Name: creating highly specific chemically induced protein dimerization systems by stepwise phage selection of a combinatorial single-domain antibody library
Uploaded: 2020-01-14T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library at JoVE

Dette arbejde blev støttet af University of Washington Innovation Award (til L.G.), et tilskud fra de amerikanske National Institutes of Health (1R35GM128918 til L.G.), og en Startup fond af University of Washington (til L.G.). H.J. blev støttet af en Washington Research Foundation bachelor Fellowship. K.W. blev støttet af et bachelor stipendium fra University of Washington Institute for protein design.

1. biblioteksbygning
<ol><li>Brug et syntetisk kombinatorisk enkelt domæne antistof bibliotek med en mangfoldighed på ~ 1.23 – 7.14 x 109, som tidligere beskrevet19. Mens denne protokol ikke omfatter Biblioteks konstruktion, kan den anvendes på andre kombinatoriske binder biblioteker.</li>
</ol>2. biotinylering af ligand-mål eller ligand
<ol><li>Biotinylat den valgte ligand, for eksempel, CBD og tetrahydrocannabinol (THC)19, via ...

<ol>
	<li>Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+proximity+in+biology+and+medicine.">Chemically induced proximity in biology and medicine.</a> Science. 359 (6380), (2018).</li><li>Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+therapeutic+T+cells+through+a+small+molecule-gated+chimeric+receptor.">Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor.</a> Science. 350 (6258), (2015).</li><li>Straathof, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+caspase+9+safety+switch+for+T-cell+therapy.">An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy.</a> Blood. 105 (11), 4247-4254 (2005).</li><li>Di Stasi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+apoptosis+as+a+safety+switch+for+adoptive+cell+therapy.">Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (18), 1673-1683 (2011).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophysical Journal. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li><li>Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circularly+permuted+green+fluorescent+proteins+engineered+to+sense+Ca2+.">Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).</li><li>Hunter, M. M., Margolies, M. N., Ju, A., Haber, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+monoclonal+antibodies+to+the+cardiac+glycoside,+digoxin.">High-affinity monoclonal antibodies to the cardiac glycoside, digoxin.</a> Journal of Immunology. 129 (3), 1165-1172 (1982).</li><li>Bradbury, A. R. M., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+natural+antibodies:+the+power+of+in+vitro+display+technologies.">Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies.</a> Nature Biotechnology. 29 (3), 245-254 (2011).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-affinity+ligand-binding+proteins+by+periplasmic+expression+with+cytometric+screening+(PECS).">Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS).</a> Nature. Biotechnology. 19 (6), 537-542 (2001).</li><li>Tinberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+design+of+ligand-binding+proteins+with+high+affinity+and+selectivity.">Computational design of ligand-binding proteins with high affinity and selectivity.</a> Nature. 501 (7466), 212-216 (2013).</li><li>Spencer, D. M., Wandless, T. J., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+signal+transduction+with+synthetic+ligands.">Controlling signal transduction with synthetic ligands.</a> Science. 262 (5136), 1019-1024 (1993).</li><li>Ho, S. N., Biggar, S. R., Spencer, D. M., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimeric+ligands+define+a+role+for+transcriptional+activation+domains+in+reinitiation.">Dimeric ligands define a role for transcriptional activation domains in reinitiation.</a> Nature. 