Name: creating highly specific chemically induced protein dimerization systems by stepwise phage selection of a combinatorial single-domain antibody library
Uploaded: 2020-01-14T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library at JoVE

Bu çalışma Washington Üniversitesi İnovasyon Ödülü (L.G.'ye), ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (1R35GM128918'den L.G.'ye) ve Washington Üniversitesi'nin (L.G.)'ye bir başlangıç fonu tarafından desteklendi. H.J. Washington Araştırma Vakfı lisans bursu ile desteklendi. K.W., Washington Üniversitesi Protein Tasarımı Enstitüsü'nden lisans bursu ile desteklenmiştir.

1. Kütüphane inşaatı
<ol><li>Daha önceaçıklandığıgibi ~ 1.23-7.14 x 109bir çeşitlilik ile sentetik bir kombinatoryal tek etki alanı antikor kütüphanesi kullanın. Bu protokol kitaplık oluşturma içermez, ancak diğer birleştirici bağlayıcı kitaplıklara uygulanabilir.</li>
</ol>2. Ligand hedef veya ligand biyotinylation
<ol><li>Seçilen ligand biyotinylate, örneğin, CBD ve tetrahidrokanabinol (THC)19, çeşitli k...

<ol>
	<li>Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+proximity+in+biology+and+medicine.">Chemically induced proximity in biology and medicine.</a> Science. 359 (6380), (2018).</li><li>Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+therapeutic+T+cells+through+a+small+molecule-gated+chimeric+receptor.">Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor.</a> Science. 350 (6258), (2015).</li><li>Straathof, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+caspase+9+safety+switch+for+T-cell+therapy.">An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy.</a> Blood. 105 (11), 4247-4254 (2005).</li><li>Di Stasi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+apoptosis+as+a+safety+switch+for+adoptive+cell+therapy.">Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (18), 1673-1683 (2011).</li><li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophysical Journal. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li><li>Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circularly+permuted+green+fluorescent+proteins+engineered+to+sense+Ca2+.">Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).</li><li>Hunter, M. M., Margolies, M. N., Ju, A., Haber, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-affinity+monoclonal+antibodies+to+the+cardiac+glycoside,+digoxin.">High-affinity monoclonal antibodies to the cardiac glycoside, digoxin.</a> Journal of Immunology. 129 (3), 1165-1172 (1982).</li><li>Bradbury, A. R. M., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+natural+antibodies:+the+power+of+in+vitro+display+technologies.">Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies.</a> Nature Biotechnology. 29 (3), 245-254 (2011).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-affinity+ligand-binding+proteins+by+periplasmic+expression+with+cytometric+screening+(PECS).">Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS).</a> Nature. Biotechnology. 19 (6), 537-542 (2001).</li><li>Tinberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+design+of+ligand-binding+proteins+with+high+affinity+and+selectivity.">Computational design of ligand-binding proteins with high affinity and selectivity.</a> Nature. 501 (7466), 212-216 (2013).</li><li>Spencer, D. M., Wandless, T. J., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+signal+transduction+with+synthetic+ligands.">Controlling signal transduction with synthetic ligands.</a> Science. 262 (5136), 1019-1024 (1993).</li><li>Ho, S. N., Biggar, S. R., Spencer, D. M., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimeric+ligands+define+a+role+for+transcriptional+activation+domains+in+reinitiation.">Dimeric ligands define a role for transcriptional activation domains in reinitiation.</a> Nature. 382 (6594), 822-826 (1996).