Name: creating highly specific chemically induced protein dimerization systems by stepwise phage selection of a combinatorial single-domain antibody library
Uploaded: 2020-01-14T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library at JoVE

עבודה זו נתמכת על ידי פרס החדשנות אוניברסיטת וושינגטון (כדי L.G.), מענק של U.S. המכונים הלאומיים לבריאות (1R35GM128918 כדי L.G.), ו קרן אתחול של אוניברסיטת וושינגטון (כדי L.G.). H.J. היתה נתמכת על ידי מלגת קרן וושינגטון למחקר. K.W. נתמכת על ידי מלגת לתואר ראשון מהמכון לעיצוב חלבונים באוניברסיטת וושינגטון.

1. בניית ספרייה
<ol><li>השתמש קומבינטורית סינתטי מתחם יחיד בספריית הנוגדן עם מגוון של ~ 1.23 – 7.14 x 109, כפי שתוארה בעבר19. בעוד שפרוטוקול זה אינו כולל בניית ספריות, ניתן להחילו על ספריות אוגדן אחרות הקומבינטורית.</li>
</ol>2. ביוטילציה של ליג, מטרה או ליגטין
<ol><li>Biotinylate א?...

<ol>
	<li>Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+proximity+in+biology+and+medicine.">Chemically induced proximity in biology and medicine.</a> Science. 359 (6380), (2018).</li><li>Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+therapeutic+T+cells+through+a+small+molecule-gated+chimeric+receptor.">Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor.</a> Science. 350 (6258), (2015).</li><li>Straathof, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+caspase+9+safety+switch+for+T-cell+therapy.">An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy.</a> Blood. 105 (11), 4247-4254 (2005).</li><li>Di Stasi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+apoptosis+as+a+safety+switch+for+adoptive+cell+therapy.">Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (18), 1673-1683 (2011).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophysical Journal. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li><li>Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circularly+permuted+green+fluorescent+proteins+engineered+to+sense+Ca2+.">Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).</li><li>Hunter, M. M., Margolies, M. N., Ju, A., Haber, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+monoclonal+antibodies+to+the+cardiac+glycoside,+digoxin.">High-affinity monoclonal antibodies to the cardiac glycoside, digoxin.</a> Journal of Immunology. 129 (3), 1165-1172 (1982).</li><li>Bradbury, A. R. M., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+natural+antibodies:+the+power+of+in+vitro+display+technologies.">Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies.</a> Nature Biotechnology. 29 (3), 245-254 (2011).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-affinity+ligand-binding+proteins+by+periplasmic+expression+with+cytometric+screening+(PECS).">Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS).</a> Nature. Biotechnology. 19 (6), 537-542 (2001).</li><li>Tinberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+design+of+ligand-binding+proteins+with+high+affinity+and+selectivity.">Computational design of ligand-binding proteins with high affinity and selectivity.</a> Nature. 501 (7466), 212-216 (2013).</li><li>Spencer, D. M., Wandless, T. J., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+signal+transduction+with+synthetic+ligands.">Controlling signal transduction with synthetic ligands.</a> Science. 262 (5136), 1019-1024 (1993).</li><li>Ho, S. N., Biggar, S. R., Spencer, D. M., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimeric+ligands+define+a+role+for+transcriptional+activation+domains+in+reinitiation.">Dimeric ligands define a role for transcriptional activation domains in reinitiation.</a> Nature. 382 (6594), 822-826 (1996).</li><li>Belshaw, P. J., Ho, S. N., Crabtree, G. R., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+protein+association+and+subcellular+localization+with+a+synthetic+ligand+that+induces+heterodimerization+of+proteins.">Controlling protein association and subcellular localization with a synthetic ligand that induces heterodimerization of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4604-4607 (1996).</li><li>Farrar, M. A., AlberolaIla, J., Perlmutter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-1+kinase+cascade+by+coumermycin-induced+dimerization.">Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.</a> Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).</li><li>Erhart, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Development+of+Intracellular+Protein+Heterodimerizers.">Chemical Development of Intracellular Protein Heterodimerizers.</a> Chemistry &amp; Biology. 20 (4), 549-557 (2013).</li><li>Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+light-induced+protein+dimerization+in+living+cells+using+a+photocaged+dimerizer.">Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer.</a> Nature Communications. 17 (5), 5475 (2014).</li><li>Hill, Z. B., Martinko, A. J., Nguyen, D. P., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antibody-based+chemically+induced+dimerizers+for+cell+therapeutic+applications.">Human antibody-based chemically induced dimerizers for cell therapeutic applications.</a> Nature Chemical Biology. 14 (2), 112-117 (2018).</li><li>Foight, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-input+chemical+control+of+protein+dimerization+for+programming+graded+cellular+responses.">Multi-input chemical control of protein dimerization for programming graded cellular responses.</a> Nature Biotechnology. 37 (10), 1209-1216 (2019).</li><li>Kang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COMBINES-CID:+An+efficient+method+for+de+novo+engineering+of+highly+specific+chemically+induced+protein+dimerization+systems.">COMBINES-CID: An efficient method for de novo engineering of highly specific chemically induced protein dimerization systems.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (28), 10948-10952 (2019).</li><li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies:+natural+single-domain+antibodies.">Nanobodies: natural single-domain antibodies.</a> Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).</li><li>Fanning, S. W., Horn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-hapten+camelid+antibody+reveals+a+cryptic+binding+site+with+significant+energetic+contributions+from+a+nonhypervariable+loop.">An anti-hapten camelid antibody reveals a cryptic binding site with significant energetic contributions from a nonhypervariable loop.</a> Protein Science. 20 (7), 1196-1207 (2011).</li><li>Zavrtanik, U., Luken, J., Loris, R., Lah, J., Hadzi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+epitope+recognition+by+heavy-chain+camelid+antibodies.">Structural basis of epitope recognition by heavy-chain camelid antibodies.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (21), 4369-4386 (2018).</li><li>Denhardt, D. T., Dressler, D., Ray, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Single-Stranded DNA Phages. , 605-625 (1978).</li><li>Virnekas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trinucleotide+phosphoramidites:+ideal+reagents+for+the+synthesis+of+mixed+oligonucleotides+for+random+mutagenesis.">Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis.</a> Nucleic Acids Research. 22 (25), 5600-5607 (1994).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+single-molecule+interaction+profiling+of+DNA-barcoded+proteins.">Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcoded proteins.</a> Nature. 515 (7528), 554-557 (2014).</li></ol>