382 (6594), 822-826 (1996).</li><li>Belshaw, P. J., Ho, S. N., Crabtree, G. R., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+protein+association+and+subcellular+localization+with+a+synthetic+ligand+that+induces+heterodimerization+of+proteins.">Controlling protein association and subcellular localization with a synthetic ligand that induces heterodimerization of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4604-4607 (1996).</li><li>Farrar, M. A., AlberolaIla, J., Perlmutter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-1+kinase+cascade+by+coumermycin-induced+dimerization.">Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.</a> Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).</li><li>Erhart, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Development+of+Intracellular+Protein+Heterodimerizers.">Chemical Development of Intracellular Protein Heterodimerizers.</a> Chemistry &amp; Biology. 20 (4), 549-557 (2013).</li><li>Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+light-induced+protein+dimerization+in+living+cells+using+a+photocaged+dimerizer.">Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer.</a> Nature Communications. 17 (5), 5475 (2014).</li><li>Hill, Z. B., Martinko, A. J., Nguyen, D. P., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antibody-based+chemically+induced+dimerizers+for+cell+therapeutic+applications.">Human antibody-based chemically induced dimerizers for cell therapeutic applications.</a> Nature Chemical Biology. 14 (2), 112-117 (2018).</li><li>Foight, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-input+chemical+control+of+protein+dimerization+for+programming+graded+cellular+responses.">Multi-input chemical control of protein dimerization for programming graded cellular responses.</a> Nature Biotechnology. 37 (10), 1209-1216 (2019).</li><li>Kang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COMBINES-CID:+An+efficient+method+for+de+novo+engineering+of+highly+specific+chemically+induced+protein+dimerization+systems.">COMBINES-CID: An efficient method for de novo engineering of highly specific chemically induced protein dimerization systems.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (28), 10948-10952 (2019).</li><li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies:+natural+single-domain+antibodies.">Nanobodies: natural single-domain antibodies.</a> Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).</li><li>Fanning, S. W., Horn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-hapten+camelid+antibody+reveals+a+cryptic+binding+site+with+significant+energetic+contributions+from+a+nonhypervariable+loop.">An anti-hapten camelid antibody reveals a cryptic binding site with significant energetic contributions from a nonhypervariable loop.</a> Protein Science. 20 (7), 1196-1207 (2011).</li><li>Zavrtanik, U., Luken, J., Loris, R., Lah, J., Hadzi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+epitope+recognition+by+heavy-chain+camelid+antibodies.">Structural basis of epitope recognition by heavy-chain camelid antibodies.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (21), 4369-4386 (2018).</li><li>Denhardt, D. T., Dressler, D., Ray, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Single-Stranded DNA Phages. , 605-625 (1978).</li><li>Virnekas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trinucleotide+phosphoramidites:+ideal+reagents+for+the+synthesis+of+mixed+oligonucleotides+for+random+mutagenesis.">Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis.</a> Nucleic Acids Research. 22 (25), 5600-5607 (1994).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+single-molecule+interaction+profiling+of+DNA-barcoded+proteins.">Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcoded proteins.</a> Nature. 515 (7528), 554-557 (2014).</li></ol>

