Name: creating highly specific chemically induced protein dimerization systems by stepwise phage selection of a combinatorial single-domain antibody library
Uploaded: 2020-01-14T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library at JoVE

Эта работа была поддержана Университетом Вашингтона Инновационная премия (Л.Г.), грант от Национальных институтов здравоохранения США (1R35GM128918 в L.G.), и стартап-фонд Университета Вашингтона (в L.G.). H.J. была поддержана стипендией Вашингтонского исследовательского фонда. KW была поддержана стипендией бакалавриата из Вашингтонского университета Института белкового дизайна.

1. Строительство библиотеки
<ol><li>Используйте синтетические комбинаторные однодоменных антител библиотеки с разнообразием 1,23-7,14 х 109, как ранее описано19. Хотя этот протокол не включает в себя строительство библиотеки, он может быть применен к другим комбинированных ?...

<ol>
	<li>Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+proximity+in+biology+and+medicine.">Chemically induced proximity in biology and medicine.</a> Science. 359 (6380), (2018).</li><li>Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+therapeutic+T+cells+through+a+small+molecule-gated+chimeric+receptor.">Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor.</a> Science. 350 (6258), (2015).</li><li>Straathof, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+caspase+9+safety+switch+for+T-cell+therapy.">An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy.</a> Blood. 105 (11), 4247-4254 (2005).</li><li>Di Stasi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+apoptosis+as+a+safety+switch+for+adoptive+cell+therapy.">Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (18), 1673-1683 (2011).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophysical Journal. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li><li>Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circularly+permuted+green+fluorescent+proteins+engineered+to+sense+Ca2+.">Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).</li><li>Hunter, M. M., Margolies, M. N., Ju, A., Haber, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+monoclonal+antibodies+to+the+cardiac+glycoside,+digoxin.">High-affinity monoclonal antibodies to the cardiac glycoside, digoxin.</a> Journal of Immunology. 129 (3), 1165-1172 (1982).</li><li>Bradbury, A. R. M., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+natural+antibodies:+the+power+of+in+vitro+display+technologies.">Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies.</a> Nature Biotechnology. 29 (3), 245-254 (2011).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-affinity+ligand-binding+proteins+by+periplasmic+expression+with+cytometric+screening+(PECS).">Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS).</a> Nature. Biotechnology. 19 (6), 537-542 (2001).</li><li>Tinberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+design+of+ligand-binding+proteins+with+high+affinity+and+selectivity.">Computational design of ligand-binding proteins with high affinity and selectivity.</a> Nature. 501 (7466), 212-216 (2013).</li><li>Spencer, D. M., Wandless, T. J., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+signal+transduction+with+synthetic+ligands.">Controlling signal transduction with synthetic ligands.</a> Science. 262 (5136), 1019-1024 (1993).</li><li>Ho, S. N., Biggar, S. R., Spencer, D. M., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimeric+ligands+define+a+role+for+transcriptional+activation+domains+in+reinitiation.">Dimeric ligands define a role for transcriptional activation domains in reinitiation.</a> Nature. 382 (6594), 822-826 (1996).</li><li>Belshaw, P. J., Ho, S. N., Crabtree, G. R., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+protein+association+and+subcellular+localization+with+a+synthetic+ligand+that+induces+heterodimerization+of+proteins.">Controlling protein association and subcellular localization with a synthetic ligand that induces heterodimerization of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4604-4607 (1996).</li><li>Farrar, M. A., AlberolaIla, J., Perlmutter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-1+kinase+cascade+by+coumermycin-induced+dimerization.">Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.</a> Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).</li><li>Erhart, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Development+of+Intracellular+Protein+Heterodimerizers.">Chemical Development of Intracellular Protein Heterodimerizers.</a> Chemistry &amp; Biology. 20 (4), 549-557 (2013).</li><li>Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+light-induced+protein+dimerization+in+living+cells+using+a+photocaged+dimerizer.">Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer.</a> Nature Communications. 17 (5), 5475 (2014).</li><li>Hill, Z. B., Martinko, A. J., Nguyen, D. P., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antibody-based+chemically+induced+dimerizers+for+cell+therapeutic+applications.">Human antibody-based chemically induced dimerizers for cell therapeutic applications.</a> Nature Chemical Biology. 14 (2), 112-117 (2018).</li><li>Foight, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-input+chemical+control+of+protein+dimerization+for+programming+graded+cellular+responses.">Multi-input chemical control of protein dimerization for programming graded cellular responses.</a> Nature Biotechnology. 37 (10), 1209-1216 (2019).</li><li>Kang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COMBINES-CID:+An+efficient+method+for+de+novo+engineering+of+highly+specific+chemically+induced+protein+dimerization+systems.">COMBINES-CID: An efficient method for de novo engineering of highly specific chemically induced protein dimerization systems.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (28), 10948-10952 (2019).</li><li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies:+natural+single-domain+antibodies.">Nanobodies: natural single-domain antibodies.</a> Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).</li><li>Fanning, S. W., Horn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-hapten+camelid+antibody+reveals+a+cryptic+binding+site+with+significant+energetic+contributions+from+a+nonhypervariable+loop.">An anti-hapten camelid antibody reveals a cryptic binding site with significant energetic contributions from a nonhypervariable loop.</a> Protein Science. 20 (7), 1196-1207 (2011).</li><li>Zavrtanik, U., Luken, J., Loris, R., Lah, J., Hadzi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+epitope+recognition+by+heavy-chain+camelid+antibodies.">Structural basis of epitope recognition by heavy-chain camelid antibodies.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (21), 4369-4386 (2018).</li><li>Denhardt, D. T., Dressler, D., Ray, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Single-Stranded DNA Phages. , 605-625 (1978).</li><li>Virnekas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trinucleotide+phosphoramidites:+ideal+reagents+for+the+synthesis+of+mixed+oligonucleotides+for+random+mutagenesis.">Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis.</a> Nucleic Acids Research. 22 (25), 5600-5607 (1994).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+single-molecule+interaction+profiling+of+DNA-barcoded+proteins.">Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcoded proteins.</a> Nature. 515 (7528), 554-557 (2014).</li></ol>

