. Por ejemplo, Pan et al. realizaron un análisis qPCR e inmunofluorescencia del virus en tejidos de mosca blanca y encontraron que la diferencia en la capacidad de transmitir el virus del brote rizado de tabaco (TbCSV) entre las especies de moscas blancas AsiaII 1 y Asia Medio Menor 1 (MEAM1) se debía a que el virus era capaz de cruzar eficientemente la pared intermedia de AsiaII1 pero no MEAM18. Del mismo modo, mientras que las moscas blancas mediterráneas (MED) pueden transmitir fácilmente TYLCV, no transmiten el virus de China curva de hoja amarilla de tomate (TYLCCNV). La transmisión selectiva se investigó utilizando la detección de inmunofluorescencia de virus en los PSG, lo que demostró que TYLCCNV no cruza fácilmente los PSG de las moscas blancas MED26. La colocalización de inmunofluorescencia de TYLCV CP y la proteína marcadora de autofagia ATG8-II en las moscas blancas muestran que la autofagia desempeña un papel crítico en la represión de la infección de TYLCV en la mosca blanca27.
Aquí, utilizando TYLCV como ejemplo, describimos un protocolo para la localización de begomovirus en las moscas blancas, PSG y ovarios mediante una técnica de inmunofluorescencia. La técnica incluye disección, fijación e incubación con anticuerpos secundarios primarios y etiquetados con tinte. Las señales de fluorescencia que muestran la ubicación de las proteínas virales en los tejidos de las moscas blancas se pueden detectar bajo un microscopio confocal. Más importante aún, este protocolo se puede utilizar para colocalizar proteínas begomovirales y de mosca blanca. Además, describimos un protocolo para la cuantificación de TYLCV utilizando qPCR basado en SYBR Green en los intestinos medios de mosca blanca, PSG, hemolinfa y ovarios, que se puede utilizar para comparar la cantidad de virus en diferentes muestras de tejido de mosca blanca.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>MultiSciences</td>
			<td>F0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole (DAPI)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>MultiSciences</td>
			<td>A3828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>185-5201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-goat anti-mouse</td>
			<td>Earthox</td>
			<td>E032310-02</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody (MAb 1C4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B548119-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820A</td>
			<td>qPCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A41182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissuelyzer</td>
			<td>Shaghai jingxin</td>
			<td>Tissuelyser-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization and quantification of begomoviruses in whitefly tissues by immunofluorescence and quantitative pcr

Los begomovirus (género Begomovirus,familia Geminiviridae)son transmitidos por las moscas blancas del complejo Bemisia tabaci de una manera persistente y circulativa. Teniendo en cuenta los extensos daños causados por los begomovirus a la producción de cultivos en todo el mundo, es imperativo entender la interacción entre los begomovirus y su vector de mosca blanca. Para ello, la localización y cuantificación del virus en los tejidos vectoriales es crucial. Aquí, utilizando el virus del rizo de hoja amarilla de tomate (TYLCV) como ejemplo, describimos un protocolo detallado para localizar begomovirus en las moscas blancas, glándulas salivales primarias y ovarios por inmunofluorescencia. El método se basa en el uso de anticuerpos específicos contra una proteína de capa de virus, anticuerpos secundarios etiquetados con tinte y un microscopio confocal. El protocolo también se puede utilizar para colocalizar proteínas begomovirales y de mosca blanca. Además, describimos un protocolo para la cuantificación de TYLCV en las moscas blancas, las glándulas salivales primarias, la hemolinfa y los ovarios por PCR cuantitativo (qPCR). Utilizando imprimaciones diseñadas específicamente para TYLCV, los protocolos para la cuantificación permiten la comparación de la cantidad de TYLCV en diferentes tejidos de la mosca blanca. El protocolo descrito es potencialmente útil para la cuantificación de begomovirus en el cuerpo de una mosca blanca y una planta infectada por el virus. Estos protocolos se pueden utilizar para analizar la vía de circulación de begomovirus en la mosca blanca o como complemento a otros métodos para estudiar las interacciones entre mosca blanca y begomovirus.

Las moscas blancas MEAM1 del complejo B. tabaci y TYLCV se utilizaron como ejemplo aquí para describir los procedimientos. La descripción general de los procedimientos de inmunofluorescencia y cuantificación viral descritos en este manuscrito se muestra en la Figura 1. La Figura 2 muestra resultados representativos de la detección de inmunofluorescencia de tinción TYLCV y DAPI en PSG, midguts y ovarios, lo que indica que TYLCV acumuló más en los ...

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Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

Describimos un método de inmunofluorescencia y PCR cuantitativo para la localización y cuantificación de begomovirus en tejidos de insectos. El protocolo de inmunofluorescencia se puede utilizar para colocalizar proteínas virales y vectoriales. El protocolo cuantitativo de PCR puede ampliarse para cuantificar los virus en cuerpos enteros de moscas blancas y plantas infectadas por virus.

Localización y cuantificación de begomovirus en tejidos de mosca blanca por inmunofluorescencia y PCR cuantitativa

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. ...