Det er afgørende at vælge de korrekte koncentrationer af input fagtypning biblioteker til forskellige runder af biopanning. Vi startede typisk fra et input bibliotek af ~ 1012-1013 fagtypning partikler med en mangfoldighed > 109, så ~ 100-1000 eksemplarer af hver fagtypning klon, der skal præsenteres i pull-down assay. Hvis fagtypning koncentrationen i en bindende analyse er for høj eller lav, vil sandsynligheden for ikke-specifik binding eller tab af positive kloner stige. Det anker...

CID systemer, hvor to proteiner kun dimerisere i nærværelse af et lille molekyle ligand (figur 1), tilbyder alsidige værktøjer til dissekere og manipulere metaboliske, signalering, og andre biologiske veje1. De har demonstreret potentialet i biologisk aktivering, såsom Drug-kontrollerede t-celle Activation2 og apoptose3,4, for at forbedre sikkerheden og effekten af adoptivt celleterapi. Derudover, de giver en ny metode til in vivo eller in vitro påvisning af små-molekyle mål. For eksempel kan CID proteiner være genetisk smeltet sammen med fluorescens reporter-systemer (f. eks. fluorescens resonans energioverførsel (FRET)5 og cirkulært permuterede fluorescerende proteiner)6 for Real-Time in vivo målinger eller fungere som affinitets reagenser til sandwich enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA)-lignende assays.
På trods af deres brede applikationer, skabe nye CID-systemer, der kan styres af en given lille molekyle ligand har store udfordringer. Etablerede protein binder teknik metoder, herunder dyre immunisering7, in vitro udvælgelse8,9, og Computational protein design10 kan generere ligand bindende proteiner, der fungerer via binære protein-ligand interaktioner. Men, disse metoder har svært ved at skabe en ligand-induceret ternære CID kompleks. Nogle metoder skabe CID ved kemisk forbinder to ligander, der selvstændigt binder sig til de samme eller forskellige proteiner11,12,13,14,15,16 eller stole på at vælge bindemiddel proteiner såsom antistoffer rettet mod præ eksisterende lille molekyle-protein komplekser17,18, og dermed har et begrænset valg af ligander.
Vi har for nylig udviklet en combinatoriske binders-eNABLED svalg af CID (kombinerer-CID) metode til de Novo engineering af CID Systems19. Denne metode kan opnå den høje specificitet af ligand-induceret denne (f. eks. en anker-denne bindemiddel dissociation konstant, Kd (uden ligand)/Kd (med ligand) > 1.000). Den denne specificitet opnås ved hjælp af anker bindemidler med fleksible bindingssteder, der kan indføre konformationelle ændringer på ligand binding, hvilket giver et grundlag for udvælgelsen af konformationelt selektive bindemidler kun anerkender ligand-bundne anker bindemidler. Vi demonstrerede et proof-of-princip ved at skabe cannabidiol (CBD)-inducerede Heterodimere af nanokroppe, et 12 – 15 kDa funktionelt antistof fragment fra brug bestående af et universelt stillads og tre fleksible CdR loops (figur 2)20, som kan danne en bindende lomme med tilpasningsdygtige størrelser til små molekyle epitoper21,22 Især bør in vitro-udvælgelsen af et kombinatorisk protein bibliotek være omkostningseffektiv og generaliserbar for CID-teknik, fordi det samme højkvalitets bibliotek kan anvendes til forskellige ligands.
I denne protokol og video fokuserer vi på at beskrive to-trins in vitro udvælgelse og validering af anker (figur 3A) og denne bindere (figur 3B) ved at screene det kombinatoriske nanobody bibliotek med en mangfoldighed højere end 109 ved hjælp af CBD som et mål, men protokollen bør gælde for andre protein biblioteker eller små-molekyle mål. Screeningen af CID bindere tager normalt 6 – 10 uger (figur 4).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BirA biotin-protein ligase standard reaction kit</td>
			<td>Avidity</td>
			<td>BirA500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7078-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM13 Helper phage</td>
			<td>Antibody Design Labs</td>
			<td>PH020L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3238S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest BglI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 26/10 Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17508701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap-FF-1ml</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>11000458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13 Major Coat Protein Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-53004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>260251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet RED96</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADL-23c Phagemid Vector</td>
			<td>Antibody Design Labs</td>
			<td>PD0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-6000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81260-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum SuperFi DNA Polymerase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12351010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink PCR Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin M13 Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Medium</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>80026-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Plus 384</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Streptavidin (SSA) Biosensors</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18-5057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 increase 10/300 GL Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9909-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15224-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TG1 Electrocompetent Cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60502-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>471283-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP9726-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89882</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creating highly specific chemically induced protein dimerization systems by stepwise phage selection of a combinatorial single-domain antibody library