Очень важно выбрать правильные концентрации входных фаговых библиотек для различных раундов биопанирования. Как правило, мы начинали с входной библиотеки в 1012-1013 фаговых частиц с разнообразием no109, что позволяет 100-1000 копий каждого фагового клона, которые будут предст...

СИСТЕМы CID, в которых два белка димеризируются только в присутствии маломолекулярного лиганда(рисунок 1), предлагают универсальные инструменты для вскрытия и манипулирования метаболическими, сигнальными и другими биологическими путями1. Они продемонстрировали потенциал в биологической активации, таких как контролируемые препаратами Т-клеточной активации2 и апоптоз3,4, для повышения безопасности и эффективности приемной Т-клеточной терапии. Кроме того, они обеспечивают новую методологию для in vivo или in vitro обнаружения малых молекул. Например, белки CID могут быть генетически слиты с системами репортера флуоресценции (например, флуоресцентный резонанс передачи энергии (FRET)5 и круговой перемутированный флуоресцентные белки)6 для измерения в режиме реального времени в виво, или служить в качестве сродства реагентов для сэндвич фермент-связанных иммуносорбентовых анализов (ELISA) - как анализы.
Несмотря на их широкое применение, создание новых систем CID, которые могут управляться данной маломолекулярной лигандой, имеет серьезные проблемы. Установленные методы инженерного связующего белка, включая иммунизацию животных7,выбор в пробирке8,9,и вычислительный дизайн белка10 может генерировать лиганд связывающие белки, которые функционируют через бинарные взаимодействия белка-лигада. Тем не менее, эти методы имеют трудности создания лиганд-индуцированной ternary CID комплекса. Некоторые методы создают CID путем химически соединяя 2 ligands которые независимо связывают к таким же или по-разному протеитам11,12,13,14,15,16или полагаются на выбирать протеины связующего, such as антитела пристрелящие preexisting малые комплексы молекул-протеина17,18, и таким образом имеют лимитированный выбор ligands.
Недавно мы разработали комбинаториальный биндерс-e nabled сизбранием CID (COMBINES-CID) метод для де Ново инженерных систем CID19. Этот метод может получить высокую специфичность лиганд-индуцированной димеризации (например, якорь-димеризации связующего диссоциации постоянной, KD (без лиганда)/KD (с лигандой) Специфика димеризации достигается с помощью якорных связующих с гибкими связывающими участками, которые могут вводить конформационные изменения при связывании лиганда, обеспечивая основу для выбора конформистски селективных связующих только распознавающих связующие якорные связующие, связанные с лигандой. Мы продемонстрировали доказательство принципа, создавая каннабидиол (CBD) индуцированных гетеродидеров нанотел, 12-15 kDa функциональный фрагмент антитела из верескации, состоящий из универсальной эшафот и три гибких CDR петли (Рисунок 2)20, который может сформировать связывающий карман с адаптируемыми размерами для малых молекул эпитопов21. Примечательно, что выбор в пробирке библиотеки комбинаторного белка должен быть экономически эффективным и обобщенным для инженерии CID, поскольку один и тот же высококачественный библиотечный может быть применен к различным лиганам.
В этом протоколе и видео, мы сосредоточены на описании двухступенчатой в пробирке выбор и проверка якоря(Рисунок 3A) и димеризации связующих(Рисунок 3B) путем скрининга комбинаторных наивных библиотек с разнообразием выше 109 использованием КБР в качестве мишени, но протокол должен быть применим к другим библиотекам белка или малых молекул цели. Скрининг CID связующих обычно занимает 6-10 недель(рисунок 4).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BirA biotin-protein ligase standard reaction kit</td>
			<td>Avidity</td>
			<td>BirA500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7078-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM13 Helper phage</td>
			<td>Antibody Design Labs</td>
			<td>PH020L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3238S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest BglI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 26/10 Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17508701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap-FF-1ml</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>11000458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13 Major Coat Protein Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-53004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>260251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet RED96</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADL-23c Phagemid Vector</td>
			<td>Antibody Design Labs</td>
			<td>PD0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-6000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81260-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum SuperFi DNA Polymerase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12351010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink PCR Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin M13 Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Medium</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>80026-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Plus 384</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Streptavidin (SSA) Biosensors</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18-5057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 increase 10/300 GL Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9909-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15224-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TG1 Electrocompetent Cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60502-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>471283-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP9726-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89882</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creating highly specific chemically induced protein dimerization systems by stepwise phage selection of a combinatorial single-domain antibody library

