Name: creating highly specific chemically induced protein dimerization systems by stepwise phage selection of a combinatorial single-domain antibody library
Uploaded: 2020-01-14T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library at JoVE

이 작품은 워싱턴 대학 혁신 상 (L.G.), 미국 국립 보건원 (1R35GM128918에서 L.G.에) 및 워싱턴 대학의 스타트업 기금 (L.G.)의 보조금에 의해 지원되었습니다. H.J.는 워싱턴 연구 재단 학부 펠로우십의 지원을 받았습니다. K.W.는 워싱턴 대학 단백질 디자인 연구소의 학부 펠로우십을 지원받았습니다.

1. 도서관 건설
<ol><li>앞서설명한 바와같이 ~ 1.23-7.14 x 109의다양성을 가진 합성 결합 단일 도메인 항체 라이브러리를 사용한다. 이 프로토콜에는 라이브러리 구성이 포함되지 않지만 다른 조합 바인더 라이브러리에 적용할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 리간드 대상 또는 리간드의 생체 동화
<ol><li>선택된 리간드, 예를 들어, CBD 및 테트라하이드로칸나비놀(TH...

<ol>
	<li>Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+proximity+in+biology+and+medicine.">Chemically induced proximity in biology and medicine.</a> Science. 359 (6380), (2018).</li><li>Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+therapeutic+T+cells+through+a+small+molecule-gated+chimeric+receptor.">Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor.</a> Science. 350 (6258), (2015).</li><li>Straathof, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+caspase+9+safety+switch+for+T-cell+therapy.">An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy.</a> Blood. 105 (11), 4247-4254 (2005).</li><li>Di Stasi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+apoptosis+as+a+safety+switch+for+adoptive+cell+therapy.">Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (18), 1673-1683 (2011).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophysical Journal. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li><li>Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circularly+permuted+green+fluorescent+proteins+engineered+to+sense+Ca2+.">Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).</li><li>Hunter, M. M., Margolies, M. N., Ju, A., Haber, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+monoclonal+antibodies+to+the+cardiac+glycoside,+digoxin.">High-affinity monoclonal antibodies to the cardiac glycoside, digoxin.</a> Journal of Immunology. 129 (3), 1165-1172 (1982).</li><li>Bradbury, A. R. M., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+natural+antibodies:+the+power+of+in+vitro+display+technologies.">Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies.</a> Nature Biotechnology. 29 (3), 245-254 (2011).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-affinity+ligand-binding+proteins+by+periplasmic+expression+with+cytometric+screening+(PECS).">Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS).</a> Nature. Biotechnology. 19 (6), 537-542 (2001).</li><li>Tinberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+design+of+ligand-binding+proteins+with+high+affinity+and+selectivity.">Computational design of ligand-binding proteins with high affinity and selectivity.</a> Nature. 501 (7466), 212-216 (2013).</li><li>Spencer, D. M., Wandless, T. J., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+signal+transduction+with+synthetic+ligands.">Controlling signal transduction with synthetic ligands.</a> Science. 262 (5136), 1019-1024 (1993).</li><li>Ho, S. N., Biggar, S. R., Spencer, D. M., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimeric+ligands+define+a+role+for+transcriptional+activation+domains+in+reinitiation.">Dimeric ligands define a role for transcriptional activation domains in reinitiation.</a> Nature. 382 (6594), 822-826 (1996).</li><li>Belshaw, P. J., Ho, S. N., Crabtree, G. R., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+protein+association+and+subcellular+localization+with+a+synthetic+ligand+that+induces+heterodimerization+of+proteins.">Controlling protein association and subcellular localization with a synthetic ligand that induces heterodimerization of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4604-4607 (1996).</li><li>Farrar, M. A., AlberolaIla, J., Perlmutter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-1+kinase+cascade+by+coumermycin-induced+dimerization.">Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.</a> Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).</li><li>Erhart, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Development+of+Intracellular+Protein+Heterodimerizers.">Chemical Development of Intracellular Protein Heterodimerizers.</a> Chemistry &amp; Biology. 20 (4), 549-557 (2013).</li><li>Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+light-induced+protein+dimerization+in+living+cells+using+a+photocaged+dimerizer.">Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer.</a> Nature Communications. 17 (5), 5475 (2014).</li><li>Hill, Z. B., Martinko, A. J., Nguyen, D. P., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antibody-based+chemically+induced+dimerizers+for+cell+therapeutic+applications.">Human antibody-based chemically induced dimerizers for cell therapeutic applications.</a> Nature Chemical Biology. 14 (2), 112-117 (2018).</li><li>Foight, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-input+chemical+control+of+protein+dimerization+for+programming+graded+cellular+responses.">Multi-input chemical control of protein dimerization for programming graded cellular responses.</a> Nature Biotechnology. 37 (10), 1209-1216 (2019).</li><li>Kang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COMBINES-CID:+An+efficient+method+for+de+novo+engineering+of+highly+specific+chemically+induced+protein+dimerization+systems.">COMBINES-CID: An efficient method for de novo engineering of highly specific chemically induced protein dimerization systems.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (28), 10948-10952 (2019).</li><li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies:+natural+single-domain+antibodies.">Nanobodies: natural single-domain antibodies.</a> Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).</li><li>Fanning, S. W., Horn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-hapten+camelid+antibody+reveals+a+cryptic+binding+site+with+significant+energetic+contributions+from+a+nonhypervariable+loop.">An anti-hapten camelid antibody reveals a cryptic binding site with significant energetic contributions from a nonhypervariable loop.</a> Protein Science. 20 (7), 1196-1207 (2011).</li><li>Zavrtanik, U., Luken, J., Loris, R., Lah, J., Hadzi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+epitope+recognition+by+heavy-chain+camelid+antibodies.">Structural basis of epitope recognition by heavy-chain camelid antibodies.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (21), 4369-4386 (2018).</li><li>Denhardt, D. T., Dressler, D., Ray, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Single-Stranded DNA Phages. , 605-625 (1978).</li><li>Virnekas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trinucleotide+phosphoramidites:+ideal+reagents+for+the+synthesis+of+mixed+oligonucleotides+for+random+mutagenesis.">Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis.</a> Nucleic Acids Research. 22 (25), 5600-5607 (1994).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+single-molecule+interaction+profiling+of+DNA-barcoded+proteins.">Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcoded proteins.</a> Nature. 515 (7528), 554-557 (2014).</li></ol>

