Name: localization and quantification of begomoviruses in whitefly tissues by immunofluorescence and quantitative pcr
Uploaded: 2020-02-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (Hibe numarası: 2017YFD0200600), Çin Tarım Araştırma Sistemi (hibe numarası: CARS-23-D07) ve Bill & Melinda Gates Vakfı (Yatırım Kimliği OPP1149777) için ayrılmış fon tarafından desteklenmiştir ). Prof. Jian-Xiang Wu'ya TYLCV CP antikorları sağladığı için teşekkür ederiz.

1. Whitefly, Virüs, Bitkiler ve Virüs Edinimi
<ol><li>Arka beyaz sinekler (MEAM1) pamuk(Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) 14:10 ışık: karanlık döngüsü ve 60 ± % 10 bağıl nem ile 26 ± 1 °C bir serada böcek geçirmez kafeslerde.</li>
	<li>Whitefly popülasyonunun saflığını belirlemek için whitefly mitokondriyal sitokrom oksidaz I genine dayalı geleneksel PCR gerçekleştirin.<ol>
<li>20 yetişkin beyaz sinek toplayın ve 30 μL lysis tampon (10 mM Tris, pH = 8.4, 50 mM KCl, 0.45% [wt/vol]...

<ol>
	<li>Rojas, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+management+of+geminiviruses.">World management of geminiviruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).</li><li>De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bemisia+tabaci:+a+statement+of+species+status.">Bemisia tabaci: a statement of species status.</a> Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).</li><li>Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+virus+diseases+transmitted+by+whiteflies.">Emerging virus diseases transmitted by whiteflies.</a> Annual Review of Phytopathology. 49, 219-248 (2011).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+infection+of+tobacco+plants+improves+performance+of+Bemisia+tabaci+but+more+so+for+an+invasive+than+for+an+indigenous+biotype+of+the+whitefly.">Viral infection of tobacco plants improves performance of Bemisia tabaci but more so for an invasive than for an indigenous biotype of the whitefly.</a> Journal of Zhejiang University-Science B. 11 (1), 30-40 (2010).</li><li>Legarrea, S., Barman, A., Marchant, W., Diffie, S., Srinivasan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+effects+of+a+begomovirus+infection+and+host+plant+resistance+on+the+preference+and+development+of+an+insect+vector,+Bemisia+tabaci,+and+implications+for+epidemics.">Temporal effects of a begomovirus infection and host plant resistance on the preference and development of an insect vector, Bemisia tabaci, and implications for epidemics.</a> PLoS One. 10 (11), 0142114 (2015).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+alters+the+host+preferences+of+its+vector+Bemisia+tabaci.">Tomato yellow leaf curl virus alters the host preferences of its vector Bemisia tabaci.</a> Scientific Reports. 3, 2876 (2013).</li><li>Guo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+transmission+of+papaya+leaf+curl+China+virus+among+four+cryptic+species+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+complex.">Comparison of transmission of papaya leaf curl China virus among four cryptic species of the whitefly Bemisia tabaci complex.</a> Scientific Reports. 5, 15432 (2015).</li><li>Pan, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+efficiency+of+a+begomovirus+to+cross+the+midgut+of+different+species+of+whiteflies+results+in+variation+of+virus+transmission+by+the+vectors.">Differential efficiency of a begomovirus to cross the midgut of different species of whiteflies results in variation of virus transmission by the vectors.</a> Science China-Life Sciences. 61 (10), 1254-1265 (2018).</li><li>Pan, L. L., Cui, X. Y., Chen, Q. F., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+leaf+curl+disease:+which+whitefly+is+the+vector.">Cotton leaf curl disease: which whitefly is the vector.</a> Phytopathology. 108 (10), 1172-1183 (2018).</li><li>Fiallo-Olive, E., Pan, L. L., Liu, S. S., Navas-Castillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+begomoviruses+and+other+whitefly-borne+viruses:+dependence+on+the+vector+species.">Transmission of begomoviruses and other whitefly-borne viruses: dependence on the vector species.</a> Phytopathology. , (2019).</li><li>Cohen, S., Nitzany, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+and+host+range+of+the+tomato+yellow+leaf+curl+virus.">Transmission and host range of the tomato yellow leaf curl virus.</a> Phytopathology. 56, 1127-1131 (1966).</li><li>Moriones, E., Navas-Castillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus,+an+emerging+virus+complex+causing+epidemics+worldwide.">Tomato yellow leaf curl virus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide.</a> Virus Research. 71 (1-2), 123-134 (2000).</li><li>Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+mechanisms+and+components+that+determine+the+transmission+efficiency+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+(Geminiviridae;+Begomovirus)+by+its+whitefly+vector.">A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector.</a> Virus Research. 186, 47-54 (2014).</li><li>Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+-+a+whitefly-transmitted+geminivirus+with+a+single+genomic+component.">Tomato yellow leaf curl virus - a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component.</a> Virology. 185 (1), 151-161 (1991).</li><li>Sanchez-Campos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus:+No+evidence+for+replication+in+the+insect+vector+Bemisia+tabaci.">Tomato yellow leaf curl virus: No evidence for replication in the insect vector Bemisia tabaci.</a> Scientific Reports. 6, 30942 (2016).</li><li>Pakkianathan, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+its+whitefly+vector,+Bemisia+tabaci.">Replication of tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector, Bemisia tabaci.</a> Journal of Virology. 89 (19), 9791-9803 (2015).</li><li>Rodriguez-Negrete, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+the+quantification+of+virion-sense+and+complementary-sense+DNA+strands+of+circular+single-stranded+DNA+viruses.">A sensitive method for the quantification of virion-sense and complementary-sense DNA strands of circular single-stranded DNA viruses.</a> Scientific Reports. 4, 6438 (2014).</li><li>Gotz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+Bemisia+tabaci+heat+shock+protein+70+in+Begomovirus-whitefly+interactions.">Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13241-13252 (2012).</li><li>Zhao, J., Chi, Y., Zhang, X. J., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+whitefly+vesicle+associated+membrane+protein-associated+protein+B+in+the+transmission+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus.">Implication of whitefly vesicle associated membrane protein-associated protein B in the transmission of Tomato yellow leaf curl virus.</a> Virology. 535, 210-217 (2019).</li><li>Maluta, N. K., Garzo, E., Moreno, A., Lopes, J. R., Fereres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+yellow+leaf+curl+virus+benefits+population+growth+of+the+Q+biotype+of+Bemisia+tabaci+(Gennadius)+(Hemiptera:+Aleyrodidae).">Tomato yellow leaf curl virus benefits population growth of the Q biotype of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> Neotropical Entomology. 43 (4), 385-392 (2014).</li><li>Czosnek, H., Hariton-Shalev, A., Sobol, I., Gorovits, R., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incredible+journey+of+begomoviruses+in+their+whitefly+vector.">The incredible journey of begomoviruses in their whitefly vector.</a> Viruses. 9 (10), 273 (2017).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+development+and+vitellogenin+determine+the+transovarial+transmission+of+begomoviruses.">Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).</li><li>Ghanim, M., Morin, S., Zeidan, M., Czosnek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+transovarial+transmission+of+tomato+yellow+leaf+curl+virus+by+its+vector,+the+whitefly+Bemisia+tabaci.">Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector, the whitefly Bemisia tabaci.</a> Virology. 240 (2), 295-303 (1998).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+serological+methods+for+detecting+tomato+yellow+leaf+curl+virus+in+tomato+plants+and+whiteflies.">Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies.</a> Virology Journal. 10, 142 (2013).</li><li>Arya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+principles+of+real-time+quantitative+PCR.">Basic principles of real-time quantitative PCR.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (2), 209-219 (2005).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+cells+in+the+primary+salivary+glands+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+control+retention+and+transmission+of+begomoviruses.">Specific cells in the primary salivary glands of the whitefly Bemisia tabaci control retention and transmission of begomoviruses.</a> Journal of Virology. 88 (22), 13460-13468 (2014).</li><li>Wang, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagy+pathway+participates+in+resistance+to+tomato+yellow+leaf+curl+virus+infection+in+whiteflies.">The autophagy pathway participates in resistance to tomato yellow leaf curl virus infection in whiteflies.</a> Autophagy. 12 (9), 1560-1574 (2016).</li><li>Arocho, A., Chen, B. Y., Ladanyi, M., Pan, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+2(-Delta+Delta+Ct)+calculation+as+an+alternate+method+of+data+analysis+for+quantitative+PCR+of+BCR-ABL+P210+transcripts.">Validation of the 2(-Delta Delta Ct) calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts.</a> Diagnostic Molecular Pathology. 15 (1), 56-61 (2006).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+gene+selection+for+qRT-PCR+analysis+in+the+sweetpotato+whitefly,+Bemisia+tabaci+(Hemiptera:+Aleyrodidae).">Reference gene selection for qRT-PCR analysis in the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> PLoS One. 8 (1), 53006 (2013).</li></ol>

