Name: creating highly specific chemically induced protein dimerization systems by stepwise phage selection of a combinatorial single-domain antibody library
Uploaded: 2020-01-14T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library at JoVE

Diese Arbeit wurde durch den University of Washington Innovation Award (an L.G.), ein Stipendium der U.S. National Institutes of Health (1R35GM128918 to L.G.) und einen Startup-Fonds der University of Washington (zu L.G.) unterstützt. H.J. wurde von einem Stipendium der Washington Research Foundation unterstützt. K.W. wurde von einem Stipendium des University of Washington Institute for Protein Design unterstützt.

1. Bibliotheksbau
<ol><li>Verwenden Sie eine synthetische kombinatorische Single-Domain-Antikörperbibliothek mit einer Vielfalt von 1,23–7,14 x 109, wie zuvor beschrieben19. Dieses Protokoll enthält zwar keine Bibliothekserstellung, kann aber auch auf andere kombinatorische Binderbibliotheken angewendet werden.</li>
</ol>2. Biotinylierung von Ligandenziel oder Liganden
<ol><li>Biotinylatieren Sie den ausgewählten Liganden, z.B. CBD und Tetrahydrocannabin...

<ol>
	<li>Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+proximity+in+biology+and+medicine.">Chemically induced proximity in biology and medicine.</a> Science. 359 (6380), (2018).</li><li>Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+therapeutic+T+cells+through+a+small+molecule-gated+chimeric+receptor.">Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor.</a> Science. 350 (6258), (2015).</li><li>Straathof, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+caspase+9+safety+switch+for+T-cell+therapy.">An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy.</a> Blood. 105 (11), 4247-4254 (2005).</li><li>Di Stasi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+apoptosis+as+a+safety+switch+for+adoptive+cell+therapy.">Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (18), 1673-1683 (2011).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophysical Journal. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li><li>Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circularly+permuted+green+fluorescent+proteins+engineered+to+sense+Ca2+.">Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).</li><li>Hunter, M. M., Margolies, M. N., Ju, A., Haber, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+monoclonal+antibodies+to+the+cardiac+glycoside,+digoxin.">High-affinity monoclonal antibodies to the cardiac glycoside, digoxin.</a> Journal of Immunology. 129 (3), 1165-1172 (1982).</li><li>Bradbury, A. R. M., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+natural+antibodies:+the+power+of+in+vitro+display+technologies.">Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies.</a> Nature Biotechnology. 29 (3), 245-254 (2011).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-affinity+ligand-binding+proteins+by+periplasmic+expression+with+cytometric+screening+(PECS).">Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS).</a> Nature. Biotechnology. 19 (6), 537-542 (2001).</li><li>Tinberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+design+of+ligand-binding+proteins+with+high+affinity+and+selectivity.">Computational design of ligand-binding proteins with high affinity and selectivity.</a> Nature. 501 (7466), 212-216 (2013).</li><li>Spencer, D. M., Wandless, T. J., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+signal+transduction+with+synthetic+ligands.">Controlling signal transduction with synthetic ligands.</a> Science. 262 (5136), 1019-1024 (1993).</li><li>Ho, S. N., Biggar, S. R., Spencer, D. M., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimeric+ligands+define+a+role+for+transcriptional+activation+domains+in+reinitiation.">Dimeric ligands define a role for transcriptional activation domains in reinitiation.