다양한 바이오패닝 라운드에 대해 입력 파지 라이브러리의 정확한 농도를 선택하는 것이 중요합니다. 우리는 일반적으로 ~1012-1013 파지 입자의 입력 라이브러리에서 시작 다양성 >109,각 파지 클론의 ~ 100-1,000 사본을 풀 다운 분석에 제시 할 수 있도록. 결합 분석에서 파지 농도가 너무 높거나 낮으면 비특이적 결합 또는 양성 클론의 손실 가능성이 증가합니다. 앵커 또는 이...

CID 시스템은 두 단백질이 소분자 리간드의 존재 에서만 이화(그림 1)를분석하고 신진 대사, 신호 화 및 기타 생물학적 경로를 조작하기위한 다양한 도구를 제공합니다1. 이들은 약물 조절 T 세포 활성화2 및 세포사멸3,4,입양 T 세포 치료의 안전성 및 효능을 향상시키기 위한 생물학적 작용의 잠재력을 입증하였다. 추가적으로, 그(것)들은 작은 분자 표적의 생체내 또는 생체외 탐지를 위한 새로운 방법론을 제공합니다. 예를 들어, CID 단백질은 형광 리포터 시스템(예를 들어, 형광 공명 에너지 전달(FRET)5 및 원형 투과형 형광 단백질6과 유전적으로 융합될 수 있으며, 생체 내 실시간 측정을 위해, 또는 샌드위치 효소 연계 면역소자 분석(ELISA)에 대한 친화성 시약으로서 작용할 수 있다.
광범위한 응용 분야에도 불구하고 주어진 소분자 리간드에 의해 제어될 수 있는 새로운 CID 시스템을 만드는 것은 큰 과제입니다. 동물 면역7,시험관 내 선택8,9및전산 단백질설계(10)를 포함한 확립된 단백질 바인더 엔지니어링 방법은 이진 단백질-리간드 상호작용을 통해 기능하는 리간드 결합 단백질을 생성할 수 있다. 그러나, 이들 방법은 리간드-유도 삼차 CID 복합체를 만드는 데 어려움이 있다. 일부 방법은 동일하거나 상이한단백질11,12,13,14,15, 16에 독립적으로 결합하는 2개의 리간드를 화학적으로 연결함으로써 CID를 생성하거나 기존의 소분자 단백질 복합체를 표적화하는 항체와 같은 바인더 단백질을 선택에 의존하여17,18,따라서 리간드의 제한된 선택을 갖는다.
우리는 최근 CID 시스템19의드 노보 엔지니어링을위한 CID (COMBINES-CID) 방법의 combinatorial 빈ders-e nabled s선거를 개발했다. 이 방법은 리간드-유도 이량화의 높은 특이성을 얻을 수 있다(예를 들어, 앵커-이량화 바인더 해리 상수, K D(리간드 제외)/KD(리간드)> 1,000). 이분 특이성은 리간드 결합 시 형태 변화를 유발할 수 있는 유연한 결합 부위가 있는 앵커 바인더를 사용하여 달성되며, 리간드 결합 앵커 바인더만인식하는 형태선택적 바인더의 선택을 위한 기초를 제공한다. 우리는 나노체의 칸 나비 디올 (CBD)-유도 이종, 보편적 인 스캐폴드와 세 개의 유연한 CDR 루프(그림 2)20을포함하는 카멜리드에서 12-15 kDa 기능성 항체 단편을 생성함으로써 원리 증명을 입증했으며, 이는 소분자 에피토페21,22에대한 적응 가능한 크기의 결합 포켓을 형성할 수 있다. 특히, 결합 단백질 라이브러리의 시험관 내 선택은 동일한 고품질 라이브러리가 상이한 리간드에 적용될 수 있기 때문에 CID 엔지니어링에 대해 비용 효율적이고 일반화되어야 합니다.
이 프로토콜 및 비디오에서, 우리는 앵커의 2단계 체외 선택 및검증(그림 3A)및 이량화 바인더(그림3B)를CBD를 대상으로109보다 높은 다양성을 가진 조합나노라이브러리를 스크리닝함으로써 설명에 초점을 맞추고 있으나, 프로토콜은 다른 단백질 라이브러리 또는 소분자 표적에 적용되어야 한다. CID 바인더의 스크리닝은 일반적으로 6-10 주가 걸립니다(그림 4).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BirA biotin-protein ligase standard reaction kit</td>
			<td>Avidity</td>
			<td>BirA500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7078-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM13 Helper phage</td>
			<td>Antibody Design Labs</td>
			<td>PH020L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3238S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest BglI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 26/10 Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17508701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap-FF-1ml</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>11000458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13 Major Coat Protein Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-53004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>260251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet RED96</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADL-23c Phagemid Vector</td>