חשוב לבחור את הריכוזים הנכונים של ספריות phage קלט עבור סיבובים שונים של ביואננינג. אנחנו בדרך כלל התחלנו מספריית הקלט של ~ 1012– 1013 phage חלקיקים עם גיוון > 109, המאפשר ~ 100-1000 עותקים של כל שיבוט phage להיות מוצג בתוך שיטת המשיכה למטה. אם הריכוז phage בתוך הסדר מחייב הוא גבוה מדי או נמוך, ?...

CID מערכות, שבו שני חלבונים dimerize רק בנוכחות של מולקולה קטנה (איור 1), מציעים כלים רב-תכליתי לניתוח ותפעול מטבולית, איתות, ומסלולים ביולוגיים אחרים1. הם הפגינו את הפוטנציאל בהפעלה ביולוגית, כגון הפעלה מבוקרת סמים T2 ו אפופטוזיס3,4, לשיפור הבטיחות והיעילות של טיפול תא T המאמצת. בנוסף, הם מספקים מתודולוגיה חדשה בvivo או בזיהוי מתורבת של מטרות מולקולות קטנות. לדוגמה, חלבונים CID יכול להיות התמזגו גנטית עם מערכות העיתונאי הניאון (g., העברת אנרגיה בתהודה של אור השמש (למשל)5 ו מעגליות חלבונים פלורסנט מושתק)6 עבור בזמן אמת במדידות vivo, או לשמש ריאגנטים אהדה עבור כריך האנזים מקושר חיסוני כפוף (אליסה)-כמו assays.
למרות היישומים הרחבים שלהם, יצירת מערכות CID חדשות שיכולות להיות נשלטות על-ידי מולקולה קטנה ובעלת אתגרים מרכזיים. הוקמה שיטות הנדסה חלבון קלסר כולל חיסון בעלי חיים7, בחירה מחוץ גופית8,9, ועיצוב חלבון חישובית10 יכול ליצור ליגנד מחייב חלבונים הפועלים באמצעות חלבון בינארי-ליגנד אינטראקציות. עם זאת, שיטות אלה יש קשיים ביצירת מתחם CID ליגארי המושרה. כמה שיטות ליצור סיד על ידי קישור כימי שני ליגניות כי באופן עצמאי לאגד את אותם חלבונים או שונים11,12,13,14,15,16 או להסתמך על בחירת חלבונים קלסר כגון נוגדנים ליעד מולקולה קטנה מולקולת חלבון מתחמים17,18, ולכן יש מבחר מוגבל של ליגנדס.
פיתחנו לאחרונה מקוםהבחירה של החבר ' ה-e NABLEDהבחירות של סיד (משלבת סיד) שיטה עבור דה נובו הנדסה של סיד מערכות19. שיטה זו יכולה להשיג את היחודיות הגבוהה של דימרזציה (לדוגמה, קבוע עוגן-דימרזציה, kd (ללא Ligand)/kd (עם ligand) > 1,000). ספציפיות הדימרזציה מושגת באמצעות קלסרים עוגן עם אתרי קשירה גמישים שיכולים להציג שינויים מתרניים עם ליגנד מחייב, מתן בסיס לבחירה של קלסרים סלקטיבי מבחינה מבצעית רק לזהות ליגור העוגן אוגדן. הדגמנו הוכחה של עקרון על ידי יצירת קנאידיל (CBD) המושרה הטרודימרס של nanobodies, 12 – 15 מקטע נוגדן מסוג kda מתוך גמליים הכוללת פיגום אוניברסלי ושלושה cdr לולאות גמיש (איור 2)20, אשר יכול ליצור כיס מחייב עם הגדלים של מולקולהקטנה מולקולות21. בעיקר, הבחירה מחוץ גופית של ספריית החלבון קומבינטורית צריך להיות חסכוני וכללי עבור הנדסת CID, כי הספרייה באיכות גבוהה ניתן להחיל על ליגניות שונות.
בפרוטוקול זה וידאו, אנו מתמקדים בתיאור שני שלבים בחירת מבחנה ואימות של עוגן (איור 3A) ו dimerization קלסרים (איור 3ב) על ידי הקרנת ספריית קומבינטורית nanobody עם גיוון גבוה יותר 109 באמצעות CBD כיעד, אבל הפרוטוקול צריך להיות ישים לספריות חלבון אחרות או מולקולות קטנות מטרות. ההקרנה של בקלסרים CID לוקח בדרך כלל 6 – 10 שבועות (איור 4).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BirA biotin-protein ligase standard reaction kit</td>
			<td>Avidity</td>
			<td>BirA500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7078-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM13 Helper phage</td>
			<td>Antibody Design Labs</td>