Protein denne begivenheder, der kun forekommer i nærværelse af en lille molekyle ligand muliggøre udviklingen af små-molekyle biosensorer til dissektion og manipulation af biologiske veje. I øjeblikket er kun et begrænset antal kemisk induceret denne (CID) systemer findes og ingeniør nye med den ønskede følsomhed og selektivitet for specifikke små-molekyle ligander fortsat en udfordring inden for protein teknik. Vi her beskrive en høj gennemstrømning screeningmetode, combinatoriske binders-enabled svalg af CID (kombinerer-CID), for de Novo engineering af CID-systemer, der gælder for et stort udvalg af ligands. Denne metode bruger to-trins udvælgelse af en Phage-viste kombinatoriske nanobody bibliotek for at opnå 1) "anker bindemidler", der først binder sig til en ligand af interesse og derefter 2) "dimerization bindere", der kun binder sig til anker bindemiddel-ligand komplekser. For at vælge anker bindere screenes et kombinatorisk bibliotek med mere end 109 komplementære NANOKROPPE (CdR)-randomiserede nanopartikler med et biotinyleret ligand, og hits valideres med den ikke-mærkede ligand med bio-Layer INTERFEROMETRI (bli). For at opnå denne bindere, er nanobody Library screenet med anker binder-ligand komplekser som mål for positiv screening og ubundne anker bindere for negativ screening. KOMBINERER-CID er bredt anvendelig til udvalgte CID bindere med andre immunglobulin, ikke-immunglobulin, eller beregningsmæssigt designede stilladser til at skabe biosensorer til in vitro og in vivo påvisning af narkotika, metabolitter, signalering molekyler, etc.

Vi beskriver to-trins in vitro udvælgelse og validering af anker og denne bindere ved at screene det kombinatoriske nanobody bibliotek med en mangfoldighed højere end 109 ved hjælp af CBD som et mål. Vurdering af tilsætning af fagtypning biopanning under de efterfølgende runder af udvælgelse for både anker og denne bindemidler er vigtig. Typiske berigelse resultater efter 4 – 6 runder af udvælgelse som vist i figur 5 er en god indikation af, at der er en høj grad af po...

Watch this Scientific Journal Video about Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library at JoVE

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Oprettelse af kemisk induceret protein denne systemer med ønsket affinitet og specificitet for en given lille molekyle ligand ville have mange biologiske sensing og aktuering applikationer. Her beskriver vi en effektiv, generaliserbar metode til de Novo engineering af kemisk inducerede denne systemer via det trinvise valg af et Phage-vist kombinatorisk enkelt domæne antistof bibliotek.

