Name: creating highly specific chemically induced protein dimerization systems by stepwise phage selection of a combinatorial single-domain antibody library
Uploaded: 2020-01-14T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library at JoVE

وقد تم دعم هذا العمل من قبل جائزه جامعه واشنطن للابتكار (إلى L.G.) ، وهي منحه من المعاهد الوطنية الامريكيه للصحة (1R35GM128918 إلى L.G.) ، وصندوق لبدء التشغيل من جامعه واشنطن (إلى L.G.). وقد تم دعم اتش جي) من قبل الزمالة الجامعية لمؤسسه واشنطن للأبحاث. وقد تم دعم K.W. من قبل زمالة جامعيه من معهد جامعه واشنطن لتصميم البروتين.

1-بناء المكتبات
<ol><li>استخدام مكتبه الأجسام المضادة أحاديه المجال التوافقية الاصطناعية مع تنوع من ~ 1.23 – 7-14 x 109، كما هو موضح سابقا19. علي الرغم من ان هذا البروتوكول لا يتضمن إنشاء المكتبة ، الا انه يمكن تطبيقه علي مكتبات موثقه أخرى للدمج.</li>
</ol>2-التعكر الحيوي لل...

<ol>
	<li>Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+proximity+in+biology+and+medicine.">Chemically induced proximity in biology and medicine.</a> Science. 359 (6380), (2018).</li><li>Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+therapeutic+T+cells+through+a+small+molecule-gated+chimeric+receptor.">Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor.</a> Science. 350 (6258), (2015).</li><li>Straathof, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+caspase+9+safety+switch+for+T-cell+therapy.">An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy.</a> Blood. 105 (11), 4247-4254 (2005).</li><li>Di Stasi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+apoptosis+as+a+safety+switch+for+adoptive+cell+therapy.">Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (18), 1673-1683 (2011).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophysical Journal. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li><li>Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circularly+permuted+green+fluorescent+proteins+engineered+to+sense+Ca2+.">Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).</li><li>Hunter, M. M., Margolies, M. N., Ju, A., Haber, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+monoclonal+antibodies+to+the+cardiac+glycoside,+digoxin.">High-affinity monoclonal antibodies to the cardiac glycoside, digoxin.</a> Journal of Immunology. 129 (3), 1165-1172 (1982).</li><li>Bradbury, A. R. M., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+natural+antibodies:+the+power+of+in+vitro+display+technologies.">Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies.</a> Nature Biotechnology. 29 (3), 245-254 (2011).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-affinity+ligand-binding+proteins+by+periplasmic+expression+with+cytometric+screening+(PECS).">Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS).</a> Nature. Biotechnology. 19 (6), 537-542 (2001).</li><li>Tinberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+design+of+ligand-binding+proteins+with+high+affinity+and+selectivity.">Computational design of ligand-binding proteins with high affinity and selectivity.</a> Nature. 501 (7466), 212-216 (2013).</li><li>Spencer, D. M., Wandless, T. J., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+signal+transduction+with+synthetic+ligands.">Controlling signal transduction with synthetic ligands.</a> Science. 262 (5136), 1019-1024 (1993).</li><li>Ho, S. N., Biggar, S. R., Spencer, D. M., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimeric+ligands+define+a+role+for+transcriptional+activation+domains+in+reinitiation.">Dimeric ligands define a role for transcriptional activation domains in reinitiation.</a> Nature. 382 (6594), 822-826 (1996).</li><li>Belshaw, P. J., Ho, S. N., Crabtree, G. R., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+protein+association+and+subcellular+localization+with+a+synthetic+ligand+that+induces+heterodimerization+of+proteins.">Controlling protein association and subcellular localization with a synthetic ligand that induces heterodimerization of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4604-4607 (1996).</li><li>Farrar, M. A., AlberolaIla, J., Perlmutter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-1+kinase+cascade+by+coumermycin-induced+dimerization.">Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.</a> Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).</li><li>Erhart, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Development+of+Intracellular+Protein+Heterodimerizers.">Chemical Development of Intracellular Protein Heterodimerizers.</a> Chemistry &amp; Biology. 20 (4), 549-557 (2013).</li><li>Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+light-induced+protein+dimerization+in+living+cells+using+a+photocaged+dimerizer.">Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer.</a> Nature Communications. 17 (5), 5475 (2014).</li><li>Hill, Z. B., Martinko, A. J., Nguyen, D. P., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antibody-based+chemically+induced+dimerizers+for+cell+therapeutic+applications.">Human antibody-based chemically induced dimerizers for cell therapeutic applications.</a> Nature Chemical Biology. 14 (2), 112-117 (2018).</li><li>Foight, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-input+chemical+control+of+protein+dimerization+for+programming+graded+cellular+responses.">Multi-input chemical control of protein dimerization for programming graded cellular responses.</a> Nature Biotechnology. 37 (10), 1209-1216 (2019).</li><li>Kang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COMBINES-CID:+An+efficient+method+for+de+novo+engineering+of+highly+specific+chemically+induced+protein+dimerization+systems.">COMBINES-CID: An efficient method for de novo engineering of highly specific chemically induced protein dimerization systems.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (28), 10948-10952 (2019).</li><li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies:+natural+single-domain+antibodies.">Nanobodies: natural single-domain antibodies.</a> Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).</li><li>Fanning, S. W., Horn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-hapten+camelid+antibody+reveals+a+cryptic+binding+site+with+significant+energetic+contributions+from+a+nonhypervariable+loop.">An anti-hapten camelid antibody reveals a cryptic binding site with significant energetic contributions from a nonhypervariable loop.</a> Protein Science. 20 (7), 1196-1207 (2011).</li><li>Zavrtanik, U., Luken, J., Loris, R., Lah, J., Hadzi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+epitope+recognition+by+heavy-chain+camelid+antibodies.">Structural basis of epitope recognition by heavy-chain camelid antibodies.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (21), 4369-4386 (2018).</li><li>Denhardt, D. T., Dressler, D., Ray, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Single-Stranded DNA Phages. , 605-625 (1978).</li><li>Virnekas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trinucleotide+phosphoramidites:+ideal+reagents+for+the+synthesis+of+mixed+oligonucleotides+for+random+mutagenesis.">Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis.</a> Nucleic Acids Research. 22 (25), 5600-5607 (1994).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+single-molecule+interaction+profiling+of+DNA-barcoded+proteins.">Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcoded proteins.</a> Nature. 515 (7528), 554-557 (2014).</li></ol>