</a> Nature. 382 (6594), 822-826 (1996).</li><li>Belshaw, P. J., Ho, S. N., Crabtree, G. R., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+protein+association+and+subcellular+localization+with+a+synthetic+ligand+that+induces+heterodimerization+of+proteins.">Controlling protein association and subcellular localization with a synthetic ligand that induces heterodimerization of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4604-4607 (1996).</li><li>Farrar, M. A., AlberolaIla, J., Perlmutter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-1+kinase+cascade+by+coumermycin-induced+dimerization.">Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.</a> Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).</li><li>Erhart, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Development+of+Intracellular+Protein+Heterodimerizers.">Chemical Development of Intracellular Protein Heterodimerizers.</a> Chemistry &amp; Biology. 20 (4), 549-557 (2013).</li><li>Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+light-induced+protein+dimerization+in+living+cells+using+a+photocaged+dimerizer.">Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer.</a> Nature Communications. 17 (5), 5475 (2014).</li><li>Hill, Z. B., Martinko, A. J., Nguyen, D. P., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antibody-based+chemically+induced+dimerizers+for+cell+therapeutic+applications.">Human antibody-based chemically induced dimerizers for cell therapeutic applications.</a> Nature Chemical Biology. 14 (2), 112-117 (2018).</li><li>Foight, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-input+chemical+control+of+protein+dimerization+for+programming+graded+cellular+responses.">Multi-input chemical control of protein dimerization for programming graded cellular responses.</a> Nature Biotechnology. 37 (10), 1209-1216 (2019).</li><li>Kang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COMBINES-CID:+An+efficient+method+for+de+novo+engineering+of+highly+specific+chemically+induced+protein+dimerization+systems.">COMBINES-CID: An efficient method for de novo engineering of highly specific chemically induced protein dimerization systems.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (28), 10948-10952 (2019).</li><li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies:+natural+single-domain+antibodies.">Nanobodies: natural single-domain antibodies.</a> Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).</li><li>Fanning, S. W., Horn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-hapten+camelid+antibody+reveals+a+cryptic+binding+site+with+significant+energetic+contributions+from+a+nonhypervariable+loop.">An anti-hapten camelid antibody reveals a cryptic binding site with significant energetic contributions from a nonhypervariable loop.</a> Protein Science. 20 (7), 1196-1207 (2011).</li><li>Zavrtanik, U., Luken, J., Loris, R., Lah, J., Hadzi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+epitope+recognition+by+heavy-chain+camelid+antibodies.">Structural basis of epitope recognition by heavy-chain camelid antibodies.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (21), 4369-4386 (2018).</li><li>Denhardt, D. T., Dressler, D., Ray, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Single-Stranded DNA Phages. , 605-625 (1978).</li><li>Virnekas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trinucleotide+phosphoramidites:+ideal+reagents+for+the+synthesis+of+mixed+oligonucleotides+for+random+mutagenesis.">Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis.</a> Nucleic Acids Research. 22 (25), 5600-5607 (1994).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+single-molecule+interaction+profiling+of+DNA-barcoded+proteins.">Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcoded proteins.</a> Nature. 515 (7528), 554-557 (2014).</li></ol>

