Name: creating highly specific chemically induced protein dimerization systems by stepwise phage selection of a combinatorial single-domain antibody library
Uploaded: 2020-01-14T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library at JoVE

この作品は、ワシントン大学イノベーション賞(L.G.へ)、米国国立衛生研究所(1R35GM128918からL.G.)からの助成金、ワシントン大学のスタートアップファンド(L.G.へ)によって支援されました。H.J.はワシントン研究財団の学部フェローシップの支援を受けています。K.W.はワシントン大学タンパク質デザイン研究所の学部フェローシップに支えられました。

1. 図書館建設
<ol><li>前に説明したように、~1.23~7.14 x 109の多様性を有する合成コンビナトリアル単一ドメイン抗体ライブラリーを使用する。このプロトコルにはライブラリの構築は含まれていませんが、他の組み合わせバインダーライブラリに適用できます。</li>
</ol>2. リガンド標的またはリガンドのビオチニル化
<ol><li>選択されたリガンドをビ?...

<ol>
	<li>Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+proximity+in+biology+and+medicine.">Chemically induced proximity in biology and medicine.</a> Science. 359 (6380), (2018).</li><li>Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+therapeutic+T+cells+through+a+small+molecule-gated+chimeric+receptor.">Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor.</a> Science. 350 (6258), (2015).</li><li>Straathof, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+caspase+9+safety+switch+for+T-cell+therapy.">An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy.</a> Blood. 105 (11), 4247-4254 (2005).</li><li>Di Stasi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+apoptosis+as+a+safety+switch+for+adoptive+cell+therapy.">Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (18), 1673-1683 (2011).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophysical Journal. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li><li>Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circularly+permuted+green+fluorescent+proteins+engineered+to+sense+Ca2+.">Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).</li><li>Hunter, M. M., Margolies, M. N., Ju, A., Haber, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+monoclonal+antibodies+to+the+cardiac+glycoside,+digoxin.">High-affinity monoclonal antibodies to the cardiac glycoside, digoxin.</a> Journal of Immunology. 129 (3), 1165-1172 (1982).</li><li>Bradbury, A. R. M., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+natural+antibodies:+the+power+of+in+vitro+display+technologies.">Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies.</a> Nature Biotechnology. 29 (3), 245-254 (2011).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-affinity+ligand-binding+proteins+by+periplasmic+expression+with+cytometric+screening+(PECS).">Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS).</a> Nature. Biotechnology. 19 (6), 537-542 (2001).</li><li>Tinberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+design+of+ligand-binding+proteins+with+high+affinity+and+selectivity.">Computational design of ligand-binding proteins with high affinity and selectivity.</a> Nature. 501 (7466), 212-216 (2013).</li><li>Spencer, D. M., Wandless, T. J., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+signal+transduction+with+synthetic+ligands.">Controlling signal transduction with synthetic ligands.</a> Science. 262 (5136), 1019-1024 (1993).</li><li>Ho, S. N., Biggar, S. R., Spencer, D. M., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimeric+ligands+define+a+role+for+transcriptional+activation+domains+in+reinitiation.">Dimeric ligands define a role for transcriptional activation domains in reinitiation.</a> Nature. 382 (6594), 822-826 (1996).</li><li>Belshaw, P. J., Ho, S. N., Crabtree, G. R., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+protein+association+and+subcellular+localization+with+a+synthetic+ligand+that+induces+heterodimerization+of+proteins.">Controlling protein association and subcellular localization with a synthetic ligand that induces heterodimerization of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4604-4607 (1996).</li><li>Farrar, M. A., AlberolaIla, J., Perlmutter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-1+kinase+cascade+by+coumermycin-induced+dimerization.">Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.</a> Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).</li><li>Erhart, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Development+of+Intracellular+Protein+Heterodimerizers.">Chemical Development of Intracellular Protein Heterodimerizers.</a> Chemistry &amp; Biology. 20 (4), 549-557 (2013).</li><li>Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+light-induced+protein+dimerization+in+living+cells+using+a+photocaged+dimerizer.">Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer.</a> Nature Communications. 17 (5), 5475 (2014).</li><li>Hill, Z. B., Martinko, A. J., Nguyen, D. P., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antibody-based+chemically+induced+dimerizers+for+cell+therapeutic+applications.">Human antibody-based chemically induced dimerizers for cell therapeutic applications.</a> Nature Chemical Biology. 14 (2), 112-117 (2018).</li><li>Foight, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-input+chemical+control+of+protein+dimerization+for+programming+graded+cellular+responses.">Multi-input chemical control of protein dimerization for programming graded cellular responses.</a> Nature Biotechnology. 37 (10), 1209-1216 (2019).</li><li>Kang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COMBINES-CID:+An+efficient+method+for+de+novo+engineering+of+highly+specific+chemically+induced+protein+dimerization+systems.">COMBINES-CID: An efficient method for de novo engineering of highly specific chemically induced protein dimerization systems.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (28), 10948-10952 (2019).</li><li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies:+natural+single-domain+antibodies.">Nanobodies: natural single-domain antibodies.</a> Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).</li><li>Fanning, S. W., Horn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-hapten+camelid+antibody+reveals+a+cryptic+binding+site+with+significant+energetic+contributions+from+a+nonhypervariable+loop.">An anti-hapten camelid antibody reveals a cryptic binding site with significant energetic contributions from a nonhypervariable loop.</a> Protein Science. 20 (7), 1196-1207 (2011).</li><li>Zavrtanik, U., Luken, J., Loris, R., Lah, J., Hadzi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+epitope+recognition+by+heavy-chain+camelid+antibodies.">Structural basis of epitope recognition by heavy-chain camelid antibodies.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (21), 4369-4386 (2018).</li><li>Denhardt, D. T., Dressler, D., Ray, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Single-Stranded DNA Phages. , 605-625 (1978).</li><li>Virnekas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trinucleotide+phosphoramidites:+ideal+reagents+for+the+synthesis+of+mixed+oligonucleotides+for+random+mutagenesis.">Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis.</a> Nucleic Acids Research. 22 (25), 5600-5607 (1994).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+single-molecule+interaction+profiling+of+DNA-barcoded+proteins.">Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcoded proteins.</a> Nature. 515 (7528), 554-557 (2014).</li></ol>