			<td>PH020L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3238S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest BglI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 26/10 Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17508701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap-FF-1ml</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>11000458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13 Major Coat Protein Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-53004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>260251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet RED96</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADL-23c Phagemid Vector</td>
			<td>Antibody Design Labs</td>
			<td>PD0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-6000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81260-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum SuperFi DNA Polymerase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12351010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink PCR Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin M13 Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Medium</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>80026-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Plus 384</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Streptavidin (SSA) Biosensors</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18-5057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 increase 10/300 GL Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9909-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15224-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TG1 Electrocompetent Cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60502-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>471283-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP9726-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89882</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creating highly specific chemically induced protein dimerization systems by stepwise phage selection of a combinatorial single-domain antibody library

אירועים מדימריזציה של חלבונים המתרחשים רק בנוכחות של מולקולה קטנה ומאפשרים פיתוח של מולקולה קטנה ביולוגית לניתוח ומניפולציה של מסלולים ביולוגיים. כיום, רק מספר מוגבל של מערכות dimerization בהשפעת כימית (CID) קיימים והנדסה חדשים עם רגישות הרצויה וסלקטיביות עבור ליגניות מולקולות קטנות מסוימות נשאר אתגר בתחום הנדסת חלבונים. אנו מתארים את השיטה הקרנת תפוקה גבוהה, comביננדרס בן ders-e nabled הבחירות שלסיד (משלב סיד), עבור דה נובו הנדסה של סיד מערכות החלים על מגוון רחב של ליגנדס. שיטה זו משתמשת בבחירה בשני השלבים של הספרייה phage מוצג קומבינטורית ננוגוף כדי לקבל 1) "עוגן אוגדן" כי לאגד הראשון כדי להשיג ולאחר מכן 2) "dimerization קלסרים" כי רק לאגד עוגן מאגד-ליגנד מכלולי. כדי לבחור בקלסרים עוגן, ספריית קומבינטורית של מעל 109 האזור משלימה לקביעת (cdr)-ננוגופים אקראיים מוקרן עם ligtinylated וכניסות מאומתים עם ליגנד על ידי ביולוגי אינטרפרומטריה (בלי). כדי להשיג בקלסרים dimerization הספרייה הננו מוקרן עם העוגן קלסר-ligand מכלולי כמטרות עבור הקרנה חיובית ואוגדן עוגן מאוגד עבור הקרנה שלילית. משלבת-CID ישימה באופן כללי כדי לבחור בקלסרים CID עם חיסוני אחרים, non-חיסוני, או בחינה חישובית עוצב מתוכננת הפיגומים כדי ליצור ביוחיישנים עבור מבחנה ב-vivo זיהוי של תרופות, מטבוליטים, מולקולות איתות, וכו '.