ومن المهم لاختيار التركيزات الصحيحة من المكتبات بالعاثيه الإدخال لجولات مختلفه من القرصنة البيولوجية. بدانا عاده من مكتبه المدخلات من ~ 1012-1013 الجسيمات بالعاثيه مع التنوع > 109، والسماح ~ 100-1000 نسخه من كل استنساخ بالعاثيه ليتم تقديمها في السحب إلى أسفل المقايسة. إذا كان التر?...

نظم CID ، التي اثنين من البروتينات dimerize فقط في وجود الحرف جزيء صغير (الشكل 1) ، وتقدم أدوات متعددة لتشريح والتلاعب الأيض ، والإشارات ، وغيرها من المسارات البيولوجية1. وقد أظهرت القدرات في التشغيل البيولوجي, مثل المخدرات التي تسيطر عليها التنشيط الخلية t2 والمبرمج3,4, لتحسين سلامه وفعالية العلاج الخلوي t التبني. الاضافه إلى ذلك ، فانها توفر منهجيه جديده للكشف عن أهداف الجزيئات الصغيرة في الجسم المجري أو في المختبر. علي سبيل المثال ، يمكن ان تكون البروتينات CID تنصهر وراثيا مع نظم مراسل مضان (علي سبيل المثال ، نقل الطاقة بالرنين الفلوري (الحنق)5 والبروتينات الفلورية المشعة دائري)6 للوقت الحقيقي في القياسات المجرية ، أو بمثابه الكواشف التقارب لانزيم المناعي المرتبطة مقايسة (اليسا)-مثل
وعلي الرغم من تطبيقاتها الواسعة ، فان إنشاء أنظمه جديده للتحكم الجنائي يمكن التحكم فيها بواسطة الجزيئات الصغيرة المعطية والتي تواجه تحديات كبيره. إنشاء البروتين الموثق الأساليب الهندسية بما في ذلك التطعيم الحيواني7، في اختيار المختبر8،9، والحاسوبية تصميم البروتين10 يمكن ان تولد البروتينات الربط التي تعمل عن طريق ثنائي البروتين-يجند التفاعلات. ومع ذلك ، فان هذه الطرق لديها صعوبات في إنشاء مجمع CID الثلاثي المستحث. بعض الطرق إنشاء CID عن طريق ربط كيميائيا اثنين من يغاندس التي ترتبط بشكل مستقل إلى نفس أو مختلف البروتينات11,12,13,14,15,16 أو الاعتماد علي اختيار البروتينات الموثق مثل الأجسام المضادة التي تستهدف الموجودة مسبقا جزيء البروتين المجمعات17,18, التالي يكون خيارا محدودا من li
وقد قمنا مؤخرا بوضع الانتخاباتالخاصة بالإجراءات الجنائية الخاصة بأسلوب "الجمع بين المباحث الجنائية"من أجل الهندسة الهندسية لأنظمه المباحث الجنائية19. يمكن لهذه الطريقة الحصول علي خصوصية عاليه من الربط المستحث بالضغط (علي سبيل المثال ، ثابت الانفصال الموثق مرساه ، كد (بدون Ligand)/كد (مع ligand) > 1,000). يتم تحقيق الخصوصية باستخدام المجلدات مرساه مع مواقع ملزمه مرنه التي يمكن ان تدخل تغييرات المطابقة علي الربط ، وتوفير أساس لاختيار الموثقات انتقائية المطابقة فقط الاعتراف الموثقات مرساه الربط. لقد أظهرنا دليلا علي المبدا من خلال خلق الاختلافات الناجمة عن الكانبديه (CBD) من نانوبوديس ، وهو جزء من 12 إلى 15 من الأجسام المضادة الوظيفية من الكامريد التي تتالف من سقالة عالميه وثلاث حلقات مرنهلل CDR(الشكل 2)20، والتييمكن ان تشكل جيب ملزم مع احجام قابله للتكيف وعلي وجه الخصوص ، فان اختيار مكتبه البروتين التوافقي في المختبر ينبغي ان يكون فعالا من حيث التكلفة وقابلا للتعميم بالنسبة لهندسه CID لان نفس المكتبة ذات الجودة العالية يمكن تطبيقها علي العديد من الligands.
في هذا البروتوكول والفيديو ، ونحن نركز علي وصف الاختيار من خطوتين في المختبر والتحقق من مرساه (الشكل 3ا) والمجلدات ديميريشن (الشكل 3ب) عن طريق فحص مكتبه nanobody التوافقية مع تنوع اعلي من 109 باستخدام اتفاقيه التنوع البيولوجي كهدف ، ولكن ينبغي ان ينطبق البروتوكول علي مكتبات البروتين وعاده ما يستغرق فحص المجلدات الخاصة بالمباحث الجنائية ما بين 6 و 10 أسابيع (الشكل 4).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BirA biotin-protein ligase standard reaction kit</td>
			<td>Avidity</td>
			<td>BirA500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7078-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM13 Helper phage</td>
			<td>Antibody Design Labs</td>
			<td>PH020L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3238S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest BglI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 26/10 Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17508701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap-FF-1ml</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>11000458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13 Major Coat Protein Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-53004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>260251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet RED96</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADL-23c Phagemid Vector</td>
			<td>Antibody Design Labs</td>
			<td>PD0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-6000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81260-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum SuperFi DNA Polymerase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12351010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink PCR Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin M13 Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Medium</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>80026-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Plus 384</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Streptavidin (SSA) Biosensors</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18-5057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 increase 10/300 GL Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9909-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15224-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TG1 Electrocompetent Cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60502-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>471283-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP9726-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89882</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creating highly specific chemically induced protein dimerization systems by stepwise phage selection of a combinatorial single-domain antibody library

