Name: localization and quantification of begomoviruses in whitefly tissues by immunofluorescence and quantitative pcr
Uploaded: 2020-02-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Key Research and Development Program (Bidragsnummer: 2017YFD0200600), den öronmärkta fonden för China Agriculture Research System (bidragsnummer: CARS-23-D07) och Bill & Melinda Gates Foundation (Investment ID OPP11497777 ). Vi tackar professor Jian-Xiang Wu för att ge TYLCV CP antikroppar.

1. Whitefly, Virus, Växter och förvärv av viruset
<ol><li>Bakre whiteflies (MEAM1) på bomull(Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) i insektssäkra burar i ett växthus vid 26 ± 1 °C med en 14:10 ljus:mörk cykel och 60 ± 10% relativ luftfuktighet.</li>
	<li>Utför konventionell PCR baserad på whitefly mitokondriell cytokrom oxidas jag gen för att bestämma renhet whitefly befolkningen.<ol>
<li>Samla in 20 vuxna vitflugor och överföra dem individuellt till ett PCR-rör som innehåller 30 μL lysbuffer...

<ol>
	<li>Rojas, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+management+of+geminiviruses.">World management of geminiviruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).</li><li>De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bemisia+tabaci:+a+statement+of+species+status.">Bemisia tabaci: a statement of species status.</a> Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).</li><li>Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+virus+diseases+transmitted+by+whiteflies.">Emerging virus diseases transmitted by whiteflies.</a> Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+infection+of+tobacco+plants+improves+performance+of+Bemisia+tabaci+but+more+so+for+an+invasive+than+for+an+indigenous+biotype+of+the+whitefly.">Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).</li><li>Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+effects+of+a+begomovirus+infection+and+host+plant+resistance+on+the+preference+and+development+of+an+insect+vector,+Bemisia+tabaci,+and+implications+for+epidemics.">Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics.</a> PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+alters+the+host+preferences+of+its+vector+Bemisia+tabaci.">Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci.</a> Scientific Reports. 3, 2876 (2013).</li><li>Guo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+transmission+of+papaya+leaf+curl+China+virus+among+four+cryptic+species+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+complex.">Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex.</a> Scientific Reports. 5, 15432 (2015).</li><li>Pan, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+efficiency+of+a+begomovirus+to+cross+the+midgut+of+different+species+of+whiteflies+results+in+variation+of+virus+transmission+by+the+vectors.">Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors.</a> Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).</li><li>Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+leaf+curl+disease:+which+whitefly+is+the+vector.">Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector.</a> Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).</li><li>Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+begomoviruses+and+other+whitefly-borne+viruses:+dependence+on+the+vector+species.">Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species.</a> Phytopathology. , (2019).</li><li>Cohen, S., Nitzany, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+and+host+range+of+the+tomato+yellow+leaf+curl+virus.">Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus.</a> Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).</li><li>Moriones, E., Navas-Castillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus,+an+emerging+virus+complex+causing+epidemics+worldwide.">Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide.</a> Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).</li><li>Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+mechanisms+and+components+that+determine+the+transmission+efficiency+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+(Geminiviridae;+Begomovirus)+by+its+whitefly+vector.">A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector.</a> Virus Research. 186, 47-54 (2014).</li><li>Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+-+a+whitefly-transmitted+geminivirus+with+a+single+genomic+component.">Tomato yellow leaf curl virus - a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component.</a> Virology. 185 (1), 151-161 (1991).</li><li>Sanchez-Campos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus:+No+evidence+for+replication+in+the+insect+vector+Bemisia+tabaci.">Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci.</a> Scientific Reports. 6, 30942 (2016).</li><li>Pakkianathan, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+its+whitefly+vector,+Bemisia+tabaci.">Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci.</a> Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).</li><li>Rodriguez-Negrete, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+the+quantification+of+virion-sense+and+complementary-sense+DNA+strands+of+circular+single-stranded+DNA+viruses.">A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses.</a> Scientific Reports. 4, 6438 (2014).</li><li>Gotz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+Bemisia+tabaci+heat+shock+protein+70+in+Begomovirus-whitefly+interactions.">Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).</li><li>Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+whitefly+vesicle+associated+membrane+protein-associated+protein+B+in+the+transmission+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus.">Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus.</a> Virology. 535, 210-217 (2019).</li><li>Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+benefits+population+growth+of+the+Q+biotype+of+Bemisia+tabaci+(Gennadius)+(Hemiptera:+Aleyrodidae).">Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).</li><li>Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incredible+journey+of+begomoviruses+in+their+whitefly+vector.">The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector.</a> Viruses. 9 (10), 273 (2017).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+development+and+vitellogenin+determine+the+transovarial+transmission+of+begomoviruses.">Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).</li><li>Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+transovarial+transmission+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+by+its+vector,+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci.</a> Virology. 240 (2), 295-303 (1998).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+serological+methods+for+detecting+tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+tomato+plants+and+whiteflies.">Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies.</a> Virology Journal. 10, 142 (2013).</li><li>Arya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+principles+of+real-time+quantitative+PCR.">Basic principles of real-time quantitative PCR.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+cells+in+the+primary+salivary+glands+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+control+retention+and+transmission+of+begomoviruses.">Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses.</a> Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).</li><li>Wang, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagy+pathway+participates+in+resistance+to+tomato+yellow+leaf+curl+virus+infection+in+whiteflies.">The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies.</a> Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).</li><li>Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+2(-Delta+Delta+Ct)+calculation+as+an+alternate+method+of+data+analysis+for+quantitative+PCR+of+BCR-ABL+P210+transcripts.">Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts.</a> Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+gene+selection+for+qRT-PCR+analysis+in+the+sweetpotato+whitefly,+Bemisia+tabaci+(Hemiptera:+Aleyrodidae).">Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).</li></ol>