אנו מתארים את שני השלבים בבחירת מבחנה ואימות של העוגן ו dimerization קלסרים על ידי הקרנת הספרייה קומבינטורית ננוbody עם גיוון גבוה יותר 109 באמצעות CBD כיעד. הערכת העשרת ביואננינג במהלך הסיבובים הרצופים של בחירת העוגן והדימרזציה, חשובה ביותר. תוצאות העשרה טיפוסיות לאחר 4 – 6 סיבובים של בחירה כפ...

Watch this Scientific Journal Video about Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library at JoVE

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

יצירת מערכות דימרזציה בתחום החלבונים עם הזיקה הרצויה וספציפיות לכל מולקולה קטנה שניתנה לפני הרבה מולקולות ובקשות חישה והגשמה. כאן, אנו מתארים שיטה יעילה, הניתן להכליל עבור דה נובו הנדסה של מערכות דימריזציה הנגרמת כימית דרך הבחירה החורגת של קומבינטורית הציג phage בספרייה נוגדן יחיד בתחום.

יצירת חלבון מאוד ספציפי הנגרמת כימית מערכות דימריזציה על ידי בחירת בחירה באמצעות מבחר של קומבינטורית מתחם יחיד בספריית הנוגדן

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מספק גישה כללית להנדסת מערכות עמעום חלבונים כמו biosensors עבור מגוון רחב של מולקולות קטנות. בנוסף, היא משתמשת בספריית חלבונים מגוונת מאוד כדי לבחור biosensors עבור ליגנדים שונים בצורה יעילה וחסכונית ללא צורך בציוד מיוחד. הביו-סנסור המהונדס יכול לשמש לשליטה כימית בהתנהגות התאים ולניטור שינויים בזמן אמת במטבוליטים של התאים.באמצעות הדגמה חזותית זו, החוקרים יכולים לצפות בהוראה מפורטת של הטכניקות עם ציפייה ברורה לתפוקה הניסיונית. התחל כל סיבוב של בחירה על ידי גידול מושבת תאים אחת TG1 אלקטרופולציה כשירה בשישה מיליליטר של מדיום 2YT ב 37 מעלות צלזיוס ו 250 מהפכות לדקה לספיגה 600 ננומטר של כ 0.5. כאשר הצפיפות האופטית האופטית האופטימלית הושגה, מקם את התאים על קרח.כדי להכין את חטוזי הבחירה השליליים, שטפו 300 מיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטבידין שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של 05%PBS בתוספת חיץ Tween ופי שניים עם מיליליטר אחד של PBS לכל שטיפה על מתלה הפרדה מגנטית. תוכלו להתרכך מחדש עם מיליליטר אחד של 1%casein ב-PBS, ולהרווי את חרוזים עם ביוטין פי חמישה מקיבולת הכריכה המדווחת של חרוזים. לאחר שעה בטמפרטורת החדר עם סיבוב, לשטוף את חרוזים חמש פעמים עם PBS בתוספת Tween ושלוש פעמים עם PBS כפי שהוכח.לאחר הכביסה האחרונה, הוסיפו בערך פי 10 ל-13 חלקיקי הפאג' ב-1%קאזין ו-1%אלבומין סרום בקר ב-PBS ל-PBS כדי לקבל דגירה של שעה בטמפרטורת החדר עם סיבוב. בסוף הדגירה, מעבירים את העל-טבעי לצינור של 1.5 מיליליטר. לבחירה חיובית עם חמוזי סטרפטבידין הקשורים לליגנד, רווי מחצית מנפח חרוזים המשמשים לבחירה השלילית בליגה הביוטינילציה של הבחירה פי חמישה מקיבולת הכריכה המלאה כפי שחושבה על פי המדריך.לאחר דגירה של שעה בטמפרטורת החדר עם סיבוב, לשטוף את חרוזים חמש פעמים עם PBS בתוספת Tween ושלוש פעמים עם PBS לבד כפי שהוכח, ולחסום את חרוזים עם מיליליטר אחד של 1% קסטין ו 1% אלבומין סרום בקר במשך שעה אחת עם סיבוב. בסוף הדגירה, לשטוף את חרוזים מגנטיים מצופה סטרפטבידין שלוש פעמים PBS בתוספת Tween ופעם אחת PBS לבד כפי שהוכח, ולהשתמש פאג ' מאוגד כדי resuspend את גם גם ציפוי streptavidin חרוזים מגנטיים. מוציאים את הפאג' הלא מאוגד המכיל על-טבעי מבלי להפריע לחבילות, ומניחים את הדגימה בצד כדי שתשמש כקלט.