Burada immünororeskence ve qPCR ile whitefly vektördokularında bir begomovirüs lokalizasyonu ve nicelleştirme için bir protokol açıklar. Diseksiyon, whitefly dokularında virüsün lokalize ve ölçülmesiiçin ilk adımı temsil eder. Whitefly vücut dokuların son derece küçük olduğu anlamına gelir uzunluğu yaklaşık 1 mm, ve onları incelemek zordur. Ayrıca, dokular arasında güçlü bağlantılar vardır. Örneğin, yumurtalıklar sıkıca bakteriyofitler ile bağlı, onları izole etmek zor hale. Bu...

Son yıllarda, begomoviruses (cins Begomovirus, aile İkizler )birçok sebze üretimine ciddi zarar neden oldu, lif, ve süs bitkileri dünya çapında1. Begomoviruses whitefly Bemisia tabaci tarafından kalıcı bir şekilde iletilir (Hemiptera: Aleyrodidae), hangi üzerinde içeren karmaşık bir tür 35 şifreli türler2,3. Begomoviruses doğrudan veya dolaylı olarak whitefly fizyolojisi ve davranış etkileyebilir, fecundity4gibi , uzun ömür4, ve konaktercihi 5,6. Ayrıca, belirli bir begomovirüs türlerinin iletim verimliliği / zorlanma farklı whitefly şifreli türler için bile aynı deneysel koşullar altında değişir7,8,9,10, begomovirüsler ve beyaz sinekler arasında karmaşık bir etkileşim olduğunu gösteren. Whitefly-begomovirus etkileşimlerinin altında yatan mekanizmaları daha iyi anlamak için, whitefly dokularında virüsün lokalizasyonu ve nicelemesi esastır.
Domates sarı yaprak kıvırcık virüs (TYLCV) ilk İsrail'de bildirilen bir begomovirus ama günümüzde domates üretimi dünya çapında ciddi hasara neden olur11,12. Ekonomik önemi nedeniyle, en iyi çalışılan begomoviruses13biridir. Diğer monopartite begomoviruses gibi, TYLCV yaklaşık bir genom boyutu ile tek iplikli dairesel DNA virüsü14. Hala tartışma altında iken, kanıt çeşitli satırları whiteflies15,16,17TYLCV çoğaltılması destek . Ayrıca, TYLCV parçacıkları ve whitefly proteinlerin etkileşimi bildirilmiştir6,18,19,20. Virüs bulaşması için, beyaz sinekler virüs bulaşmış bitkilerle beslenerek TYLCV elde, virions yemek borusuna ulaşmak için besin kanalı boyunca geçmek, hemolenf ulaşmak için midgut duvar nüfuz, ve daha sonra birincil tükürük bezleri içine translocates (PSGs). Son olarak, virions bitki phloem içine tükürük kanalı boyunca tükürük ile egestedvardır 21. Ayrıca, çeşitli çalışmalar TYLCV transovarial dişi beyaz sinekler kendi yavrularına22,23iletilir mümkün olduğunu göstermektedir. Başka bir deyişle, verimli iletim elde etmek için, virüs bir dokudan diğerine translocate için whitefly içinde hücresel engelleri aşmak zorundadır. Bu engellerin aşılması sırasında, whitefly ve virüs proteinleri arasındaki etkileşimler muhtemelen virüslerin bulaşma verimliliğini belirleyen oluşabilir.
İmmünofloresans protein dağılım analizi nde yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Antikorların antijenlerine bağlanan özgüllüğü immünfloresansın temelini oluşturur. TYLCV'nin ekonomik önemi nedeniyle, TYLCV kat proteinine karşı monoklonal antikorlar geliştirilmiştir ve virüsün lokalize edilmesi için son derece hassas bir yol24geliştirilmiştir. Kantitatif PCR (qPCR) nükleik asitlerin hassas ve spesifik nicelemasını sağlar. Bu teknik en sık hidroliz probu (örneğin, TaqMan) veya floresan boya (örneğin, SYBR Green) tespiti kullanımına dayanır. Hidroliz prob tabanlı qPCR için, belirli problar gereklidir, bu da dolayısıyla maliyeti artırır. Floresan boya bazlı qPCR daha basit ve daha uygun maliyetlidir, çünkü etiketli amplicon spesifik hibridizasyon probları25. Şimdiye kadar, çeşitli çalışmalarda karmaşık begomovirus-whitefly etkileşimleri araştırmak için diğer yöntemlerle birlikte immünoresans ve qPCR kullandık. Örneğin, Pan ve ark. whitefly dokularda virüsün qPCR ve immünoforeskence analizi yapıldı ve beyaz sinek türleri AsiaII 1 ve Orta Doğu Asya Küçük 1 (MEAM1) arasında tütün kıvırcık ateş virüsü (TbCSV) iletmek için yeteneği farkı etkili AsiaII1 ama MEAM1 8 midgut duvar çapraz edememek için virüs nedeniyle bulundu8. Benzer şekilde, Akdeniz (MED) beyaz sinekler kolayca TYLCV iletebilirsiniz iken, onlar domates sarı yaprak kıvırmak Çin virüsü (TYLCCNV) iletmek için başarısız. Seçici iletim, TYLCCNV'nin MED whiteflies26'nınPSG'lerini kolayca geçmediğini gösteren PSG'lerde immünororesans virüsü nisbi tespiti kullanılarak araştırıldı. TYLCV CP ve whitefly midguts otofaji marker protein ATG8-II immünofloresan kolokalizasyonu otofin whitefly27TYLCV enfeksiyonu baskı kritik bir rol oynadığını göstermektedir.
Burada, örnek olarak TYLCV kullanarak, bir immünofloresan tekniği ile whitefly midguts, PSGs ve yumurtalıklarda begomovirüslerin lokalizasyonu için bir protokol açıklar. Bu teknik, primer ve boya etiketli ikincil antikorlarla diseksiyon, fiksasyon ve kuluçkayı içerir. Floresan sinyalleri daha sonra bir konfokal mikroskop altında tespit edilebilir whitefly dokularda viral proteinlerin yerini gösteren. Daha da önemlisi, bu protokol begomoviral ve whitefly proteinleri colocalize için kullanılabilir. Ayrıca, farklı whitefly doku örneklerinde virüs miktarını karşılaştırmak için kullanılabilecek whitefly midguts, PSGs, hemolenf ve yumurtalıklarda SYBR Yeşil tabanlı qPCR kullanılarak TYLCV'nin sayısallaştırılması için bir protokol tanımlayın.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>MultiSciences</td>
			<td>F0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole (DAPI)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>MultiSciences</td>
			<td>A3828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>185-5201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-goat anti-mouse</td>
			<td>Earthox</td>
			<td>E032310-02</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibody (MAb 1C4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B548119-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR820A</td>
			<td>qPCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A41182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissuelyzer</td>
			<td>Shaghai jingxin</td>
			<td>Tissuelyser-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>BBI life sciences</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization and quantification of begomoviruses in whitefly tissues by immunofluorescence and quantitative pcr