Oprettelse af meget specifikke kemisk induceret protein Dimerization systemer ved trinvis Phage udvælgelse af en kombinatorisk enkelt domæne antistof bibliotek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Denne protokol er betydelig, fordi det giver en generel tilgang til teknisk protein dimerization systemer som biosensorer for en række små molekyler. Derudover bruger det et meget forskelligartet proteinbibliotek til at vælge biosensorer til forskellige ligaander på en effektiv og omkostningseffektiv måde uden behov for specialiseret udstyr. Den manipulerede biosensor kan bruges til kemisk kontrol celle adfærd og til at overvåge real-time ændringer i celle metabolitter.Gennem denne visuelle demonstration kan forskerne observere en detaljeret instruktion af teknikkerne med en klar forventning om det eksperimentelle output. Begynd hver runde af udvælgelse ved at dyrke en enkelt TG1 elektroporation-kompetent cellekoloni i seks milliliter 2YT-medium ved 37 grader Celsius og 250 omdrejninger i minuttet til en 600-nanometer absorbans på ca. 0,5. Når den optimale optiske tæthed er nået, skal cellerne på is.For at forberede de negative markeringsperler vaskes 300 mikroliter af streptavidin-belagte magnetiske perler tre gange med en milliliter 05% PBS plus Tween buffer og to gange med en milliliter PBS pr. vask på en magnetisk separationsstativ. Opsalt perlerne med en milliliter 1% casein i PBS, og mætte perlerne med biotin på fem gange den rapporterede bindende kapacitet af perlerne. Efter en time ved stuetemperatur med rotation vaskes perlerne fem gange med PBS plus Tween og tre gange med PBS som påvist.Efter den sidste vask tilsættes ca. en gange 10 til de 13 fagpartikler i 1%-indædning og 1%kvægserumalbumin i PBS til perlerne for en times inkubation ved stuetemperatur med rotation. Ved slutningen af inkubationen overføres supernatanten til et 1,5 milliliterrør. For positiv udvælgelse med de biotinylerede ligand-bundne streptavidin perler, mætte halvdelen af mængden af perler, der anvendes til den negative markering i den biotinylerede ligand valg på fem gange den fulde bindende kapacitet som beregnet i henhold til manualen.Efter en times inkubation ved stuetemperatur med rotation vaskes perlerne fem gange med PBS plus Tween og tre gange med PBS alene som påvist, og perlerne med en milliliter 1% casein og 1% kvæg serumalbumin i en time med rotation. Ved inkubationens afslutning vaskes de streptavidin-belagte magnetiske perler tre gange i PBS plus Tween og én gang i PBS alene som påvist, og brug ubundet til at opslæme de streptavidin-belagte magnetiske perler. Ekstrakt den ubundne fagholdige supernatant uden at forstyrre perlerne, og sæt prøven til side, så den anvendes som input.Derefter vaskes perlerne 10 gange med PBS plus Tween og fem gange med PBS som påvist, og perlerne overføres til et nyt rør efter hver tredje vask for at undgå uspecifikke bindinger af de bundne fager til rørvæggene. For konkurrencemæssigt elutere de bundne fager, tilsættes 450 mikroliter af en mikromolarkoncentration af ikke-biotinyleret ligand til de positive udvælgelsesperler, og læg perlerne på rotation i 30 minutter. Ved slutningen af inkubationen overføres supernatanten til et nyt rør, der skal anvendes som output.For input titrering, forberede 10 serielle fortyndinger i PBS op til en gange 10 til den nidoblet med input. Overfør 10 mikroliter input-fag fra den ene gange 10 til de syv til 10 til de ni fortyndinger til 70-mikroliter aliquots af de forberedte TG1 celler. Efter 45 minutter ved 37 grader Celsius, plade de inficerede TG1 celler på individuelle 90-millimeter 2YT agar retter, der indeholder 100 mikrogram pr milliliter ampicillin og 2%glucose for en overnatning inkubation ved 37 grader Celsius.Næste morgen skal du bruge formlen til at beregne fagindgangen. For output infektion og titrering, tilsæt eluterede fager til tre milliliter TG1 celler til en 45-minutters inkubation i en 37-graders Celsius vandbad. Derefter forberede 10 serielle fortyndinger af de inficerede celler i frisk 2YT medium op til en gange 10 til den tredje koncentration, og plade hver fortynding på 90-millimeter 2YT agar retter til deres natten inkubation ved 37 grader Celsius.Næste morgen beregnes fagudgangen i henhold til formlen. At isolere individuelle kloner fra en beriget sublibrary, overføre enkelte kolonier fra natten-dyrkede, fag-inficerede TG1 celleplader i 250 mikroliter af 2YT medium suppleret med ampicillin per godt i sterile dyb-godt plader for deres natten kultur på 37 grader Celsius. Når cellerne når en 600-nanometertæthed på ca. 0,5, tilsættes fem gange 10 til de ni plaquedannende enheder pr. milliliter CM13-hjælper-fag til hver brønd og