الاحداث البروتينية البروتين التي تحدث فقط في وجود الاربطه جزيء صغير وتمكين تطوير الجزيئات الصغيرة الحيوية لتشريح والتلاعب في المسارات البيولوجية. حاليا ، لا يوجد سوي عدد محدود من النظم المستحثة كيميائيا (CID) والهندسة الجديدة مع الحساسية المطلوبة والانتقائية ل يغاندس الجزيئات الصغيرة المحددة لا تزال تشكل تحديا في مجال هندسه البروتين. نقدم هنا وصفا لطريقه الفحص العالية الانتاجيه ، وهي انتخابات المباحث الجنائية التي تجريها شركه دي نوفو للهندسة من أجل الانظمه الجنائية المطبقة علي مجموعه كبيره ومتنوعة من الليغانز. يستخدم هذا الأسلوب الاختيار من خطوتين من مكتبه nanobody التوافقية المعروضة phage للحصول علي 1) "الموثقات مرساه" التي ربط أولا إلى يجند الفائدة ثم 2) "الموثقات ديميريشن" التي تربط فقط لمرساه الموثق-يجند المجمعات. لتحديد الموثقات مرساه ، يتم فحص مكتبه التوافقية من أكثر من 109 التكامل تحديد المنطقة (CDR)-العشوائية nanobodies مع liginylated ويتم التحقق من الإصابات مع الاربطه غير المسمية بواسطة قياس التداخل الطبقة الحيوية (BLI). للحصول علي المجلدات التعريفية ، يتم فحص مكتبه nanobody مع الموثق مرساه-ligand المجمعات كاهداف للفحص الإيجابي والموثقات مرساه غير منضم للفحص السلبي. الجمع بين-CID ينطبق علي نطاق واسع لتحديد المجلدات CID مع الغلوبولين المناعي الأخرى ، غير الغلوبولين المناعي ، أو السقالات مصممه حسابيا لخلق الاستشعار البيولوجي لفي المختبر والجسم الحيوي الكشف عن المخدرات ، والأيض ، والجزيئات الإشارات ، الخ.

ونحن نوضح الاختيار من خطوتين في المختبر والتحقق من الموثقات مرساه والتهجين من خلال فحص مكتبه nanobody التوافقية مع تنوع اعلي من 109 باستخدام اتفاقيه التنوع البيولوجي كهدف. ومن المهم تقييم إثراء القرصنة البيولوجية خلال الجولات المتعاقبة من الاختيار لكل من المرساة والمجلدات الثنائية. نتا...

Watch this Scientific Journal Video about Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library at JoVE

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

إنشاء أنظمه البروتين المستحث كيميائيا مع التقارب والخصوصية المطلوبة لأي من الجزيئات الصغيرة المعطية والتي تحتوي علي العديد من تطبيقات الاستشعار البيولوجي والتفعيل. هنا ، نقوم بوصف طريقه فعاله وقابله للتعميم للهندسة الهندسية للانظمه المستحثة كيميائيا عن طريق الاختيار المتدرج لمكتبه الأجسام المضادة أحاديه المجال التوافقية المعروضة.

إنشاء أنظمه تحديد البروتين المستحثة كيميائيا للغاية بواسطة الاختيار المتدرج لمكتبه الأجسام المضادة أحاديه المجال التوافقية