Begomoviruses (cins Begomovirus, aile İkizler )kalıcı, dolaşımcı bir şekilde Bemisia tabaci kompleksinin whiteflies tarafından iletilir. Begomovirüslerin dünya çapında üretime verdiği büyük hasar göz önüne alındığında, begomovirüsler ve onların whitefly vektörü arasındaki etkileşimi anlamak zorunludur. Bunu yapmak için, vektör dokularında virüsün lokalizasyonu ve nicelleştirilmesi çok önemlidir. Burada, örnek olarak domates sarı yaprak kıvırcık virüs (TYLCV) kullanarak, biz whitefly midguts begomoviruses lokalize etmek için ayrıntılı bir protokol tarif, primer tükürük bezleri, ve immünororesans ile yumurtalıklar. Yöntem, bir virüs kat protein, boya etiketli ikincil antikorlar ve konfokal mikroskop karşı spesifik antikorların kullanımına dayanmaktadır. Protokol aynı zamanda begomoviral ve whitefly proteinleri colocalize için kullanılabilir. Ayrıca whitefly midguts, primer tükürük bezleri, hemolenf ve yumurtalıklarda tylcv sayısallaştırılması için bir protokol açıklar kantitatif PCR (qPCR). TYLCV için özel olarak tasarlanmış astarlar kullanılarak, nicelleştirme protokolleri, whitefly'ın farklı dokularında TYLCV miktarının karşılaştırılmasına olanak sağlar. Açıklanan protokol, bir beyaz sinek ve virüs bulaşmış bir bitkinin vücudundaki begomovirüslerin sayısallaştırılması için potansiyel olarak yararlıdır. Bu protokoller whitefly begomoviruses dolaşım yolunu analiz etmek için veya whitefly-begomovirus etkileşimleri çalışma için diğer yöntemlerin bir tamamlayıcısı olarak kullanılabilir.