События димеризации белка, происходящие только в присутствии маломолекулярного лигана, позволяют развивать маломолекулярные биосенсоры для вскрытия и манипуляции биологическими путями. В настоящее время существует лишь ограниченное число химически индуцированных систем димеризации (CID), и проектирование новых с желаемой чувствительностью и избирательностью для конкретных малых молекуловых лигандов остается проблемой в области белковой инженерии. Мы здесь описываем метод скрининга высокой пропускной записи, комбинаториальный биндерс-e nabled sизбрание CID (COMBINES-CID), для de novo инженерных систем CID, применимых к большому разнообразию лигандов. Этот метод использует двухступенчатый выбор фаговычных комбинаторных нано-библиотеки для получения 1) "якорных связующих", которые сначала связываются с лигандой интереса, а затем 2) "димеризации связующих", которые связывают только якорь связующего-лигандкомплексов. Для выбора якорных связующих, комбинаторная библиотека более 109 комплементарно-определяющих области (CDR)-рандомизированные нанотела проверяются с помощью биотиниляции лиганда и хиты проверяются с немаркированной лигандостью биослойной интерферометрией (BLI). Для получения димеризации связующих, наникто библиотека проверяется с якорным связующего-лиганд комплексов в качестве мишеней для положительного скрининга и несвязанных связующих якорных связующих для отрицательного скрининга. COMBINES-CID широко применима к выбору связующих CID с другими иммуноглобулином, неиммуноглобулином или вычислительно разработанными эшафотами для создания биосенсоров для in vitro и in vivo обнаружения лекарств, метаболитов, сигнальных молекул и т.д.

Мы описываем двухэтапный выбор in vitro и проверку якорных и димеризированных связующих путем скрининга комбинаторной библиотеки наноя с разнообразием выше 109 с использованием КБР в качестве мишени. Важное значение имеет оценка обогащения фагового биопанирования во время последов...

Watch this Scientific Journal Video about Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library at JoVE

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Создание химически индуцированных систем димеризации белка с желаемой близостью и специфичностью для любой небольшой молекулы лиганд будет иметь много биологических приложений зондирования и активации. Здесь мы описываем эффективный, обобщенный метод де Ново-инженерии химически индуцированных систем димеризации через пошаговый выбор фаговычной библиотеки антител, отображаемой фагой.