			<td>Antibody Design Labs</td>
			<td>PD0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-6000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81260-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum SuperFi DNA Polymerase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12351010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink PCR Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin M13 Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Medium</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>80026-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Plus 384</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Streptavidin (SSA) Biosensors</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18-5057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 increase 10/300 GL Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9909-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15224-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TG1 Electrocompetent Cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60502-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>471283-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP9726-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89882</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creating highly specific chemically induced protein dimerization systems by stepwise phage selection of a combinatorial single-domain antibody library

작은 분자 리간드의 존재에서만 발생하는 단백질 이분화 이벤트는 생물학적 경로의 해부 및 조작을 위한 소분자 바이오 센서의 개발을 가능하게 합니다. 현재, 제한된 수의 화학적으로 유도된 이량화(CID) 시스템이 존재하며 특정 소분자 리간드에 대한 원하는 감도 및 선택성을 갖춘 새로운 시스템을 엔지니어링하는 것은 단백질 공학 분야에서 여전히 과제로 남아 있습니다. 우리는 여기에 리간드의 큰 다양성에 적용 CID 시스템의 de novo 엔지니어링에 대한 높은 처리량 스크리닝 방법, combinatorial 빈ders-e nabledCID (COMBINES-CID)의 선거를 설명합니다. 이 방법은 파지 디스플레이 조합 nanobody 라이브러리의 2단계 선택을 사용하여 1) 관심 있는 리간드에 먼저 결합하는 "앵커 바인더"를 얻은 다음 2) 앵커 바인더-리간드 복합체에만 결합하는 "이각 바인더"를 얻습니다. 앵커 바인더를 선택하기 위해,109개 이상의 상보성 결정 영역(CDR)-무작위 나노체의 조합 라이브러리가 생체 티니글리드 리간드로 스크리닝되고 적중은 바이오 층 간섭측정(BLI)에 의해 표지되지 않은 리간드로 검증됩니다. 이광 바인더를 얻기 위해, nanobody 라이브러리는 포지티브 스크리닝을 위한 표적으로서 앵커 바인더-리간드 복합체로 스크리닝되고, 음의 스크리닝을 위한 언바운드 앵커 바인더를 갖는다. COMBINES-CID는 다른 면역 글로불린, 비면역글로불린 또는 전산으로 설계된 스캐폴드와 함께 선택한 CID 바인더에 광범위하게 적용되어 약물, 대사 산물, 신호 분자 등의 생체 내 및 생체 내 검출을 위한 바이오 센서를 생성합니다.