B. tabaci kompleksi ve TYLCV MEAM1 whiteflies burada prosedürleri tanımlamak için bir örnek olarak kullanılmıştır. Bu el yazmasında açıklanan immünoresans ve viral nicelleştirme prosedürlerine genel bakış Şekil 1'degösterilmiştir. Şekil 2, PSGs, midguts ve yumurtalıklarda TYLCV ve DAPI boyama immünofloresan tespiti temsili sonuçları gösterir, TYLCV PSGs ve midguts daha fazla birikmiş olduğunu gösteren, ve yumurtalıklarda dah...

Watch this Scientific Journal Video about Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR at JoVE.com

Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

Böcek dokularında begomovirüslerin lokalizasyonu ve nicelemesi için immünoresans ve nicel PCR yöntemini tanımladık. İmmünofloresan protokolü viral ve vektör proteinleri kolokalize etmek için kullanılabilir. Kantitatif PCR protokolü tüm whitefly organları ve virüs bulaşmış bitkilerde virüsleri ölçmek için uzatılabilir.

Whitefly Dokularında Begomovirüslerin İmmünfloresan ve Kantitatif PCR ile Lokalizasyonu ve Nicel Olarak Ölçülmesi

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. ...

Whitefly vektörlerinde virüsün mekansallığı ve miktarının açıklığa kavuşturulması begomovirüs-whitefly etkileşimlerinin anlaşılmasına ve ciddi begomoviral hastalıkların kontrol edilmesine yönelik yeni stratejilergeliştirilmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin avantajları, whitefly dokularını hızlı bir şekilde izole edebilsek, viral ve beyaz sinek proteinlerini birlikte yerelleştirebiliyor ve whitefly tüm vücutlarındaki ve virüsbulaşmış bitkilerdeki virüsleri ölçebiliyor olmamızdır. Uygun deneysel zaman noktasında, virüs edinimi nden sonra, buz anestezisi kadın beyaz sinekleri mikroskop slaytına bir damla PBS yerleştirin ve bir stereo mikroskop altında whitefly'ın karnını açmak için ince bir akupunktur iğnesi kullanın.Midgut ayıklamak ve PBS bir toplama çanak içine midgut yerleştirmek için iğne kullanın. PSGs toplamak için, baş ın yanındaki dorsal taraftan toraks ta vücudu bölün ve toraks aracılığıyla bir iğne ile whitefly düzeltmek. İki tükürük bezleri vücuttan ayrılır ve PBS yeni bir çanak bezleri transfer kadar whitefly sallamak için ikinci bir iğne kullanın.Yumurtalıkları toplamak için, tamamen karın açın ve diğer dokulardan yumurtalıkları ayırmak için bir iğne kullanın. Fazla dokuyu çıkarmak ve yumurtalıkları yeni bir PBS yemeğine aktarmak için bir pipet kullanın. Bir hemolenf örneği toplamak için, yeni bir mikroskop slayt üzerine PBS 10 mikrolitre ekleyin ve damlacık içine yeni bir whitefly yerleştirin.Yavaşça karın bir delik yapmak için ince bir akupunktur iğnekullanın. Sonra tampon içine hemolenf serbest bırakmak ve sıvı sekiz mikrolitre örnek toplamak için karın hafif basınç uygulayın. Hasat edilen whitefly PSG, midgut veya yumurtalık dokularında TYLCV lokalizasyonunu görselleştirmek için, 15 ila 20 numuneyi bir cam 3,5 santimetre Petri kabına aktarın ve fazla tamponu aspire edin.Yıkama başına bir mililitre taze TBS'de numuneleri üç kez iki dakika boyunca dikkatlice yıkamadan önce iki saat boyunca %4 paraformaldehit mililitresindeki dokuları düzeltin. Son yıkamadan sonra, sadece yıkama başına TBST bir mililitre ile gösterildiği gibi üç kez yıkamadan önce 30 dakika boyunca% 0.5 Triton X-100 bir mililitre ile permeabilize. Son yıkamadan sonra, oda sıcaklığında iki saat boyunca bir mililitre 1%sığır serum albumini ile nonspesifik bağlanmayı engelleyin ve gösterildiği gibi TBST'de üç yıkama işlemini takip edin.Son yıkamadan sonra, hücreleri bir gecede ışıktan korunan dört santigrat derece ilgibirincil antikorları ile etiket. Ertesi sabah, ışıktan korunan oda sıcaklığında uygun ikincil antikorları eklemeden önce