バイオパンニングの異なるラウンドのための入力ファージライブラリの正しい濃度を選択することが重要です。通常、多様性を持つ ~1012~1013ファージ粒子の入力ライブラリから開始し、各ファージクローンの約 100 ~ 1,000 コピーをプルダウン アッセイで提示できます。結合アッセイ中のファージ濃度が高すぎるか低すぎると、非特異的結合または陽性クローンの喪失の...

CIDシステムは、2つのタンパク質が低分子リガンドの存在下でのみ二量体化する(図1)、代謝、シグナル伝達、および他の生物学的経路1を解剖および操作するための多目的なツールを提供する。彼らは、養子T細胞療法の安全性および有効性を改善するための薬物制御T細胞活性化2およびアポトーシス3、4などの生物学的作動における可能性を実証した。さらに、それらは生体内または低分子標的のインビトロ検出のための新しい方法論を提供する。例えば、CIDタンパク質は、インビボ測定のために蛍光レポーター系(例えば、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)5および円形透過蛍光タンパク質)6と遺伝的に融合することができ、またはサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)様アッセイのアフィニティー試薬として機能する。
幅広い用途にも関わらず、与えられた低分子リガンドで制御できる新しいCIDシステムの作成には大きな課題があります。動物免疫7、invitro選択8、9、および計算タンパク質設計10を含む確立されたタンパク質結合剤工学方法は、バイナリタンパク質リガンド相互作用を介して機能するリガンド結合タンパク質を生成することができる。しかしながら、これらの方法は、リガンド誘発三次CID複合体を作成するのが困難である。いくつかの方法は、同じまたは異なるタンパク質11、12、13、14、15、16に独立して結合する2つのリガンドを化学的に連結することによってCIDを作成するか、または既存の小分子タンパク質複合体17、18を標的とする抗体などの結合剤タンパク質の選択に依存し、したがってリガンドの選択が限られている。
我々は最近、CIDシステム19のデノボエンジニアリングのためのCID(COMBINES-CID)法の選挙をナビゲートするコムバイナリビンデルスを開発しました。この方法は、リガンド誘発二量体化の高い特異性(例えば、アンカー二量体化バインダー解離定数、KD(リガンドなし)/KD(リガンド付き)>1,000)を得ることができる。二量体化特異性は、リガンド結合時に立体構造変化を引き起こす可能性のある柔軟な結合部位を有するアンカーバインダーを使用して達成され、リガンド結合アンカーバインダーのみを認識する立体構造選択的結合剤の選択の基礎を提供する。ナノボディのカンナビジオール(CBD)誘導ヘテロダイマー、ユニバーサル足場と3つの柔軟なCDRループを含むラクダ由来の12〜15kDa機能性抗体断片(図2)20を作成することにより、原理証明を実証した。特に、同じ高品質ライブラリを異なるリガンドに適用できるため、コンビナトリアルタンパク質ライブラリのin vitro選択は、CIDエンジニアリングにとって費用対効果が高く、一般化可能である必要があります。
このプロトコルとビデオでは、CBDをターゲットとして109より高い多様性を持つコンビナトリアル・ナノーネライブラリーをスクリーニングすることにより、アンカー(図3A)と二量体化バインダー(図3B)の2段階のインビトロ選択と検証について説明することに焦点を当てていますが、プロトコルは他のタンパク質ライブラリまたは小分子ターゲットに適用可能である必要があります。CIDバインダーのスクリーニングには通常6~10週間かかります(図4)。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BirA biotin-protein ligase standard reaction kit</td>
			<td>Avidity</td>
			<td>BirA500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7078-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM13 Helper phage</td>
			<td>Antibody Design Labs</td>
			<td>PH020L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3238S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest BglI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 26/10 Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17508701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap-FF-1ml</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>11000458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13 Major Coat Protein Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-53004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>260251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet RED96</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADL-23c Phagemid Vector</td>
			<td>Antibody Design Labs</td>
			<td>PD0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-6000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81260-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum SuperFi DNA Polymerase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12351010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink PCR Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin M13 Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Medium</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>80026-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Plus 384</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Streptavidin (SSA) Biosensors</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18-5057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 increase 10/300 GL Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9909-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15224-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TG1 Electrocompetent Cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60502-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>471283-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP9726-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89882</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creating highly specific chemically induced protein dimerization systems by stepwise phage selection of a combinatorial single-domain antibody library