Här beskriver vi ett protokoll för lokalisering och kvantifiering av ett begomovirus i vävnaderna i sin whitefly vektor av immunofluorescens och qPCR. Dissekering representerar det första steget för att lokalisera och kvantifiera viruset i whitefly vävnader. Den whitefly kroppen är ca 1 mm i längd, vilket innebär att vävnaderna är extremt små, och det är svårt att dissekera dem. Dessutom finns det starka kopplingar mellan vävnaderna. Äggstockarna är till exempel tätt kopplade till bakteriocyterna, vilke...

Under de senaste decennierna har begomovirus (släktet Begomovirus, familj Geminiviridae) orsakat allvarliga skador på produktionen av många vegetabiliska, fibrer och prydnadsgrödor över hela världen1. Begomovirus överförs på ett ihållande sätt av whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), som är en komplex art som innehåller över 35 kryptiska arter2,3. Begomovirus kan direkt eller indirekt påverka whitefly fysiologi och beteende, såsom fruktsamhet4,livslängd4, och värd preferens5,6. Dessutom varierar överföringseffektiviteten hos en viss begomovirusarter/stam för olika vitfluga kryptiska arter även under samma experimentella förhållanden7,8,9,10, vilket tyder på att det finns en komplex interaktion mellan begomovirus och vitflugor. För att bättre förstå de mekanismer som ligger bakom whitefly-begomovirus interaktioner, lokalisering och kvantifiering av viruset i whitefly vävnader är viktiga.
Tomat gult blad curl virus (TYLCV) är en begomovirus som först rapporterades i Israel men numera orsakar allvarliga skador på tomatproduktion över hela världen11,12. På grund av dess ekonomiska betydelse är det en avde bäst studerade begomovirus13 . Liksom andra monopartite begomovirus, tylCV är en enda sträng cirkulärDNA-virus med en genomstorlek på ca 2.800 nukleotider14. Även om fortfarande under debatt, flera rader av bevis stöder replikering av TYLCV i whiteflies15,16,17. Dessutom har interaktionen mellan TYLCV-partiklar och vitfluga proteiner rapporterats6,18,19,20. För virusöverföring förvärvar whiteflies TYLCV genom att livnära sig på virusinfekterade växter, virions passerar längs matkanalen för att nå matstrupen, penetrera midgutväggen för att nå hemolymph, och sedan flytta in i de primära salivary körtlar (PSGs). Slutligen, virions egested med saliv längs spottatid i växt phloem21. Dessutom visar flera studier att TYLCV kan överföras transovarially från kvinnliga vitflugor till deras avkomma22,23. Med andra ord, för att uppnå produktiv överföring, måste viruset övervinna cellulära hinder inom whitefly att flytta från en vävnad till en annan. Under korsningen av dessa hinder, interaktioner mellan whitefly och virusproteiner kommer sannolikt att uppstå, förmodligen bestämma den effektivitet med vilken virusöverförs.
Immunofluorescens är en vanlig teknik för proteindistribution analys. Specificiteten hos antikroppar som är bindande för deras antigen utgör grunden för immunfluorescens. På grund av den ekonomiska betydelsen av TYLCV, monoklonala antikroppar mot TYLCV päls protein har utvecklats, erbjuder ett mycket känsligt sätt att lokalisera viruset24. Kvantitativ PCR (qPCR) möjliggör känslig och specifik kvantifiering av nukleinsyror. Denna teknik baseras oftast på användning av hydrolyssond (t.ex. TaqMan) eller fluorescerande färgämne (t.ex. SYBR Green) detektion. För hydrolys sondbaserad qPCR behövs specifika sonder, vilket därmed ökar kostnaden. Fluorescerande färgämnesbaserad qPCR är enklare och mer kostnadseffektivt, eftersom märkta ampliconspecifika hybridiseringssonder inte krävs25. Hittills har flera studier använt immunofluorescens och qPCR tillsammans med andra metoder för att undersöka komplexa begomovirus-whitefly interaktioner. Pan et al. utförde till exempel qPCR- och immunfluorescensanalys av viruset i vitfluga vävnader och fann att skillnaden i förmåga att överföra tobakslockfritt skjuta virus (TbCSV) mellan vitfluga arter AsiaII 1 och Mellanöstern Asien Mindre 1 (MEAM1) berodde på att viruset effektivt kunde korsa midgut väggen i AsiaII1 men inte MEAM18. På samma sätt, medan Medelhavet (MED) whiteflies lätt kan överföra TYLCV, misslyckas de med att överföra tomatgula blad curl Kina virus (TYLCCNV). Selektiv överföring undersöktes med hjälp av immunofluorescens detektion av virus i PSGs, som visade att TYLCCNV inte lätt korsar PSGs av MED whiteflies26. Immunofluorescens colocalization av TYLCV CP och autofagi markör protein ATG8-II i whitefly midguts visar att autofagi spelar en avgörande roll för att undertrycka infektionen av TYLCV i whitefly27.
Här, med tylcv som exempel, beskriver vi ett protokoll för lokalisering av begomovirus i whitefly midguts, PSGs och äggstockar genom en immunofluorescens teknik. Tekniken innehåller dissekering, fixering och inkubation med primära och färgmärkta sekundära antikroppar. Fluorescenssignaler som visar placeringen av virusproteiner i whitefly vävnaderna kan sedan upptäckas under ett konfokalmikroskop. Ännu viktigare är att detta protokoll kan användas för att kolokalisera begomovirala och whitefly proteiner. Vi beskriver vidare ett protokoll för kvantifiering av TYLCV med SYBR Green-baserade qPCR i whitefly midguts, PSGs, hemolymph och äggstockar, som kan användas för att jämföra mängden virus i olika whitefly vävnad prover.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>MultiSciences</td>
			<td>F0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole (DAPI)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>MultiSciences</td>
			<td>A3828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>185-5201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-goat anti-mouse</td>
			<td>Earthox</td>
			<td>E032310-02</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody (MAb 1C4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B548119-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820A</td>
			<td>qPCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A41182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissuelyzer</td>
			<td>Shaghai jingxin</td>
			<td>Tissuelyser-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization and quantification of begomoviruses in whitefly tissues by immunofluorescence and quantitative pcr