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

هذا البروتوكول مهم لأنه يوفر نهجا عاما لهندسة أنظمة اتماح البروتين كمواد بيولوجية لمجموعة متنوعة من الجزيئات الصغيرة. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يستخدم مكتبة بروتينية شديدة التنوع لاختيار أجهزة الاستشعار البيولوجية للليغانات المختلفة بطريقة فعالة وفعالة من حيث التكلفة دون الحاجة إلى معدات متخصصة. ويمكن استخدام جهاز الاستشعار الحيوي المهندس للتحكم كيميائياً في سلوك الخلايا ومراقبة التغيرات في الوقت الحقيقي في مستقلبات الخلية.من خلال هذا العرض المرئي ، يمكن للباحثين مراقبة تعليم مفصل للتقنيات مع توقع واضح للإنتاج التجريبي. تبدأ كل جولة من الاختيار عن طريق زراعة واحدة TG1 الملهية الكهربائية مستعمرة الخلية في ستة ملليلتر من 2YT المتوسطة في 37 درجة مئوية و 250 الثورات في الدقيقة الواحدة لامتصاص 600 نانومتر من حوالي 0.5. عندما تم الوصول إلى الكثافة البصرية المثلى، ضع الخلايا على الجليد.لإعداد الخرز اختيار السلبية، وغسل 300 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي المغلفة streptavidin ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من 05٪ PBS بالإضافة إلى العازلة توين ومرتين مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل غسل على رف الفصل المغناطيسي. Resuspend الخرز مع ملليلتر واحد من 1 ٪ الكانين في برنامج تلفزيوني ، وتشبع الخرز مع البيوتين في خمسة أضعاف القدرة الملزمة المبلغ عنها من الخرز. بعد ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع التناوب، وغسل الخرز خمس مرات مع برنامج تلفزيوني زائد توين وثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح.بعد الغسيل الأخير، إضافة ما يقرب من واحد مرات 10 إلى جسيمات phage 13 في 1٪ الكانين و 1٪ البوم الدم البقري في PBS إلى الخرز لاحتضان ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع التناوب. في نهاية الحضانة ، قم بنقل المابير إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. لاختيار إيجابي مع الخرز streptavidin ملزمة biotinylated، تشبع نصف حجم الخرز المستخدمة للاختيار السلبي في يغاند biotinylated من الاختيار في خمسة أضعاف القدرة الكاملة ملزمة حسبت وفقا للدليل.بعد حضانة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع التناوب، وغسل الخرز خمس مرات مع برنامج تلفزيوني زائد توين وثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وحده كما هو موضح، ومنع الخرز مع ملليلتر واحد من 1٪casein و 1٪ البوم الأبقار للبوم لمدة ساعة واحدة مع التناوب. في نهاية الحضانة ، وغسل الخرز المغناطيسي المغلفة streptavidin ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني زائد توين ومرات واحدة في برنامج تلفزيوني وحدها كما هو موضح ، واستخدام phage غير منضمة ل resuspend الخرز المغناطيسي المغلفة streptavidin. استخراج غير منضم phage التي تحتوي على supernatant دون إزعاج الخرز، ووضع العينة جانبا لاستخدامها كمدخلات.ثم غسل الخرز 10 مرات مع برنامج تلفزيوني زائد توين وخمس مرات مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح، ونقل الخرز إلى أنبوب جديد بعد كل ثلاثة يغسل لتجنب الربط غير محدد من phages ملزمة إلى الجدران أنبوب. لتنافسية elute الففاج ملزمة، إضافة 450 ميكرولترات من تركيز micromolar من الليغانة غير الحيوية إلى الخرز اختيار إيجابية، ووضع الخرز على التناوب لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة ، نقل اابر إلى أنبوب جديد لاستخدامها في الانتاج.