低分子リガンドの存在下でのみ発生するタンパク質二量体化イベントは、生物学的経路の解剖および操作のための低分子バイオセンサの開発を可能にする。現在、化学的に誘導された二量体化(CID)システムは限られており、特定の低分子リガンドに対して所望の感度と選択性を有する新しいシステムをエンジニアリングすることが、タンパク質工学の分野では依然として課題となっています。ここでは、多種多様なリガンドに適用可能なCIDシステムのデノボエンジニアリングに対する、CID(COMBINES-CID)の高スループットスクリーニング方法について説明します。この方法は、ファージディスプレイされたコンビナトリアルnanobodyライブラリの2段階選択を使用して、最初に目的のリガンドに結合する1)「アンカーバインダー」を取得し、次に2)アンカーバインダー-リガンド複合体にのみ結合する「二量体化バインダー」を得る。アンカーバインダーを選択するには、109以上の相補性決定領域(CDR)ランダム化ナノボディのコンビナトリアルライブラリーをビオチン化リガンドでスクリーニングし、バイオ層干渉法(BLI)によって標識されていないリガンドでヒットを検証する。二量体化バインダーを得るために、nanobodyライブラリは、陽性スクリーニングの標的としてアンカーバインダー-リガンド複合体、および負のスクリーニングのための非結合アンカーバインダーでスクリーニングされる。COMBINES-CIDは、他の免疫グロブリン、非免疫グロブリン、または計算的に設計された足場を持つCID結合剤を選択して、薬物、代謝産物、シグナル伝達分子などのインビトロおよびインビボ検出用のバイオセンサーを作成するために広く適用可能です。

CBDをターゲットとして109より高い多様性を有するコンビナトリアル・ナノーネライブラリーをスクリーニングすることにより、インビトロ選択とアンカーおよび二量体化バインダーの検証を記述する。アンカーおよび二量体化バインダーの両方の選択の連続ラウンド中にファージバイオパンニングの濃縮を評価することが重要である。図 5に示すように、4 ~ 6 ラ...