Aclarar la espacialidad y la cantidad de virus en los vectores de mosca blanca puede ayudar a comprender las interacciones begomovirus-mosca blanca y en el desarrollo de nuevas estrategias para controlar las enfermedades begomovirales graves. Las ventajas de esta técnica son que podemos aislar rápidamente los tejidos de la mosca blanca, co-localizar proteínas virales y moscas blancas, y cuantificar los virus en cuerpos enteros de mosca blanca y plantas infectadas por el virus. En el momento experimental apropiado, después de la adquisición del virus, coloque las moscas blancas hembra anestesiadas con hielo en una gota de PBS en un portaobjetos del microscopio y utilice una aguja de acupuntura fina para abrir el abdomen de la mosca blanca bajo un microscopio estéreo.Utilice la aguja para extraer el intestino medio y colocar el en la parte media en un plato de colección de PBS. Para recoger los PSG, divida el cuerpo en el tórax del lado dorsal cerca de la cabeza y fije la mosca blanca con una aguja a través del tórax. Usa una segunda aguja para agitar la mosca blanca hasta que las dos glándulas salivales se separen del cuerpo y transfiera las glándulas a un nuevo plato de PBS.Para recoger los ovarios, abra completamente el abdomen y use una aguja para separar los ovarios de los otros tejidos. Use una pipeta para eliminar el exceso de tejido y transferir los ovarios a un nuevo plato de PBS. Para recoger una muestra de hemofinada, agregue 10 microlitros de PBS en una nueva diapositiva del microscopio y coloque una nueva mosca blanca en la gota.Use una aguja de acupuntura fina para hacer suavemente un agujero en el abdomen. A continuación, aplique una ligera presión sobre el abdomen para liberar la hemolímpido en el tampón y recoja una muestra de ocho microlitros del líquido. Para visualizar la localización de TYLCV en PSG de mosca blanca, midgut o tejidos ováricos cosechados, transfiera de 15 a 20 especímenes a un plato de Petri de 3,5 centímetros de vidrio y aspire el exceso de tampón.Fije los tejidos en un mililitro de 4%paraformaldehído durante dos horas a temperatura ambiente antes de lavar cuidadosamente las muestras tres veces durante dos minutos en un mililitro de TBS fresco por lavado. Después del último lavado, permeabilizar las muestras con un mililitro de 0.5%Triton X-100 durante 30 minutos antes de lavar tres veces como se acaba de demostrar con un mililitro de TBST por lavado. Después del último lavado, bloquee cualquier unión inespecífica con un mililitro de albúmina sérica bovina al 1% durante dos horas a temperatura ambiente seguida de tres lavados en TBST como se ha demostrado.Después del último lavado, etiquete las células con los anticuerpos primarios de interés durante la noche a cuatro grados centígrados protegidos de la luz. A la mañana siguiente, lave las muestras tres veces con TBST antes de añadir los anticuerpos secundarios apropiados durante dos horas a temperatura ambiente protegidos de la luz. Al final de la incubación, lave las placas medias tres veces y transfiera las muestras a un portaobjetos limpio.Retire tanto tampón como sea posible y manche los núcleos con una gota de DAPI antes de montarlos con un cubreobjetos y examinar los tejidos etiquetados mediante microscopía confocal. Para la cuantificación de TYLCV, lave las muestras de tejido de mosca blanca cosechadas de dos a tres veces en PBS fresco y transfiera 20 fálicas medianas, 20 HPG o un ovario en cinco microlitros de PBS en tubos de PCR individuales que contengan 25 microlitros de solución de lysis. Agregue de cinco a siete perlas cerámicas de dos milímetros de diámetro a cada tubo y muele las muestras en un homogeneizador.Agregue una muestra de ocho microlitros de hemólimpa en un nuevo tubo de PCR y agregue 10 microlitros de lysis al tubo con una mezcla exhaustiva. Incubar todas las muestras a 65 grados centígrados durante una hora seguida de una incubación de 10 minutos a 100 grados centígrados y una breve centrifugación. A continuación, añada 18 microlitros de mezcla maestra en los viales de tubos cuantitativos de tiras de PCR y añada dos microlitros de cada muestra de ADN a al menos tres viales.Una vez cargadas todas las muestras, cierre los tubos y la centrífuga para sedimentar la solución en el fondo de cada vial. Cargue los viales en un ciclor térmico en tiempo real para PCR cuantitativo, seleccionando cibernética como el tinte de fluoróforo y desconocido como el tipo de muestra. A continuación, exporte los datos cuantitativos a una hoja de cálculo para el análisis de la cantidad relativa de ADN viral en cada muestra.Aquí, se muestran imágenes representativas de TYLCV en la tinción DAPI en PSG de mosca blanca, midguts y ovarios. Como se observó, TVLCV demuestra una mayor acumulación dentro de los PSG y midguts que en los ovarios. La cuantificación del virus en PSG de moscas blancas, midguts, hemolymph y ovarios después de alimentarse de tomate infectado por TYLCV durante 24, 48 y 72 horas indica que la cantidad de virus aumenta en diferentes tejidos de mosca blanca en correlación directa con el aumento del período de acceso a la adquisición.Lo mejor es utilizar moscas blancas frescas, ya que los insectos muertos aumentarán la dificultad de la disección. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros análisis, como la hinchazón occidental y la inmunoprocipitación, para responder preguntas adicionales sobre la expresión de proteínas virales y las interacciones virales y de proteínas vectoriales.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Investigación

Inmunología e Infección

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