للحصول على المعايرة المدخلات، وإعداد 10 المخففات التسلسلي في برنامج تلفزيوني تصل إلى واحد مرات 10 إلى تسعة أضعاف مع phage الإدخال. نقل 10 ميكرولترات من phage المدخلات من مرة واحدة 10 إلى 7 إلى 10 إلى التخفيفات التسعة إلى 70 ميكرولتر aliquots من الخلايا TG1 المعدة. بعد 45 دقيقة في 37 درجة مئوية، لوحة الخلايا TG1 المصابة على الفردية 90 ملليمتر 2YT أطباق أجار تحتوي على 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأمبيسيلين و 2٪ الجلوكوز لاحتضان ليلة وضحاها في 37 درجة مئوية.في صباح اليوم التالي، استخدم الصيغة لحساب مدخلات phage. بالنسبة للعدوى الناتجة وال المعايرة ، أضف phages المائلة إلى ثلاثة ملليلتر من خلايا TG1 لاحتضان لمدة 45 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية. ثم إعداد 10 تخفيفات المسلسل من الخلايا المصابة في المتوسطة 2YT الطازجة تصل إلى مرة واحدة 10 إلى التركيز الثالث، ولوحة كل تخفيف على 90 ملليمتر 2YT أجار أطباق لاحتضانهم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.في صباح اليوم التالي، حساب الناتج phage وفقا للصيغة. لعزل المستنسخين الفرديين من مكتبة فرعية غنية ، نقل مستعمرات واحدة من لوحات الخلايا TG1 المُثقفة بين عشية وضحاها والمصابة بالفاغة إلى 250 ميكروليتر من 2YT المتوسطة المكملة بالآمبيسيلين في البئر في لوحات عميقة آبار عقيمة لثقافتها بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. عندما تصل الخلايا إلى كثافة 600 نانومتر حوالي 0.5، إضافة خمس مرات 10 إلى وحدات تشكيل البلاك تسعة لكل ملليلتر من phage مساعد CM13 إلى كل بئر، واحتضان الخلايا لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية في تناوب 250 في الدقيقة.في نهاية الحضانة، إضافة 500 ميكرولتر من 2YT المتوسطة تكملها الأمبيسيلين و 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من الكاناميسين إلى كل بئر، ووضع لوحة في 25 درجة مئوية و 250 التناوب في الدقيقة الواحدة. في صباح اليوم التالي، تترسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي للسماح بجمع جزيئات الفسيج. للتحقق من ربط المرساة من قبل ELISA، معطف 96-جيدا لوحات ELISA مع 100 ميكرولترات من خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر streptavidin في عازلة طلاء في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.في صباح اليوم التالي، غسل لوحات ثلاث مرات في 300 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني زائد توين قبل إضافة 100 ميكرولترات من هدف حيوي ثنائية متناهية الصغر واحد إلى الآبار المستهدفة و 100 ميكرولترات من البيوتين ميكرومولار واحد أو homolog الهدف إلى آبار التحكم المناسبة. بعد ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، وغسل لوحات خمس مرات مع برنامج تلفزيوني زائد توين في غسل، ومنع أي ربط غير محدد مع 300 ميكرولترات من 1٪ الكانين في بئر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وغسل لوحات ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني جديد بالإضافة إلى توين في غسل، وإضافة phage فائقة المنقى.