Создание высокоспецифических химически индуцированных систем димеризации белка по шагу Phage Выбор комбинаторных однодоменных антител библиотеки

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Этот протокол имеет важное значение, поскольку он обеспечивает общий подход к инженерным системам димеризации белка в качестве биосенсоров для различных малых молекул. Кроме того, он использует одну разнообразную белковую библиотеку для выбора биосенсоров для различных лигандов эффективным и экономичным способом без необходимости в специализированном оборудовании. Разработанный биосенсор может быть использован для химического контроля поведения клеток и мониторинга изменений в метаболитах клеток в режиме реального времени.Благодаря этой визуальной демонстрации, исследователи могут наблюдать подробную инструкцию методов с четким ожиданием экспериментального выхода. Начните каждый раунд отбора, выращивая один TG1 электропорации компетентных клеточной колонии в шесть миллилитров 2YT среды при 37 градусов по Цельсию и 250 оборотов в минуту до 600-нанометров поглощения примерно 0,5. Когда оптимальная оптическая плотность будет достигнута, поместите клетки на лед.Чтобы подготовить отрицательный выбор бисера, мыть 300 микролитров стрептавидина покрытием магнитных бусин три раза с одним миллилитром 05%PBS плюс Tween буфера и два раза с одним миллилитром PBS за стирку на магнитной стойке разделения. Resuspend шарики с одним миллилитром 1%casein в PBS, и насыщают шарики с biotin на 5 времен сообщенной емкости связывания шариков. После одного часа при комнатной температуре с вращением, мыть бисер пять раз с PBS плюс Tween и три раза с PBS, как попродемонстрировано.После последней стирки добавьте примерно один раз 10 к 13 фаговым частицам в 1%casein и 1%бычьему альбумину сыворотки в PBS к бисеру для часовой инкубации при комнатной температуре с вращением. В конце инкубации перенесите супернатант в 1,5-миллилитровую трубку. Для положительного отбора с биотинилированными лиганд-связанными стрептавидидиными бусинами насыщают половину объема бисера, используемого для отрицательного отбора в биотинилированном лиганде выбора, в пять раз больше полной связывающей мощности, рассчитанной в соответствии с руководством.После одного часа инкубации при комнатной температуре с вращением, мыть бисер пять раз с PBS плюс Tween и три раза с PBS только, как попродемонстрировано, и блокировать бисер с одним миллилитр 1%casein и 1%bovine сыворотки альбумин в течение одного часа с вращением. В конце инкубации, мыть стрептавидин покрытием магнитных бусин три раза в PBS плюс Tween и один раз в PBS только, как попродемонстрировано, и использовать неограниченный фаг, чтобы повторно использовать стрептавидин покрытием магнитных бусин. Извлекайте несъединый фаг-содержащий супернатант, не нарушая бисер, и отложите образец в сторону для использования в качестве ввода.Затем мыть бисер 10 раз с PBS плюс Tween и пять раз с PBS, как попродемонстрировано, передача бисера в новую трубку после каждых трех моет, чтобы избежать неспецифического связывания связанных фагов к стенкам трубки. Чтобы конкурентоспособно утоить связанные фаги, добавьте 450 микролитров микромолярной концентрации не биотинилированного лиганда к положительному отбору бисера, и поместите шарики на вращение на 30 минут. В конце инкубации перенесите супернатант в новую трубку, которая будет использоваться в качестве выходной.Для ввода титрование, подготовить 10 серийных разбавлений в PBS до одного раза от 10 до девяти раз с входным фагом. Передача 10 микролитров входного фага из 10 раз в семь-десять до девяти разбавлений в 70-микролитерные алициты подготовленных клеток TG1. После 45 минут при 37 градусах Цельсия, пластины инфицированных клеток TG1 на отдельные 90-миллиметровые 2YT агар блюда, содержащие 100 микрограммов на миллилитр ампициллина и 2%глюкозы для ночной инкубации при 37 градусов по Цельсию.На следующее утро используйте формулу для расчета ввода фагов. Для выходной инфекции и титрования добавьте элевированные фаги к трем миллилитрам клеток TG1 для 45-минутной инкубации в 37-градусной водяной бане по Цельсию. Затем приготовьте 10 серийных разбавлений инфицированных клеток в свежем 2YT среде до одного раза от 10 до третьей концентрации, и пластины каждого разбавления на 90-миллиметровых 2YT агар блюда для их ночной инкубации при 37 градусов по Цельсию.На следующее утро вычислите выход фагов по формуле. Чтобы изолировать отдельных клонов от обогащенной сублибрарии, перенесите одиночные колонии из ночных, зараженных фагом клеточных пластин TG1 в 250 микролитров среды 2YT, дополненных ампициллином на колодец в стерильных глубоководных пластинах для их ночной культуры при 37 градусах цельсия. Когда клетки достигают 600-нанометровой плотности примерно 0,5, добавьте пять раз 10 к девяти единицам, образующим бляшки на миллилитр СМ13, и инкубировать клетки в течение 45 минут при 37 градусах Цельсия при 250 вращениях в минуту.