Es ist wichtig, die richtigen Konzentrationen von Eingangs-Phagenbibliotheken für verschiedene Runden der Biopanning zu wählen. Wir begannen in der Regel mit einer Eingabebibliothek von 1012–1013 Phagenpartikeln mit einer Diversität >109,so dass 100–1.000 Kopien jedes Phagenklons im Pull-Down-Test präsentiert werden konnten. Wenn die Phagenkonzentration in einem Bindungstest zu hoch oder zu niedrig ist, steigt die Wahrscheinlichkeit einer unspezifischen Bindung oder des Verlusts p...

CID-Systeme, bei denen zwei Proteine nur in Gegenwart eines kleinmolekularen Liganden dimerisieren (Abbildung 1), bieten vielseitige Werkzeuge zum Sezieren und Manipulieren von Stoffwechsel-, Signal- und anderen biologischen Wegen1. Sie haben das Potenzial in der biologischen Betätigung, wie die medikamentöse T-Zell-Aktivierung2 und Apoptose3,4, zur Verbesserung der Sicherheit und Wirksamkeit der Adoptiv-T-Zelltherapie gezeigt. Darüber hinaus bieten sie eine neue Methodik für den In-vivo- oder In-vitro-Nachweis von Kleinmolekülzielen. Beispielsweise können CID-Proteine genetisch mit Fluoreszenzreportersystemen (z. B. Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET)5 und kreisförmig permutierten fluoreszierenden Proteinen)6 für Echtzeit-In-vivo-Messungen verschmolzen werden oder als Affinitätsreagenzien für Sandwich-Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA)-ähnliche Assays dienen.
Trotz ihrer breiten Anwendungen stellt die Schaffung neuer CID-Systeme, die von einem bestimmten kleinmolekularen Liganden gesteuert werden können, große Herausforderungen. Etablierte Proteinbinder-Engineering-Methoden einschließlich Tierimmunisierung7, In-vitro-Auswahl8,9und computergestütztes Proteindesign10 können Liganden-Bindungsproteine erzeugen, die über binäre Protein-Liganden-Wechselwirkungen funktionieren. Diese Methoden haben jedoch Schwierigkeiten, einen Liganden-induzierten ternären CID-Komplex zu schaffen. Einige Methoden erzeugen CID, indem sie zwei Liganden chemisch verbinden, die unabhängig voneinander an die gleichen oder unterschiedlichen Proteinebinden 11,12,13,14,15,16 oder sich auf die Auswahl von Bindemittelproteinen wie Antikörpern konzentrieren, die auf bereits bestehende kleine Molekül-Protein-Komplexe abzielen17,18, und somit eine begrenzte Auswahl an Liganden haben.
Wir haben vor kurzem eine combinatorial binders-enabled sWahl der CID (COMBINES-CID) Methode für de novo Engineering von CID-Systemenentwickelt 19. Diese Methode kann die hohe Spezifität der Liganden-induzierten Dimerisierung erhalten (z. B. eine Anker-Dimerisierungsbinder-Dissoziationskonstante, KD (ohne Ligand)/KD (mit Ligand) > 1.000). Die Dimerisierungsssspezifität wird mit Ankerbindern mit flexiblen Bindestellen erreicht, die konforme Veränderungen bei der Ligandenbindung mit sich bringen können, was eine Grundlage für die Auswahl von konform selektiven Bindemitteln bietet, die nur ligaandgebundene Ankerbinder erkennen. Wir demonstrierten einen Proof-of-Prinzip durch die Schaffung von Cannabidiol (CBD)-induzierten Heterodimeren von Nanokörpern, einem 12–15 kDa-Funktionsantikörperfragment aus Kamelid, das ein universelles Gerüst und drei flexible CDR-Schleifen (Abbildung 2)20enthält, die eine Bindungstasche mit anpassungsfähigen Größen für kleinmolekulare Epitope21,22bilden können. Insbesondere sollte die In-vitro-Auswahl einer kombinatorischen Proteinbibliothek kostengünstig und verallgemeinerbar für CID-Engineering sein, da die gleiche hochwertige Bibliothek auf verschiedene Liganden angewendet werden kann.
In diesem Protokoll und Video konzentrieren wir uns auf die Beschreibung der zweistufigen In-vitro-Auswahl und Validierung von Anker- (Abbildung 3A) und Dimerisierungsbindern (Abbildung 3B) durch Screening der kombinatorischen Nanokörperbibliothek mit einer Vielfalt von mehr als 109 unter Verwendung von CBD als Ziel, aber das Protokoll sollte auf andere Proteinbibliotheken oder Kleinmolekülziele anwendbar sein. Das Screening von CID-Bindemitteln dauert in der Regel 6 bis 10 Wochen (Abbildung 4).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BirA biotin-protein ligase standard reaction kit</td>
			<td>Avidity</td>
			<td>BirA500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7078-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM13 Helper phage</td>
			<td>Antibody Design Labs</td>
			<td>PH020L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3238S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest BglI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 26/10 Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17508701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap-FF-1ml</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>11000458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13 Major Coat Protein Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-53004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>260251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet RED96</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADL-23c Phagemid Vector</td>
			<td>Antibody Design Labs</td>
			<td>PD0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-6000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81260-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum SuperFi DNA Polymerase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12351010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink PCR Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin M13 Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Medium</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>80026-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Plus 384</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Streptavidin (SSA) Biosensors</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18-5057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 increase 10/300 GL Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9909-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15224-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TG1 Electrocompetent Cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60502-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>471283-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP9726-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89882</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creating highly specific chemically induced protein dimerization systems by stepwise phage selection of a combinatorial single-domain antibody library