Begomovirus (släktet Begomovirus, familj Geminiviridae) överförs av whiteflies av Bemisia tabaci komplex på ett ihållande, cirkulerande sätt. Med tanke på de omfattande skador som orsakas av begomovirus att beskära produktionen över hela världen, är det absolut nödvändigt att förstå samspelet mellan begomovirus och deras whitefly vektor. För att göra detta är lokalisering och kvantifiering av viruset i vektorvävnaderna avgörande. Här, med hjälp av tomatgula blad curl virus (TYLCV) som ett exempel, beskriver vi ett detaljerat protokoll för att lokalisera begomovirus i whitefly midguts, primära salivary körtlar, och äggstockar genom immunfluorescens. Metoden är baserad på användning av specifika antikroppar mot ett virusskiktprotein, färgmärkta sekundära antikroppar och ett konfokalmikroskop. Protokollet kan också användas för att kolokalisera begomovirala och whitefly proteiner. Vi beskriver vidare ett protokoll för kvantifiering av TYLCV i whitefly midguts, primära salivary körtlar, hemolymph och äggstockar av kvantitativpcr (qPCR). Med hjälp av primers speciellt utformade för TYLCV, protokollen för kvantifiering möjliggör jämförelse av mängden TYLCV i olika vävnader i whitefly. Det beskrivna protokollet är potentiellt användbart för kvantifiering av begomovirus i kroppen av en whitefly och en virusinfekterad växt. Dessa protokoll kan användas för att analysera spridningsvägen för begomovirus i whitefly eller som ett komplement till andra metoder för att studera whitefly-begomovirus interaktioner.

MEAM1-whitefliesna av B. tabacikomplexoch TYLCV användes som ett exempel här för att beskriva tillvägagångssätten. Översikten över de immunfluorescens- och viruskvantifieringsförfaranden som beskrivs i detta manuskript visas i figur 1. Figur 2 visar representativa resultat av immunofluorescensdetektion av TYLCV och DAPI-färgning i PSGs, midguts och äggstockar, vilket tyder på att TYLCV ackumulerade mer i PSG:erna och midguts, och mindre i ä...

Watch this Scientific Journal Video about Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR at JoVE.com

Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

Vi beskriver en immunofluorescens och kvantitativ PCR-metod för lokalisering och kvantifiering av begomovirus i insektsvävnader. Immunofluorescensprotokollet kan användas för att kolokalisera virus- och vektorproteiner. Det kvantitativa PCR-protokollet kan utvidgas till att kvantifiera virus i hela whitefly-kroppar och virusinfekterade växter.

Lokalisering och kvantifiering av begomovirus i Whitefly Vävnader av Immunofluorescens och kvantitativ pcr

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. ...