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Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

任意の与えられた低分子リガンドに対して所望の親和性および特異性を有する化学的に誘導されたタンパク質二量体化システムを作成することは、多くの生物学的センシングおよび作動アプリケーションを有するであろう。ここでは、ファージディスプレイコンビナトリアル単一ドメイン抗体ライブラリーの段階的選択を介した化学的に誘導された二量体化システムのde novoエンジニアリングのための効率的で一般化可能な方法について説明する。

組み合わせ単一ドメイン抗体ライブラリーの段階的ファージ選択による高特異的化学的誘起タンパク質二量体化システムの作成

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

このプロトコルは、さまざまな小分子のバイオセンサーとしてタンパク質二量体化システムをエンジニアリングするための一般的なアプローチを提供するため、重要です。さらに、高度に多様なタンパク質ライブラリーを使用して、特殊な装置を必要とせずに効率的かつ費用対効果の高い方法で、異なるリガンド用のバイオセンサーを選択します。設計されたバイオセンサーは、細胞の挙動を化学的に制御し、細胞代謝産物のリアルタイム変化を監視するために使用することができる。この視覚的なデモンストレーションを通して、研究者は実験出力の明確な期待を持って技術の詳細な指示を観察することができます。摂氏37度で6ミリリットルの2YT培地で単一のTG1エレクトロポレーションコンピテントセルコロニーを成長させ、1分あたり250回転を約0.5の600ナノメートルの吸光度に成長させることで、すべての選択を開始します。最適な光学密度に達したら、細胞を氷の上に置きます。ネガティブセレクションビーズを調製するには、ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズ300マイクロリットルを05%PBSプラストゥイーンバッファの1ミリリットルで3回、磁気分離ラックで1回のPBSを1ミリリットルで2回洗浄します。PBSで1%カゼインの1ミリリットルでビーズを再懸濁し、ビーズの報告された結合能力の5倍でビオチンでビーズを飽和させる。室温で1時間後に回転し、PBSプラストゥイーンでビーズを5回、PBSで3回洗浄します。最後の洗浄後、PBSの13ファージ粒子に約10回10回、PBSの1%の牛血清アルブミンをビーズに加え、室温で1時間の回転を伴うインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに、上清を1.5ミリリットルのチューブに移します。ビオチン化リガン酸結合ストレプトアビジンビーズで正の選択を行う場合、選択したビオチン化リガンドの負の選択に使用されるビーズの量の半分を、マニュアルに従って計算された完全結合容量の5倍で飽和させる。回転で室温で1時間のインキュベーションを行った後、PBSプラスTweenでビーズを5回、PBSだけで3回洗浄し、1%カゼインと1%ウシ血清アルブミンの1ミリリットルでビーズを1時間回転してブロックします。インキュベーションの最後に、ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズをPBSプラストゥイーンで3回洗浄し、PBSだけで1回洗浄し、アンバウンドファージを使用してストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズを再懸濁させます。ビーズを乱すことなく非結合ファージ含有上清を抽出し、入力として使用されるようにサンプルを脇に置きます。次に、PBSとTweenでビーズを10回洗浄し、PBSで5回洗浄し、3回の洗浄ごとにビーズを新しいチューブに移し、結合したファージをチューブ壁に非特異的に結合することを避けます。結合したファージを競争力のある溶出させるために、非ビオチン化リガンドのマイクロモル濃度の450マイクロリットルを正の選択ビーズに加え、ビーズを30分間回転させます。インキュベーションの終わりに、上清を新しいチューブに移して出力として使用します。入力滴定の場合、入力ファージで10倍から9倍までPBSに10個のシリアル希釈液を用意します。10マイクロリットルの入力ファージを1回10~7~10から9個の希釈液から、調製したTG1細胞の70マイクロリットルのアリコートに移す。摂氏37度で45分後、感染したTG1細胞を、アンピシリン1ミリリットル当たり100マイクログラム、摂氏37度で一晩のインキュベートのために2%グルコースを含む個々の90ミリメートル2YT寒天皿にプレートします。翌朝、ファージ入力を計算するために式を使用します。出力感染と滴定のために、溶出したファージを3ミリリットルのTG1細胞に加え、摂氏37度の水浴で45分間インキュベーションします。次に、感染した細胞の10個の連続希釈液を新鮮な2YT培地で3濃度まで10倍まで調製し、摂氏37度で一晩のインキュベーションのために90ミリメートル2YT寒天皿に各希釈物をプレートします。翌朝、式に従ってファージ出力を計算する。濃縮されたサブライブラリから個々のクローンを分離するには、一晩培養されたファージに感染したTG1細胞プレートから、37°Cの一晩培養のために無菌深井戸プレートでアンピシリンを250マイクロリットルの2YT培地に移します。細胞が約0.5の600ナノメートル密度に達したら、各ウェルにCM13ヘルパーファージのミリリットル当たり9回のプラーク形成単位に5倍10を加え、毎分250回転で摂氏37度で45分間細胞をインキュベートします。