Protein-Dimerisierungsereignisse, die nur in Gegenwart eines kleinmolekularen Ligands auftreten, ermöglichen die Entwicklung von kleinmolekularen Biosensoren zur Zerlegung und Manipulation biologischer Bahnen. Derzeit gibt es nur eine begrenzte Anzahl chemisch induzierter Dimerisierungssysteme (CID) und neue Systeme mit gewünschter Empfindlichkeit und Selektivität für bestimmte kleinmolekulare Liganden zu erschaffen, bleibt eine Herausforderung im Bereich der Proteintechnik. Wir beschreiben hier ein Verfahren zum Screening mit hohem Durchsatz, kombinatorial binders-enabled sElection von CID (COMBINES-CID), für die de novo Engineering von CID-Systemen, die auf eine Vielzahl von Liganden anwendbar sind. Diese Methode verwendet die zweistufige Auswahl einer phagenangezeigten kombinatorischen Nanokörperbibliothek, um 1) "Ankerbinder" zu erhalten, die zuerst an einen Voninteresse gebundenen Liganden und dann an 2) "Dimerisierungsbinder" binden, die nur an Ankerbinder-Ligand-Komplexe binden. Zur Auswahl von Ankerbindern wird eine kombinatorische Bibliothek mit über 109 komplementär-bestimmenden Nanokörpern (CDR)-randomisierten Nanokörpern mit einem biotinylierten Liganden abgeschirmt und Treffer mit dem unbeschrifteten Liganden durch Bioschichtinterferometrie (BLI) validiert. Um Dimerisierungsbindemittel zu erhalten, wird die Nanokörperbibliothek mit Ankerbinder-Ligand-Komplexen als Ziel für positives Screening und den ungebundenen Ankerbindern für negatives Screening abgeschirmt. COMBINES-CID ist allgemein anwendbar auf ausgewählte CID-Bindemittel mit anderen Immunglobulin,Non-Immunoglobulin oder computerisch konstruierten Gerüsten, um Biosensoren für den In-vitro- und In-vivo-Nachweis von Medikamenten, Metaboliten, Signalmolekülen usw. zu erstellen.

Wir beschreiben die zweistufige In-vitro-Auswahl und Validierung von Anker- und Dimerisierungsbindern, indem wir die kombinatorische Nanokörperbibliothek mit einer Vielfalt von mehr als 109 unter Verwendung von CBD als Ziel screeningen. Die Beurteilung der Anreicherung der Phagenbiopanning während der aufeinanderfolgenden Selektionsrunden für Anker- und Dimerisierungsbindemittel ist wichtig. Typische Anreicherungsergebnisse nach 4:6 Auswahlrunden, wie in Abbildung 5 dargestellt...

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Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Die Schaffung chemisch induzierter Proteindimerisierungssysteme mit gewünschter Affinität und Spezifität für einen bestimmten kleinen Molekülligand hätte viele biologische Sensor- und Betätigungsanwendungen. Hier beschreiben wir eine effiziente, verallgemeinerbare Methode zur de novo Engineering von chemisch induzierten Dimerisierungssystemen durch die schrittweise Auswahl einer phagenangezeigten kombinatorischen Ein-Domänen-Antikörperbibliothek.