우리는 CBD를 대상으로 109 보다 높은 다양성을 가진 조합 nanobody 라이브러리를 선별하여 앵커 및 이량화 바인더의 2 단계 체외 선택 및 검증을 설명합니다. 앵커 및 이광 바인더 모두에 대한 연속적인 선택 라운드 동안 파지 바이오패닝의 농축을 평가하는 것이 중요하다. 그림 5와 같이 4~6라운드 선택 후의 일반적인 보강 결과는 서브라이브러리에서 잠재적인 적중률이...

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Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

임의의 주어진 소분자 리간드에 대해 원하는 친화성 및 특이성을 가진 화학적으로 유도된 단백질 이분화 시스템을 만드는 것은 많은 생물학적 감지 및 작동 응용을 가질 것이다. 여기서, 우리는 파지 디스플레이 조합 단일 도메인 항체 라이브러리의 단계적 선택을 통해 화학적으로 유도된 이량화 시스템의 de novo 엔지니어링을 위한 효율적이고 일반화 가능한 방법을 설명한다.

결합 단일 도메인 항체 라이브러리의 단계별 파지 선택에 의해 고도로 특이적 화학적으로 유도된 단백질 이분화 시스템 생성

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

이 프로토콜은 다양한 소분자에 대한 바이오 센서로서 단백질 이량화 시스템을 엔지니어링하는 일반적인 접근 방식을 제공하기 때문에 중요합니다. 또한, 매우 다양한 단백질 라이브러리를 사용하여 특수 장비 없이 효율적이고 비용 효율적인 방식으로 다양한 리간드용 바이오 센서를 선택합니다. 엔지니어링 된 바이오 센서는 세포 거동을 화학적으로 제어하고 세포 대사 산물의 실시간 변화를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.이 시각적 데모를 통해 연구자들은 실험 출력에 대한 명확한 기대와 함께 기술의 상세한 지시를 관찰 할 수 있습니다. 37°C에서 2YT 배지의 6밀리리터에서 단일 TG1 전기포이션 유능한 세포 식민지를 성장시켜 매 라운드마다 시작하여 분당 250개의 회전을 약 0.5의 600나노미터 흡수로 시작한다. 최적의 광학 밀도에 도달하면 세포를 얼음 위에 놓습니다.음의 선택 구슬을 준비하려면, 300 마이크로리터의 스트렙타비딘 코팅 마그네틱 비즈를 05%PBS+ Tween 버퍼 1밀리리터로 세 번, 2회는 자기 분리 랙에 세척당 PBS 1밀리리터로 세척합니다. PBS에서 1밀리리터1%의 카제인으로 구슬을 재차 질주하고 비틴으로 구슬을 비슬의 5배에 달하는 비드를 포화시한다. 실온에서 1시간 후, PBS 플러스 트위엔으로 구슬을 5회, PBS로 3회 세척합니다.마지막 세척 후, 13개의 파지 입자에 약 10배, PBS에 1%소 세럼 알부민을 1시간 동안 구슬에 넣고 회전시 실온에서 1시간 동안 배양한다. 인큐베이션이 끝나면 상체관을 1.5밀리리터 튜브로 옮기십시오. 바이오티니드 리간드 바운드 스트렙타비딘 구슬을 사용한 긍정적인 선택을 위해, 수동에 따라 계산된 전체 결합 용량의 5배에 달하는 선택된 생체작 리간드에서 음의 선택에 사용되는 구슬의 부피의 절반을 포화시켰다.실온에서 1시간 동안 배양한 후 PBS+ 트위엔으로 5회, PBS를 단독으로 3회 세척하고, 1밀리리터 1밀리리터, 1%소 세럼 알부민으로 1시간 동안 구슬을 회전시 1시간 동안 차단한다. 인큐베이션이 끝나면 PBS 플러스 트위엔에서 3회, PBS에서 단독으로 1회, 비바운드 파지를 사용하여 스트렙타비딘 코팅 마그네틱 비즈를 재차 리펜합니다. 구슬을 방해하지 않고 언바운드 파지 함유 슈퍼나탄을 추출하고 샘플을 입력으로 사용할 수 있도록 따로 설정합니다.