inkubere cellerne i 45 minutter ved 37 grader Celsius ved 250 rotationer i minuttet.Ved slutningen af inkubationen tilsættes 500 mikroliter 2YT-medium suppleret med ampicillin og 50 mikrogram pr. milliliter kanamycin til hver brønd, og pladen skal sættes ved 25 grader Celsius og 250 rotationer i minuttet natten over. Næste morgen sediment cellerne ved centrifugering at tillade indsamling af fagpartikler. For at validere ankerbindingen af ELISA, pels 96-brønd ELISA plader med 100 mikroliter på fem mikrogram pr. milliliter streptavidin i belægning buffer ved fire grader Celsius natten over.Næste morgen vaskes pladerne tre gange i 300 mikroliter PBS plus Tween, før der tilsættes 100 mikroliter af etmikromolarbiotinyleret mål til målblydene og 100 mikroliter af enmikromolarbiotin eller målhomolog til de relevante kontrolblyde. Efter en time ved stuetemperatur vaskes pladerne fem gange med PBS plus Tween pr. vask, og enhver ufølsom binding med 300 mikroliter på 1% casein pr. brønd i en time ved stuetemperatur blokeres. Ved slutningen af inkubationen vaskes pladerne tre gange i frisk PBS plus Tween pr vask, og tilsæt den rensede fagsupernatant.Efter en time ved stuetemperatur vaskes pladerne 10 gange med frisk PBS plus Tween pr. vask. Der tilsættes 100 mikroliter peberrodsperoxidase M13 større proteinantistof til hver brønd for en times inkubation ved stuetemperatur. Derefter vaskes pladerne tre gange som påvist, og tilsæt 100 mikroliter TMB-substrat til hver brønd i en 10-minutters inkubation ved stuetemperatur, eller indtil der observeres en synlig farveændring.Derefter stoppe reaktionen med 100 mikroliter af en-molar saltsyre pr brønd, og læse pladen ved 450 nanometer på et spektrofotometer. Efter validering af ankerbindemiddel bør screening af bindemiddel med formindsket bindemiddel også udføres ved hjælp af det samme proteinbibliotek, der er målrettet mod ankerbindsbinderkomplekset. Typiske berigelsesresultater efter fire til seks udvælgelsesrunder er et godt tegn på, at der er et højt forhold mellem potentielle slag i underbibliotekerne, og i så fald er yderligere udvælgelsesrunder måske ikke nødvendige.EnkeltklonNE ELISA er velegnet til at analysere den relative bindende affinitet og selektivitet af anker- og dimeriseringsbindemidler og letter sammenligningen af bindende selektivitet mellem kloner. Ligeledes dimerization bindemiddel valg tillader identifikation af kloner, der danner en heterodimer med immobiliseret anker bindemiddel kun med eller uden ligand. Disse ligandkoncentrationsafhængige bindende data tyder på, at de testede nanostoffer er egnede til at konstruere et kemisk induceret dimerizationsystem sammenlignet med den dårlige binding, som kontrolprøverne har påvist.Endvidere kan analytisk størrelse-ekskludering kromatografi bruges til at bekræfte heterodimer dannelse mellem anker og dimerization bindemidler i overværelse af ligand. I dette eksperiment blev der f.eks. I modsætning hertil blev der ikke fundet nogen dimeriseringstoppe, hvis der ikke var cannabidiol, eller når hver projektmappe blev indlæst i kolonnen alene.Proteindæmpningssystemet bør være genetisk kodet i gær- eller pattedyrceller for at muliggøre yderligere kontrol af de udvalgte biosensorer til udvikling af in vivo-anvendelser. Vi forventer, at denne metode vil give andre forskere de effektive og nødvendige værktøjer til at opdage vigtige metabolitter, signalering molekyler, eller lægemidler in vivo med en høj spatiotemporal opløsning.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Bakteriel Inner-membran Display til screening af et bibliotek af antistof fragmenter

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

Effektiv og site-specifikt antistof Mærkning af stamme-forfremmet azid-alkyn Cycloaddition

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Måling af proteinbinding til F-actin ved co-sedimentering

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film infrarød elektrokemi demonstrerede for undersøgelse af H2 Oxidation af en [NiFe] Hydrogenase

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Meget følsom og kvantitativ påvisning af proteiner og deres isoformer af kapillar isoelektrisk fokusering metode

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Indfange interaktion kinetik af en Ion-kanal Protein med små molekyler af Bio-lag interferometri Assay

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunisering af Alpaka (Lama pacos) med Protein antigener og produktion af Antigen-specifikke enkelt domæne antistoffer

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse af proteinfoldning, Transport og nedbrydning i levende celler af radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...