Erstellen hochspezifischer chemisch induzierter Proteindimerisierungssysteme durch schrittweise Phage-Auswahl einer kombinatorischen Single-Domain-Antikörperbibliothek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es einen allgemeinen Ansatz für die Entwicklung von Protein-Dimerisierungssystemen als Biosensoren für eine Vielzahl von kleinen Molekülen bietet. Darüber hinaus nutzt es eine sehr vielfältige Proteinbibliothek, um Biosensoren für verschiedene Liganden effizient und kostengünstig auszuwählen, ohne dass spezielle Geräte benötigt werden. Der entwickelte Biosensor kann verwendet werden, um das Zellverhalten chemisch zu steuern und Veränderungen in Zellmetaboliten in Echtzeit zu überwachen.Durch diese visuelle Demonstration können die Forscher eine detaillierte Anleitung der Techniken mit einer klaren Erwartung des experimentellen Ergebnisses beobachten. Beginnen Sie jede Auswahlrunde, indem Sie ein einzelnes TG1-Elektroporations-fähiges Zellvolk in sechs Millilitern 2YT-Medium bei 37 Grad Celsius und 250 Umdrehungen pro Minute auf eine 600-Nanometer-Absorption von etwa 0,5 anbauen. Wenn die optimale optische Dichte erreicht ist, legen Sie die Zellen auf Eis.Um die negativen Selektionsperlen vorzubereiten, waschen Sie 300 Mikroliter Streptavidin-beschichtete Magnetperlen dreimal mit einem Milliliter 05%PBS plus Tween-Puffer und zweimal mit einem Milliliter PBS pro Wäsche auf einem magnetischen Trennträger. Setzen Sie die Perlen mit einem Milliliter 1%Casein in PBS aus, und sätten Sie die Perlen mit Biotin bei der fünfmal so hoch bezeichneten Bindungskapazität der Perlen. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur mit Rotation die Perlen fünfmal mit PBS plus Tween und dreimal mit PBS waschen, wie gezeigt.Nach der letzten Wäsche etwa ein mal 10 zu den 13 Phagenpartikeln in 1%Casein und 1%rinderserumalbumin in PBS zu den Perlen für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur mit Rotation hinzufügen. Am Ende der Inkubation den Überstand in ein 1,5-Milliliter-Rohr übertragen. Zur positiven Selektion mit den biotinylierten, ligaandgebundenen Streptavidinperlen die Hälfte des Volumens der Perlen, die für die negative Selektion in der biotinylierten Liganden der Wahl verwendet werden, bei der fünffachen vollen Bindungskapazität, wie nach dem Handbuch berechnet, sättigen.Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur mit Rotation die Perlen fünfmal mit PBS plus Tween und dreimal mit PBS allein wie gezeigt, und blockieren Sie die Perlen mit einem Milliliter 1%Casein und 1%rinderserumalbumin für eine Stunde mit Rotation. Waschen Sie am Ende der Inkubation die mit Streptavidin beschichteten Magnetperlen dreimal in PBS plus Tween und einmal nur in PBS, wie gezeigt, und verwenden Sie ungebundenen Phagen, um die mit Streptavidin beschichteten Magnetperlen wieder aufzuhängen. Extrahieren Sie den ungebundenen phagenhaltigen Überstand, ohne die Perlen zu stören, und legen Sie die Probe beiseite, um als Eingabe verwendet zu werden.Dann waschen Sie die Perlen 10 Mal mit PBS plus Tween und fünfmal mit PBS, wie gezeigt, die Perlen auf ein neues Rohr nach jeder drei Wäsche übertragen, um eine unspezifische Bindung der gebundenen Phagen an die Rohrwände zu vermeiden. Um die gebundenen Phagen wettbewerbsfähig zu machen, fügen Sie 450 Mikroliter einer mikromolaren Konzentration von nicht-biotinyliertem Liganden zu den positiven Selektionsperlen hinzu und legen Sie die Perlen 30 Minuten lang auf Rotation. Übertragen Sie den Überstand am Ende der Inkubation in ein neues Rohr, das als Ausgang verwendet werden soll.Für die Eingangstitration 10 serielle Verdünnungen in PBS bis zu einem Mal 10 bis zum Neunfachen mit dem Eingangsphagen vorbereiten. Übertragen Sie 10 Mikroliter Eingangsphagen von den einmal 10 auf die sieben bis zehn auf die neun Verdünnungen auf 70-Mikroliter-Aliquots der vorbereiteten TG1-Zellen. Nach 45 Minuten bei 37 Grad Celsius die infizierten TG1-Zellen auf einzelne 90-Millimeter-Agar-Gerichte mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin und 2% Glukose für eine nächtliche Inkubation bei 37 Grad Celsius aufweisen.Verwenden Sie am nächsten Morgen die Formel, um den Phageneingang zu berechnen. Für Eine Ausgangsinfektion und Titration die eluierten Phagen zu drei Millilitern TG1-Zellen für eine 45-minütige Inkubation in einem 37-Grad-Celsius-Wasserbad hinzufügen. Dann bereiten Sie 10 serielle Verdünnungen der infizierten Zellen in frischem 2YT-Medium bis zu einem mal 10 bis zur dritten Konzentration vor und verdünnen Sie jede Verdünnung auf 90-Millimeter 2YT Agar-Gerichte für ihre nächtliche Inkubation bei 37 Grad