그런 다음 PBS 플러스 트위엔으로 구슬을 10회 세척하고 PBS로 5회 세척하여 3회 세척 후 구슬을 새로운 튜브로 전송하여 경계 파지의 비특이적 결합을 피하기 위해 튜브 벽으로 옮겨냅니다. 바운드 파지를 경쟁적으로 단정하기 위해 비생체화 리간드의 마이크로몰라 농도 450마이크로리터를 양성 선택 구슬에 추가하고 구슬을 30분 동안 회전시 놓습니다. 인큐베이션이 끝나면 상체를 출력으로 사용할 새 튜브로 옮습니다.입력 적정의 경우 입력 파지로 10회까지 PBS에서 10개의 직렬 희석제를 10회 까지 준비합니다. 10 마이크로리터의 입력 파지 10을 1회에서 7-10으로 7-10으로 9개의 희석제에서 70 마이크로리터 알리쿼트로 전송하여 제조된 TG1 세포의 70 마이크로리터 알리쿼트로 옮긴다. 섭씨 37도에서 45분 후, 감염된 TG1 세포를 암피실린 밀리리터당 100마이크로그램, 섭씨 37도에서 하룻밤 잠복시 2%의 포도당을 함유한 개별 90mm 2YT 한천 요리에 접시를 놓습니다.다음 아침, 식기를 사용하여 파지 입력을 계산합니다. 출력 감염 및 적정의 경우 37도 섭씨 수조에서 45분 간 배양하기 위해 TG1 세포의 3밀리리터에 용출된 파지를 추가합니다. 그런 다음 감염된 세포의 10개의 직렬 희석을 신선한 2YT 배지에서 10배에서 3농도까지 1회까지 준비하고, 37°C에서 1박 배양용 90mm 2YT 천지 접시에 각 희석을 플레이트한다.다음 아침, 수식에 따라 파지 출력을 계산합니다. 농축 된 서브 라이브러리에서 개별 클론을 분리하기 위해, 하룻밤 배양, 파지 감염 TG1 세포 판에서 단일 콜로니를 2YT 배지의 250 마이크로 리터로 전송하여 멸균 심층 플레이트당 37도에서 멸균 된 심연 플레이트로 보충합니다. 세포가 약 0.5의 600 나노미터 밀도에 도달하면 CM13 도우미 파지의 밀리리터 당 9개의 플라크 형성 유닛에 5배 10을 추가하고 분당 250회전에서 섭씨 37도에서 45분 동안 세포를 배양한다.인큐베이션이 끝나면 암피실린으로 보충된 2YT 배지 500마이크로리터와 카나마이신 밀리리터당 50마이크로그램을 각 웰에 추가하고, 플레이트를 하룻밤 사이에 섭씨 25도, 분당 250회 회전에 배치합니다. 다음 아침, 파지 입자의 수집을 허용하기 위해 원심 분리에 의해 세포를 퇴적. ELISA에 의해 바인딩앵커 바인딩을 확인하려면, 코팅 버퍼에서 밀리리터 스트렙타비딘 당 5 마이크로 그램의 100 마이크로 리터와 96 잘 ELISA 플레이트를 코팅 하룻밤 섭씨 4섭씨.다음 날 아침, PBS 플러스 트위엔의 300마이크로리터에서 플레이트를 세 번 세척한 후 1마이크로몰라 바이오티너 100마이크로리터를 대상 우물에 추가하고 1마이크로몰라 비오틴 또는 표적 형모로그를 적절한 대조유에 첨가한다. 실온에서 1시간 후, PBS와 워시당 Tween으로 플레이트를 5회 세척하고 실온에서 1시간 동안 웰당 1%카제인 300마이크로리터로 비특이적 결합을 차단합니다. 인큐베이션이 끝나면, 세척당 신선한 PBS 플러스 트웬으로 플레이트를 세 번 씻고 정제 된 파지 상수체를 추가합니다.실온에서 1 시간 후, 신선한 PBS 플러스 워시 당 Tween로 접시를 10 번 세척하십시오. 100 마이크로리터의 고추냉이 과록시다제 M13 주요 코트 단백질 항체를 각 웰에 넣고 실온에서 1시간 배양에 대고 있습니다. 그런 다음 입증된 대로 플레이트를 세 번 세척하고 실온에서 또는 눈에 보이는 색 변화가 관찰될 때까지 10분 간 각 웰에 100마이크로리터의 TMB 기판을 추가합니다.그런 다음 100 마이크로리터의 1-mm-염산으로 반응을 멈추고 분광계에서 450 나노미터에서 플레이트를 읽습니다. 