לאחר מכן לשטוף את חרוזים 10 פעמים עם PBS בתוספת Tween וחמש פעמים עם PBS כפי שהודגם, העברת חרוזים צינור חדש לאחר כל שלוש שטיפות, כדי למנוע כריכה לא ספציפית של פאג'ים כבולים לקירות הצינור. כדי להשתיק באופן תחרותי את הפאג'ים המאוגדים, הוסיפו 450 מיקרוליטרים של ריכוז מיקרומולארי של ליגנד שאינו ביוטינילציה לחרוזי הבחירה החיוביים, והמקמו את חרוזים על סיבוב במשך 30 דקות. בסוף הדגירה, להעביר את supernatant לתוך צינור חדש כדי לשמש פלט.עבור טיטריאז' קלט, הכן 10 דילולים טוריים ב- PBS עד פי 10 עד פי תשעה עם פאג' הקלט. מעבירים 10 מיקרוליטרים של פאג' קלט מה-10 ל-7 עד 10 לתשעת הדילולים ל-70 מיקרוליטר של תאי ה-TG1 המוכנים. לאחר 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, צלחת תאי TG1 נגועים על בודדים 90 מילימטר 2YT אגר מנות המכילות 100 מיקרוגרם למיליליטר של אמפיצילין ו 2% גלוקוז עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס.למחרת בבוקר, השתמש בנוסחה כדי לחשב את קלט הפאג'. לזיהום תפוקה וגירוי, מוסיפים את הפאג'ים האלמותיים לשלושה מיליליטר של תאי TG1 עבור דגירה של 45 דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הכינו 10 דילולים סדרתיים של התאים הנגועים במדיום 2YT טרי עד פי 10 לריכוז השלישי, וצלחת כל דילול על 90 מילימטר 2YT אגר מנות עבור הדגירה שלהם לילה ב 37 מעלות צלזיוס.למחרת בבוקר, לחשב את פלט הפאג ' על פי הנוסחה. כדי לבודד שיבוטים בודדים מתת-חיים מועשרים, העבר מושבות בודדות מצלחות התאים TG1 הנגועים בפאג' ל-250 מיקרוליטרים של מדיום 2YT בתוספת אמפיצילין ל הבאר בצלחות סטריליות עמוקות לתרבות הלילה שלהם ב-37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים מגיעים לצפיפות של 600 ננומטר של כ-0.5, מוסיפים פי 5 10 לתשע היחידות יוצרות הפלאק למיליליטר של פאג' עוזר CM13 לכל באר, ודחוסים את התאים במשך 45 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ב-250 סיבובים לדקה.בסוף הדגירה, מוסיפים 500 מיקרוליטרים של מדיום 2YT בתוספת אמפיצילין ו -50 מיקרוגרם למיליליטר של קנאמיצין לכל באר, ומ מניחים את הצלחת על 25 מעלות צלזיוס ו 250 סיבובים לדקה לילה. למחרת בבוקר, מים את התאים על ידי צנטריפוגה כדי לאפשר איסוף של חלקיקי פאג'. כדי לאמת את כריכת העוגן על ידי ELISA, מעיל 96 גם צלחות ELISA עם 100 microliters של חמישה מיקרוגרם למיליליטר סטרפטבידין במאגר ציפוי בארבע מעלות צלזיוס לילה.למחרת בבוקר, לשטוף את הצלחות שלוש פעמים ב 300 microliters של PBS בתוספת Tween לפני הוספת 100 microliters של מטרה biotinylated מיקרומולר אחד ל הבאר היעד ו 100 microliters של ביוטין מיקרומולארי אחד או הומולוג היעד ל בארות הבקרה המתאימות. לאחר שעה בטמפרטורת החדר, שטפו את הצלחות חמש פעמים עם PBS בתוספת Tween לכביסה, וחסמו כל כריכה לא ספציפית עם 300 מיקרוליטרים של 1% קמין ל הבאר למשך שעה בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את הצלחות שלוש פעמים PBS טרי בתוספת Tween לכל לשטוף, ולהוסיף את על טבעי פאג מטוהרים.