Klargöra spatialitet och mängd av virus i whitefly vektorer kan hjälpa till att förstå begomovirus-whitefly interaktioner och i utvecklingen av nya strategier för att kontrollera allvarliga begomoviral sjukdomar. Fördelarna med denna teknik är att vi snabbt kan isolera whitefly vävnader, samlokalisera virus- och whiteflyproteiner, och kvantifiera virus i whitefly hela kroppar och virusinfekterade växter. Vid lämplig experimentell tidpunkt, efter virus förvärv, placera is sövda kvinnliga whiteflies i en droppe PBS på ett mikroskop glida och använda en fin akupunktur nål för att öppna buken av whitefly under ett stereomikroskop.Använd nålen för att extrahera midgut och placera midgut i en samling maträtt av PBS. För att samla in PSGs, dela kroppen vid bröstkorgen från dorsala sidan nära huvudet och fixa whitefly med en nål genom bröstkorgen. Använd en andra nål för att skaka whitefly tills de två spottkörtlarna separeras från kroppen och överföra körtlar till en ny maträtt av PBS.För att samla äggstockarna, helt öppna buken och använd en nål för att separera äggstockarna från de andra vävnaderna. Använd en pipett för att ta bort överflödig vävnad och överföra äggstockarna till en ny maträtt av PBS. För att samla in en hemolymph prov, tillsätt 10 mikroliter PBS på ett nytt mikroskop glida och placera en ny whitefly i droppen.Använd en fin akupunktur nål för att försiktigt göra ett hål i buken. Applicera sedan lätt tryck på buken för att släppa hemolymph i bufferten och samla in en åtta mikroliter prov av vätskan. För att visualisera TYLCV lokalisering i skördade whitefly PSG, midgut, eller äggstocksvävnader, överföra 15 till 20 exemplar i ett glas 3,5 centimeter Petriskål och aspirera överskottet buffert.Fixera vävnaderna i en milliliter av 4%paraformaldehyd i två timmar i rumstemperatur innan du försiktigt tvättar proverna tre gånger i två minuter i en milliliter färsk TBS per tvätt. Efter den sista tvätten, permeabilize proverna med en milliliter på 0,5%Triton X-100 i 30 minuter före tvättning tre gånger som just visat med en milliliter TBST per tvätt. Efter den sista tvätten, blockera eventuell ospecifik bindning med en milliliter av 1%bovint serumalbumin i två timmar vid rumstemperatur följt av tre tvättar i TBST som visats.Efter den sista tvätten, märka cellerna med de primära antikroppar av intresse över natten vid fyra grader Celsius skyddas från ljus. Nästa morgon tvättar du proverna tre gånger med TBST innan lämpliga sekundära antikroppar tillsätts i två timmar vid rumstemperatur som skyddas från ljus. Vid slutet av inkubationen, tvätta midguterna tre gånger och överför exemplaren till en ren mikroskopsglas.Ta bort så mycket buffert som möjligt och fläcka kärnorna med en droppe DAPI innan montering med en täckfärg och undersöka de märkta vävnaderna genom konfokalmikroskopi. För TYLCV-kvantifiering, tvätta de skördade whitefly vävnadsproverna två till tre gånger i färska PBS och överför 20 midguts, 20 PSGs, eller en äggstock i fem mikroliter av PBS till enskilda PCR-rör som innehåller 25 mikroliter av lyslösning. Tillsätt fem till sju två millimeter diameter keramiska pärlor till varje rör och slipa proverna i en