بعد ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، وغسل لوحات 10 مرات مع برنامج تلفزيوني جديد بالإضافة إلى توين في غسل. إضافة 100 ميكرولترات من الفجل peroxidase M13 معطف الرئيسية المضادة للبروتين إلى كل بئر لاحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم غسل لوحات ثلاث مرات كما هو موضح، وإضافة 100 ميكرولترات من الركيزة TMB إلى كل بئر لاحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو حتى يتم ملاحظة تغير اللون مرئية.ثم وقف التفاعل مع 100 ميكرولترات من حمض الهيدروكلوريك واحد المولر في البئر ، وقراءة لوحة في 450 نانومتر على مقياس الطيفي. بعد التحقق من الموثق المرساة، وينبغي أيضا إجراء فحص الموثق dimerization باستخدام نفس مكتبة البروتين التي تستهدف مجمع الموثق مرساة ligand. وتعتبر نتائج الإثراء النموذجية بعد أربع إلى ست جولات من الاختيار مؤشراً جيداً على أن هناك نسبة عالية من الزيارات المحتملة في بقية التصفيات الفرعية، وفي هذه الحالة قد لا تكون هناك حاجة إلى جولات أخرى من الاختيار.تعد ELISA المستنسخة المفردة مناسبة لتحليل تقارب الربط النسبي والانتقائية في مرساة و binds dimerization ويسهل مقارنة الانتقائية الملزمة بين المستنسخين. وبالمثل، تحديد الموثق الديمر يسمح بتحديد المستنسخين التي تشكل heterodimer مع الموثق الارتساء غير المُشلول فقط مع أو بدون رابطة. وتشير هذه البيانات الملزمة المعتمدة على تركيز الليجندة إلى أن الأجسام النانوية المختبرة مناسبة لبناء نظام ادمح مستحث كيميائيا مقارنة بالربط الضعيف الذي أظهرته عينات التحكم.وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الكروماتوغرافيا التحليلية التي تُستبعد من الحجم لتأكيد تكوين الهتيروديمر بين مرساة و bindsization في وجود الرباط. على سبيل المثال، في هذه التجربة، لوحظت ذروة التمثال عندما كانت مرساة وتكميم المجلدات و القنب مختلطة. في المقابل، لم يتم الكشف عن ذروة التمرم في غياب القنب أو عندما تم تحميل كل الموثق إلى العمود وحده.وينبغي أن يكون نظام التمرم البروتيني مشفراً وراثياً في خلايا الخميرة أو الثدييات للسماح بمزيد من التحقق من أجهزة الاستشعار البيولوجية المختارة لتطويرها في تطبيقات الجسم الحي. ونحن نتوقع أن هذه الطريقة سوف تعطي الباحثين الآخرين الأدوات الفعالة والضرورية للكشف عن المستقلبات الهامة, الجزيئات إشارة, أو الأدوية في الجسم الحي مع دقة اشقاء عالية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

العرض الداخلية غشاء البكتيريا لفحص مكتبة من الأجسام المضادة شظايا

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

كفاءة والخاصة بالموقع الأجسام المضادة وصفها من قبل Cycloaddition-أزيد آلكاين-روجت سلالة

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

قياس البروتين ملزمة ل F- أكتين بواسطة الترسيب المشترك

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

البروتين فيلم الأشعة تحت الحمراء كهربية أبداه Hydrogenase [NiFe] للدراسة لأكسدة2 ح

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

كشف حساسة للغاية وكمية من البروتينات وعلى إيسوفورمس بطريقة تركز Isoelectric الشعرية

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

التقاط حركية التفاعل البروتين قناة أيون مع جزيئات صغيرة بمقايسة التداخلي بيو-طبقة

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

تحصين الألبكة (باكوس لاما) مع المستضدات البروتين وإنتاج محددة مستضد "واحد المجال الأجسام المضادة"

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...