numuneleri TBST ile üç kez yıkayın. Kuluçka sonunda, midgutları üç kez yıkayın ve numuneleri temiz bir mikroskop slaytına aktarın.Mümkün olduğunca çok tampon çıkarın ve bir coverslip ile montaj ve konfokal mikroskopi ile etiketli dokuları inceleyerek önce DAPI bir damla ile çekirdekleri leke. TYLCV sayısallaştırması için, hasat edilen whitefly doku örneklerini taze PBS'de 2-3 kez yıkayın ve 20 midgut, 20 PSG veya beş mikrolitre PBS'de bir yumurtalık, 25 mikrolitre likis çözeltisi içeren tek tek PCR tüplere aktarın. Her tüpe beş ila yedi iki milimetre çapında seramik boncuk ekleyin ve örnekleri bir homogenizer öğütün.Yeni bir PCR tüpüiçine sekiz mikrolitre likit bir hemolenf örneği ekleyin ve iyice karıştırarak tüpe 10 mikrolitre likyon ekleyin. Tüm numuneleri 65 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın, ardından 100 santigrat derecede 10 dakikalık bir kuluçka ve kısa bir santrifüj. Daha sonra, kantitatif PCR şerit tüplerin şişelerine 18 mikrolitre ana karışım ekleyin ve her DNA örneğinden en az üç şişeye iki mikrolitre ekleyin.Tüm numuneler yüklendiğinde, tüpleri kapatın ve her şişenin altındaki çözeltiyi tortulamak için santrifüjü kapatın. Şişeleri kantitatif PCR için gerçek zamanlı bir termal döngüye yükleyin, florofor boya olarak siber'i seçin ve örnek türü olarak bilinmez. Daha sonra her örnekteki göreceli viral DNA miktarının analizi için nicel verileri bir elektronik tabloya aktarın.Burada, whitefly PSGs, midguts ve yumurtalıklarda DAPI boyama TYLCV temsili görüntüler gösterilir. Görüldüğü gibi, TVLCV yumurtalıklarda daha PSGs ve midguts içinde daha büyük bir birikimi göstermektedir. 24, 48 ve 72 saat boyunca TYLCV enfekte domates ile beslendikten sonra whitefly PSGs, midguts, hemolenf ve yumurtalıklarda virüsün sayısallaştırılması, satın alma erişim dönemindeki artışa doğrudan korelasyon halinde farklı whitefly dokularında virüs miktarının arttığını göstermektedir.Ölü böcekler diseksiyon zorluk artacak gibi taze beyaz sinekler kullanmak en iyisidir. Bu prosedürü takiben, viral protein ekspresyonu ve viral ve vektör protein etkileşimleri ile ilgili ek soruları cevaplamak için batı lekeleme ve ko-immünoprepitasyon gibi diğer analizler de yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Normal MSS Real-time PCR ve Nöro sırasında mikroglia içinde microRNA tespiti

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Floresan<em&gt; In situ</emVirüsler ve Bitki ve Böcek Dokularda Endosimbiyotik Bakterilerin lokalizasyonu&gt; Hibritlemeler (FISH)

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

T-hücre reseptörleri Eksizyon Circles Eşzamanlı Niceleme (TREC) ve K-silme Rekombinasyon Eksizyon Circles (KRECs) Gerçek zamanlı PCR ile

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Solunum Sıvılarda equid Herpes-2 Teşhis için bir Nicel PCR Yöntemi Geliştirilmesi ve Validasyonu

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

bir Genotiplendirme<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Tarafından Ribozomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nano PCR ile Hayvan Örnekler Solunum Patojenler yüksek verimlilik Algılama

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Metabolik eşleme: Nicel enzim Cytochemistry ve Histochemistry Dehydrogenases hücre ve dokulara etkinliğini belirlemek için

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

T7 bakteriyofaj Biopanning üzerinden kantitatif PCR

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Bir Xenogeneic Murine modelinde Graft-versus-Host hastalığının indüksiyon ve skorlama ve dijital PCR kullanarak fare dokularında ınsan T hücrelerinin ölçümü

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...