homogenisator.Lägg till en åtta microliter prov av hemolymph i en ny PCR-röret och tillsätt 10 mikroliter av lys till röret med grundlig blandning. Inkubera alla prover vid 65 grader Celsius i en timme följt av en 10-minuters inkubation vid 100 grader Celsius och en kort centrifugering. Därefter lägger du till 18 mikroliter master mix i injektionsflaskan med kvantitativa PCR-bandrör och tillsätt två mikroliter av varje DNA-prov till minst tre injektionsflaska.När alla prover har belastats, stäng rören och centrifug till sediment lösningen i botten av varje injektionsflaska. Ladda injektionsflaskan på en termisk cycler i realtid för kvantitativ PCR, välja cyber som fluoroforefärgämne och okänt som provtyp. Exportera sedan de kvantitativa uppgifterna till ett kalkylblad för analys av den relativa mängden virus-DNA i varje prov.Här visas representativa bilder av TYLCV i DAPI-färgning i whitefly PSGs, midguts och äggstockar. Som observerats visar TVLCV en större ackumulering inom psg och midguts än i äggstockarna. Kvantifiering av viruset i whitefly PSGs, midguts, hemolymph och äggstockar efter utfodring på TYLCV-infekterade tomat för 24, 48 och 72 timmar indikerar att mängden virus ökar i olika whitefly vävnader i direkt korrelation till ökningen av förvärv tillgång period.Det är bäst att använda färska whiteflies, som döda insekter kommer att öka svårigheten att dissekera. Efter detta förfarande kan andra analyser, som western blotting och co-immunoprecipitation, utföras för att besvara ytterligare frågor om viralt proteinuttryck och virala och vektorproteininteraktioner.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Detektering av MikroRNA i Mikroglia av Real-time PCR i normala CNS och under Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridiseringar (FISH) för lokalisering av virus och endosymbiotiska Bakterier i växt-och insekts vävnader

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Samtidig Kvantifiering av T-cellreceptor Excision cirklar (TRECs) och K-Radering Rekombination Excision cirklar (KRECs) genom realtids-PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Utveckling och validering av en kvantitativ PCR-metod för hästdjur Herpesvirus-2 Diagnostik i Andnings Vätskor

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotypning av<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; vid Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Hög genomströmning Upptäckt av luftvägspatogener i Animal Prover av nano PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Metaboliska Mapping: Kvantitativa enzymet Cytochemistry och histokemi bestämma aktiviteten av mellan östradiol och östron i celler och vävnader

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Kvantifiering av Efferocytosis av Single-cell fluorescensmikroskopi

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

Kvantitativ PCR av T7 Bacteriophage från Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Induktion och poängsättning av graft-versus-host-sjukdom i en Xenogeneisk murin modell och kvantifiering av humana T-celler i mus vävnader med hjälp av digital PCR

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...