インキュベーションの最後に、アンピシリンを添加した2YT培地500マイクロリットルを各ウェルに加え、1ミリリットルのカナマイシンを各ウェルに加え、プレートを摂氏25度、毎分250回転に置きます。翌朝、遠心分離により細胞を沈下し、ファージ粒子の採取を可能にする。ELISAによるアンカー結合を検証するには、96ウェルELISAプレートをコーティングバッファーに1ミリリットル当たり5マイクログラムの100マイクロリットルを一晩で4°Cでコーティングします。翌朝、PBSとトゥイーンの300マイクロリットルでプレートを3回洗浄してから、1マイクロモルビニチン化ターゲットの100マイクロリットルを標的井戸に、1マイクロモルビオチンまたはターゲットホモログの100マイクロリットルを適切な制御ウェルに追加します。室温で1時間後、PBSとTweenで5回洗浄し、室温で1時間、1ウェルあたり300マイクロリットルの1%カゼインで非特異的結合をブロックします。インキュベーションの終わりに、新鮮なPBSと洗い込みごとにトゥイーンでプレートを3回洗い、精製したファージ上清を加えます。室温で1時間後、新鮮なPBSと1回の洗浄でプレートを10回洗います。100マイクロリットルの西洋ワサビペルオキシダーゼM13主要コートタンパク質抗体を各ウェルに加え、室温で1時間のインキュベーションを行います。次に、実例のようにプレートを3回洗浄し、室温で10分間のインキュベーションを行うか、目に見える色の変化が観察されるまで、各ウェルにTMB基板100マイクロリットルを加えます。その後、ウェルあたり1モル塩酸100マイクロリットルで反応を停止し、分光光度計で450ナノメートルのプレートを読み取ります。アンカーバインダーの検証後、二量体結合体スクリーニングは、アンカーバインダーリガンド複合体を標的とする同じタンパク質ライブラリーを用いて行う必要があります。選択の4〜6ラウンド後の典型的な濃縮結果は、サブライブラリ内の潜在的ヒット率が高いことを示す良い指標であり、その場合、さらに選択のラウンドが必要ない場合があります。シングルクローンELISAは、アンカーおよび二量体結合剤の相対的結合親和性および選択性を分析するのに適しており、クローン間の結合選択性の比較を容易にする。同様に、二量体結合剤選択は、リガンドの有無にかかわらず固定化されたアンカーバインダーを使用してヘテロダイマーを形成するクローンの同定を可能にする。これらのリガンド濃度依存的結合データは、試験されたナノボディが、対照試料によって示された不十分な結合と比較して化学的に誘導された二量体化システムを構築するのに適していることを示唆している。また、分析的サイズ排除クロマトグラフィーは、リガンドの存在下でアンカーと二量体結合剤との間のヘテロ二量体形成を確認するために使用することができる。例えば、この実験では、アンカーと二量体化バインダーとカンナビジオールを混合した場合に二量体化ピークが観察された。対照的に、カンナビジオールの不在時または各バインダーがカラムだけにロードされたとき、二量体化ピークは検出されなかった。タンパク質二量体化システムは、インビボアプリケーションを開発するための選択されたバイオセンサーのさらなる検証を可能にするために、酵母または哺乳類細胞で遺伝的にコードされるべきである。この方法は、他の研究者に、重要な代謝産物、シグナル伝達分子、または高い時空間分解能を持つ生体内の薬物を検出するための効果的かつ必要なツールを提供することを期待する。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

抗体フラグメントのライブラリーをスクリーニングするための細菌インナー膜を表示

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

ひずみ促進アジド - アルキン環付加することにより、効率的で部位特異的抗体ラベリング

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

共沈降によるF-アクチンへのタンパク質結合の測定

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

タンパク質フィルム赤外線電気化学 [NiFe] ヒドロゲナーゼによって H2酸化反応に関する研究の実証

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

タンパク質キャピラリー等電点焦点法によるアイソ フォームの高感度・定量的検出

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

バイオ層干渉法による小分子とイオン チャネル蛋白質の相互作用の動力学をキャプチャ

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

アルパカ (ラーマ pacos) 蛋白質の抗原と抗原特異的単一ドメイン抗体産生の予防接種

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

蛍光顕微鏡を使用して競争力のある滴定による転写因子の DNA 結合親和性の高感度測定

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

タンパク質の折り畳み、トランスポート、および放射性パルス追跡による生体細胞の劣化の解析

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...