앵커 바인더 검증 후, 앵커 바인더-리간드 복합체를 대상으로 동일한 단백질 라이브러리를 사용하여 이머제이징 바인더 스크리닝을 수행해야 한다. 4~6라운드 선발 후 의전한 보강 결과는 하위 라이브러리에서 잠재적 타격 비율이 높다는 것을 나타내는 좋은 지표이며, 이 경우 추가 선발 라운드가 필요하지 않을 수 있습니다.단일 클론 ELISA는 앵커 및 이머제이싱 바인더의 상대적 결합 친화성 및 선택성을 분석하는 데 적합하며 클론 간의 결합 선택도 비교를 용이하게 합니다. 마찬가지로, 이질형 바인더 선택은 리간드 유무에 관계없이 고정된 앵커 바인더로 이성구를 형성하는 클론을 식별할 수 있게 한다. 이러한 리간드 농도 의존형 결합 데이터는 테스트된 나노체가 대조군 샘플에 의해 입증된 불량 한 결합에 비해 화학적으로 유도된 이질 시스템을 구성하는 데 적합하다는 것을 시사한다.또한, 분석 크기 배제 크로마토그래피는 리간드의 존재시 앵커와 이질화 바인더 사이의 이성구형성을 확인하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 실험에서는 앵커와 이압 바인더 및 칸나비디올이 혼합되었을 때 이머제이화 피크가 관찰되었다. 반면 칸나비디올이 없거나 각 바인더가 컬럼에만 로드되었을 때 이산화 피크가 감지되지 않았습니다.단백질 이량제 시스템은 생체 내 응용 분야에서 개발하기 위한 선택된 바이오 센서의 추가 검증을 허용하기 위해 효모 또는 포유류 세포에서 유전적으로 인코딩되어야 한다. 우리는 이 방법이 다른 연구자에게 중요한 대사 산물, 신호 분자 또는 높은 현면적 해결을 가진 생체 내의 약물을 검출하는 데 효과적이고 필요한 도구를 제공할 것으로 기대합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

항체 단편의 라이브러리를 스크리닝에 대한 세균 내부 멤브레인 디스플레이

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

연구

생화학

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

효율적이고 사이트 별 스트레인 승진 아 지드 - 알킨 사이클로에 의해 항체 라벨링

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

공동 침강에 의한 F-actin에 대한 단백질 결합 측정

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

단백질 영화 적외선 전기 화학 [NiFe] Hydrogenase에 의해 H2 산화의 연구에 대 한 설명

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

단백질 및 모 세관 전자 초점 방법으로 그들의 Isoforms의 매우 민감하고 정량적 검출

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

바이오-레이어 간섭계 분석 결과 의해 작은 분자와 이온 채널 단백질의 상호 작용 활동을 캡처

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Alpacas (라마 pacos) 단백질 항 원 및 항 원 특정 단일 도메인 항 체의 생산의 면역

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

경쟁 적정 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 녹음 방송 요인 DNA 바인딩 선호도의 높은 감도 측정

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

단백질 폴딩, 전송, 및 방사성 펄스 체이스 하 여 살아있는 세포의 저하의 분석

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...