</li><li>Belshaw, P. J., Ho, S. N., Crabtree, G. R., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+protein+association+and+subcellular+localization+with+a+synthetic+ligand+that+induces+heterodimerization+of+proteins.">Controlling protein association and subcellular localization with a synthetic ligand that induces heterodimerization of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4604-4607 (1996).</li><li>Farrar, M. A., AlberolaIla, J., Perlmutter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-1+kinase+cascade+by+coumermycin-induced+dimerization.">Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.</a> Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).</li><li>Erhart, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Development+of+Intracellular+Protein+Heterodimerizers.">Chemical Development of Intracellular Protein Heterodimerizers.</a> Chemistry &amp; Biology. 20 (4), 549-557 (2013).</li><li>Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+light-induced+protein+dimerization+in+living+cells+using+a+photocaged+dimerizer.">Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer.</a> Nature Communications. 17 (5), 5475 (2014).</li><li>Hill, Z. B., Martinko, A. J., Nguyen, D. P., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antibody-based+chemically+induced+dimerizers+for+cell+therapeutic+applications.">Human antibody-based chemically induced dimerizers for cell therapeutic applications.</a> Nature Chemical Biology. 14 (2), 112-117 (2018).</li><li>Foight, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-input+chemical+control+of+protein+dimerization+for+programming+graded+cellular+responses.">Multi-input chemical control of protein dimerization for programming graded cellular responses.</a> Nature Biotechnology. 37 (10), 1209-1216 (2019).</li><li>Kang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COMBINES-CID:+An+efficient+method+for+de+novo+engineering+of+highly+specific+chemically+induced+protein+dimerization+systems.">COMBINES-CID: An efficient method for de novo engineering of highly specific chemically induced protein dimerization systems.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (28), 10948-10952 (2019).</li><li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies:+natural+single-domain+antibodies.">Nanobodies: natural single-domain antibodies.</a> Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).</li><li>Fanning, S. W., Horn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-hapten+camelid+antibody+reveals+a+cryptic+binding+site+with+significant+energetic+contributions+from+a+nonhypervariable+loop.">An anti-hapten camelid antibody reveals a cryptic binding site with significant energetic contributions from a nonhypervariable loop.</a> Protein Science. 20 (7), 1196-1207 (2011).</li><li>Zavrtanik, U., Luken, J., Loris, R., Lah, J., Hadzi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+epitope+recognition+by+heavy-chain+camelid+antibodies.">Structural basis of epitope recognition by heavy-chain camelid antibodies.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (21), 4369-4386 (2018).</li><li>Denhardt, D. T., Dressler, D., Ray, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Single-Stranded DNA Phages. , 605-625 (1978).</li><li>Virnekas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trinucleotide+phosphoramidites:+ideal+reagents+for+the+synthesis+of+mixed+oligonucleotides+for+random+mutagenesis.">Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis.</a> Nucleic Acids Research. 22 (25), 5600-5607 (1994).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+single-molecule+interaction+profiling+of+DNA-barcoded+proteins.">Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcoded proteins.</a> Nature. 515 (7528), 554-557 (2014).</li></ol>