В конце инкубации добавьте 500 микролитров среды 2YT, дополненных ампициллином, и 50 микрограммов на миллилитр канамицина к каждой хорошо, и поместите пластину на 25 градусов по Цельсию и 250 вращений в минуту на ночь. На следующее утро осадок клеток центрифугации, чтобы позволить сбор фаговых частиц. Для проверки якорного связывания ELISA, пальто 96-ну ELISA пластин с 100 микролитров пять микрограмм на миллилитр стрептавидина в буфер покрытия при четырех градусах по Цельсию в одночасье.На следующее утро, мыть пластины три раза в 300 микролитров PBS плюс Tween перед добавлением 100 микролитров одноцелерной биотинилированной цели в целевых скважин и 100 микролитров одного микромолара биотина или целевой омолог в соответствующие скважины управления. После одного часа при комнатной температуре, мыть пластины пять раз с PBS плюс Tween за стирку, и блокировать любые неспецифические связывания с 300 микролитров 1%casein на колодец в течение одного часа при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть пластины три раза в свежем PBS плюс Tween за стирку, и добавить очищенный фаг супернатант.После одного часа при комнатной температуре, мыть тарелки 10 раз со свежим PBS плюс Tween за стирку. Добавить 100 микролитров хрена peroxidase M13 основных антител белка пальто к каждому хорошо в течение одного часа инкубации при комнатной температуре. Затем мыть пластины в три раза, как попродемонстрировано, и добавить 100 микролитров субстрата TMB к каждому хорошо в течение 10-минутной инкубации при комнатной температуре или до тех пор, пока видимые изменения цвета наблюдается.Затем остановите реакцию с помощью 100 микролитров одномолярной соляной кислоты на колодец и прочитайте пластину на 450 нанометров на спектрофотометре. После проверки якорного связующего, димеризация связующего скрининга также должна быть выполнена с использованием той же библиотеки белка ориентации якорь связующего-лиганд комплекса. Типичные результаты обогащения после четырех-шести раундов отбора являются хорошим свидетельством того, что существует высокое соотношение потенциальных попаданий в подлибрях, и в этом случае дальнейшие раунды отбора могут не потребоваться.Одно клон ELISA подходит для анализа относительной связывающей близости и селективности связующих якорных и димеризации и облегчает сравнение связывающей избирательности между клонами. Аналогичным образом, выделение связующего димеризации позволяет идентифицировать клонов, которые образуют гетенодимер с обездвиженным связующим звеном якоря только с лигандом или без него. Эти данные, зависящие от концентрации лигандов, свидетельствуют о том, что проверенные нанобои подходят для построения химически индуцированной системы димеризации по сравнению с плохой привязкой, продемонстрированой контрольными образцами.Кроме того, аналитическая хроматография с исключением размеров может быть использована для подтверждения образования гетенодимера между якорными и димеризации связующих в присутствии лиганда. Например, в этом эксперименте пик димеризации наблюдался, когда якорные и димеризации связующих и каннабидиол были смешаны. В отличие от этого, пик димеризации не был обнаружен при отсутствии каннабидиола или когда каждый связующего был загружен в столбец в одиночку.Система димеризации белка должна быть генетически закодирована в дрожжах или клетках млекопитающих, чтобы обеспечить дальнейшую проверку выбранных биосенсоров для разработки виво-приложений. Мы ожидаем, что этот метод даст другим исследователям эффективные и необходимые инструменты для обнаружения важных метаболитов, сигнальных молекул или препаратов in vivo с высоким spatiotemporal разрешением.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Бактериальный Внутренняя мембрана-дисплей для скрининга библиотеки фрагментов антител

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

Эффективная и сайта специфических антител к Этикетировочное штаммом раскрученной азида-алкиновая циклоприсоединения

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Измерение связывания белка с F-актином путем совместного осаждения

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Белка инфракрасный электрохимии фильм продемонстрировано [NiFe] Hydrogenase для изучения окисления2 H

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Весьма деликатного и количественного обнаружения белков и их изоформы методом капиллярной изоэлектрической упором

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Захват кинетика взаимодействия ионного канала белка с малых молекул в Assay интерферометрии био слоя

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Иммунизации альпаки (лама pacos) с белков антигенов и производства антиген специфические антитела одного домена

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Высокая чувствительность измерение транскрипции фактор ДНК привязки родство по конкурентоспособным титрования, с помощью микроскопии флуоресцирования

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...