לאחר שעה בטמפרטורת החדר, לשטוף את הצלחות 10 פעמים עם PBS טרי בתוספת Tween לכל לשטוף. הוסף 100 מיקרוליטרים של פרוקסידס חזרת M13 נוגדן חלבון מעיל גדול לכל באר עבור דגירה של שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לשטוף את הצלחות שלוש פעמים כפי שהודגם, ולהוסיף 100 microliters של מצע TMB לכל באר עבור דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר או עד שינוי צבע גלוי נצפתה.ואז לעצור את התגובה עם 100 microliters של חומצה הידרוכלורית טוחה אחת לגם, ולקרוא את הצלחת ב 450 ננומטר על ספקטרופוטומטר. לאחר אימות קלסר עוגן, הקרנת אוגדן עמעום צריכה להתבצע גם באמצעות אותה ספריית חלבונים המכוונת למתחם קלסר-ליגנד עוגן. תוצאות העשרה אופייניות לאחר ארבעה עד שישה סבבי בחירה הם אינדיקציה טובה לכך שיש יחס גבוה של כניסות פוטנציאליות בתת-קטגוריות, במקרה זה ייתכן שלא יהיה צורך בסבבי בחירה נוספים.ELISA עם שיבוט יחיד מתאים לניתוח הזיקה היחסית לכריכה ולסלקטיביות של קלסרים של עוגן ועמעום ומאפשר השוואה של סלקטיביות מחייבת בין שיבוטים. כמו כן, בחירת קלסר דימריזציה מאפשרת זיהוי של שיבוטים יוצרים הטרודימר עם קלסר העוגן משותק רק עם או בלי ligand. נתונים מחייבים תלויי ריכוז ליגנד אלה מצביעים על כך שננו-bodies שנבדקו מתאימים לבניית מערכת עמעום הנגרמת כימית בהשוואה לכריכה הלקויה שהוכחה על ידי דגימות הבקרה.כמו כן, ניתן להשתמש כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל אנליטי כדי לאשר את היווצרות ההטרודימר בין קלסרים עוגן ודימריזציה בנוכחות הליגנד. לדוגמה, בניסוי זה, שיא עמעום נצפתה כאשר קלסרים עוגן ודימריזציה וקנבידיול היו מעורבים. לעומת זאת, לא זוהה שיא עמעום בהיעדר קנבידיול או כאשר כל קלסר נטען לעמודה בלבד.מערכת עמעום החלבון צריכה להיות מקודדת גנטית בתאי שמרים או יונקים כדי לאפשר אימות נוסף של הביו-סנסורים שנבחרו לפיתוח יישומי vivo. אנו מצפים כי שיטה זו תיתן לחוקרים אחרים את הכלים היעילים וההכרחיים לגילוי מטבוליטים חשובים, מולקולות איתות, או תרופות ב vivo עם רזולוציה מרחבית גבוהה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Inner-קרום חיידקי תצוגה להקרנת ספרייה של שברי נוגדן

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

יעיל אתר ספציפי תיוג נוגדן ידי cycloaddition יזיד-אלקין קדם-Strain

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

מדידת חלבון מחייב F- אקטין על ידי שיתוף שקיעה

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

חלבון הסרט אינפרא-אדום אלקטרוכימיה שהפגינו למחקר של H2 חמצון Hydrogenase [ניפה]

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

זיהוי רגיש מאוד, כמותית של חלבונים ושל שלהם איזופורמים בשיטה התמקדות לגירויי כאב נימי

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

לכידת את האינטראקציה קינטיקה החלבון תעלת יונים עם מולקולות קטנות על ידי וזמינותו אינטרפרומטריה ביו-שכבה

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

חיסונים של האלפקות (לאמה pacos) עם חלבונים אנטיגניים וייצור נוגדנים תחום יחיד אנטיגן ספציפי

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

רגישות גבוהה מדידה של שעתוק הזיקות איגוד מקדם-DNA על ידי טיטור תחרותי באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...