Celsius.Berechnen Sie am nächsten Morgen die Phagenausgabe nach der Formel. Um einzelne Klone aus einer angereicherten Unterbibliothek zu isolieren, übertragen Sie einzelne Kolonien aus den über Nacht kultivierten, phageninfizierten TG1-Zellplatten in 250 Mikroliter 2YT-Medium, ergänzt mit Ampicillin pro Brunnen in sterilen Tiefbrunnenplatten für ihre Nachtkultur bei 37 Grad Celsius. Wenn die Zellen eine Dichte von 600 Nanometern von etwa 0,5 erreichen, fügen Sie den neun Plaque-bildenden Einheiten pro Milliliter CM13-Helferphagen fünfmal 10 zu und bebrüten die Zellen 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius bei 250 Umdrehungen pro Minute.Am Ende der Inkubation 500 Mikroliter 2YT-Medium mit Ampicillin und 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin zu jedem Brunnen hinzufügen und die Platte über Nacht auf 25 Grad Celsius und 250 Umdrehungen pro Minute legen. Am nächsten Morgen sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation, um die Entnahme der Phagenpartikel zu ermöglichen. Um die Ankerbindung durch ELISA zu validieren, beschichten Sie 96-Well-ELISA-Platten mit 100 Mikrolitern von fünf Mikroliter pro Milliliter Streptavidin im Beschichtungspuffer bei vier Grad Celsius über Nacht.Am nächsten Morgen die Platten dreimal in 300 Mikroliter PBS plus Tween waschen, bevor 100 Mikroliter einmikromolares Biotinylziel in die Zielbrunnen und 100 Mikroliter Einmikromollarbiotin oder Zielhomolog in die entsprechenden Kontrollbrunnen gegeben werden. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur die Platten fünfmal mit PBS plus Tween pro Waschgang waschen und jede unspezifische Bindung mit 300 Mikrolitern 1%Casein pro Brunnen für eine Stunde bei Raumtemperatur blockieren. Am Ende der Inkubation die Teller dreimal in frischem PBS plus Tween pro Wäsche waschen und den gereinigten Phagenüberstand hinzufügen.Nach einer Stunde bei Raumtemperatur die Teller 10 Mal mit frischem PBS plus Tween pro Waschgang waschen. Fügen Sie 100 Mikroliter Meerrettichperoxidase M13 HauptbeschichtungProteinAntikörper zu jedem Brunnen für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur. Waschen Sie dann die Platten dreimal wie gezeigt, und fügen Sie 100 Mikroliter TMB-Substrat zu jedem Brunnen für eine 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur oder bis eine sichtbare Farbänderung beobachtet wird.Dann stoppen Sie die Reaktion mit 100 Mikrolitern ein-Molaren-Salzsäure pro Brunnen, und lesen Sie die Platte bei 450 Nanometern auf einem Spektralphotometer. Nach der Ankerbindervalidierung sollte das Dimerisierungsbinder-Screening auch mit derselben Proteinbibliothek durchgeführt werden, die auf den Ankerbinder-Ligand-Komplex abzielt. Typische Anreicherungsergebnisse nach vier bis sechs Auswahlrunden sind ein gutes Indiz dafür, dass es in den Unterbibliotheken ein hohes Verhältnis potenzieller Treffer gibt, in diesem Fall sind weitere Auswahlrunden möglicherweise nicht erforderlich.Single-Clone-ELISA eignet sich zur Analyse der relativen Bindungsaffinität und Selektivität von Anker- und Dimerisierungsbindern und erleichtert den Vergleich der Bindungsselektivität zwischen Klonen. Ebenso ermöglicht die Dimerisierungsbinderauswahl die Identifizierung von Klonen, die einen Heterodimer mit dem immobilisierten Ankerbinder nur mit oder ohne Liganden bilden. Diese ligaanden konzentrationsabhängigen Bindungsdaten deuten darauf hin, dass die getesteten Nanokörper für den Aufbau eines chemisch induzierten Dimerisierungssystems im Vergleich zu der schlechten Bindung geeignet sind, die durch die Kontrollproben nachgewiesen wird.Darüber hinaus kann die analytische Größenausschlusschromatographie verwendet werden, um die Heterodimerbildung zwischen Anker- und Dimerisationsbindern in Gegenwart des Liganden zu bestätigen. In diesem Experiment wurde beispielsweise ein Dimerisierungsgipfel beobachtet, wenn Anker- und Dimerisationsbindemittel und Cannabidiol gemischt wurden. Im Gegensatz dazu wurde kein Dimerisierungspeak in Abwesenheit von Cannabidiol oder wenn jeder Binder allein auf die Säule geladen wurde, erkannt.Das Proteindimerisierungssystem sollte genetisch in Hefe- oder Säugetierzellen kodiert werden, um eine weitere Überprüfung der ausgewählten Biosensoren für die Entwicklung von In-vivo-Anwendungen zu ermöglichen. Wir erwarten, dass diese Methode anderen Forschern die effektiven und notwendigen Werkzeuge zum Nachweis wichtiger Metaboliten, Signalmoleküle oder Medikamente in vivo mit einer hohen raumzeitlichen Auflösung geben wird.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Forschung

Biochemie

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