Farklı biyopanning turları için giriş faj kitaplıklarının doğru konsantrasyonlarını seçmek çok önemlidir. Biz genellikle ~ 1012-10 13 faj parçacıkları bir çeşitlilik >109ile bir giriş kütüphane başladı , her faj klonu ~ 100-1.000 kopya pull-down test sunulacak izin. Bağlayıcı bir kontrolde faj konsantrasyonu çok yüksek veya düşükse, spesifik olmayan bağlanma veya pozitif klonların kaybı olasılığı artacaktır. Çapa veya dimerization bağlayıcı seçi...

Cid sistemleri, hangi iki protein sadece küçük moleküllü ligand varlığında dimerize (Şekil 1), diseksiyon ve metabolik manipüle için çok yönlü araçlar sunuyoruz, sinyal, ve diğer biyolojik yollar1. Onlar biyolojik aktüasyon potansiyelini göstermiştir, ilaç kontrollü T hücre aktivasyonu gibi2 ve apoptosis3,4,benimseyen T hücre tedavisinin güvenliği ve etkinliğini artırmak için. Ayrıca, küçük moleküllü hedeflerin in vivo veya in vitro tespiti için yeni bir metodoloji sağlarlar. Örneğin, CID proteinleri genetik olarak floresan muhabir sistemleri (örneğin, floresan rezonans enerji transferi (FRET)5 ve dairesel olarak permuted floresan proteinler)6 ile gerçek zamanlı in vivo ölçümler için eritilebilir veya sandviç enzimbağlantılı immünosorbent tahlil (ELISA) benzeri tahliller için yakınlık reaktifleri olarak hizmet verebilir.
Geniş uygulamalarına rağmen, belirli bir küçük moleküllü ligand tarafından kontrol edilebilen yeni CID sistemlerinin oluşturulması büyük zorluklara sahiptir. Hayvan bağışıklama dahil olmak üzere kurulan protein bağlayıcı mühendislik yöntemleri7, in vitro selection8,9, ve hesaplamalı protein tasarımı10 ikili protein-ligand etkileşimleri ile işlev ligand bağlayıcı proteinler üretebilir. Ancak, bu yöntemler ligand kaynaklı üçüncü CID kompleksi oluşturmakta güçlük sahiptir. Bazı yöntemler kimyasal olarak aynı veya farklıproteinler11, 12,13,14,15,16 bağlamak veya önceden varolan küçük molekül-protein kompleksleri 17 hedefleyen antikorlar gibi bağlayıcı proteinleri seçerek güveniki ligandlar bağlayarak CID oluşturmak17,18, ve böylece ligands sınırlı bir seçim var.
Cid sistemlerinin de novo mühendisliği için cid (COMBINES-CID) yönteminin combinatorial binders-enabled sseçim geliştirdik19. Bu yöntem, ligand kaynaklı dimerizasyon yüksek özgüllük elde edebilirsiniz (örneğin, bir çapa-dimerization bağlayıcı dissosilasyon sabiti, KD (ligand olmadan)KD (ligand ile) > 1.000). Dimerizasyon özgüllüğü, ligand bağlama üzerine konformasyonel değişiklikler getirebilen esnek bağlama alanlarına sahip çapa bağlayıcıları kullanılarak elde edilir ve bu da sadece ligand'a bağlı çapa bağlayıcılarını tanıyan konformasyonel seçici bağlayıcıların seçimiiçin bir temel oluşturur. Biz nanobodies cannabidiol (CBD) kaynaklı heterodimers oluşturarak bir kanıt-bir ilke gösterdi, bir 12-15 kDa fonksiyonel antikor parçası evrensel bir iskele ve üç esnek CDR döngüleri oluşan camelid gelen (Şekil 2)20, küçük molekül epitoplar için uyarlanabilir boyutları ile bağlayıcı bir cep oluşturabilirsiniz21,22. Aynı yüksek kaliteli kütüphane farklı ligandlara uygulanabildiği için, özellikle, bir kombinatoryal protein kütüphanesinin in vitro seçimi CID mühendisliği için uygun maliyetli ve genelleştirilebilir olmalıdır.
Bu protokol ve videoda, iki aşamalı in vitro seçimi ve çapa doğrulamasını(Şekil 3A)ve dimerizasyon bağlayıcılarının(Şekil 3B)tanımlanmasına odaklanarak, birleştirici nanobody kütüphanesini hedef olarak CBD kullanarak 109'dan daha yüksek bir çeşitlilikle taramaya odaklanır, ancak protokol diğer protein kütüphaneleri veya küçük moleküllü hedefler için geçerli olmalıdır. CID bağlayıcılarının taranması genellikle 6-10 hafta sürer(Şekil 4).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BirA biotin-protein ligase standard reaction kit</td>
			<td>Avidity</td>
			<td>BirA500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7078-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM13 Helper phage</td>
			<td>Antibody Design Labs</td>
			<td>PH020L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3238S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest BglI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD0074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 26/10 Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17508701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap-FF-1ml</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>11000458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13 Major Coat Protein Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-53004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>260251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet RED96</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADL-23c Phagemid Vector</td>
			<td>Antibody Design Labs</td>
			<td>PD0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-6000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81260-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum SuperFi DNA Polymerase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12351010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink PCR Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K310001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin M13 Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Medium</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>80026-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Plus 384</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Streptavidin (SSA) Biosensors</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18-5057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 75 increase 10/300 GL Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9909-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15224-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TG1 Electrocompetent Cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60502-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>471283-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP9726-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89882</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creating highly specific chemically induced protein dimerization systems by stepwise phage selection of a combinatorial single-domain antibody library

Sadece küçük moleküllü bir ligand varlığında meydana gelen protein dimerizasyon olayları, biyolojik yolların diseksiyonu ve manipülasyonu için küçük moleküllü biyosensörlerin geliştirilmesini sağlar. Şu anda, kimyasal olarak indüklenen dimerization (CID) sistemlerinin sadece sınırlı sayıda var ve belirli küçük moleküllü ligandlar için istenilen duyarlılık ve seçicilik ile mühendislik yenileri protein mühendisliği alanında bir sorun olmaya devam etmektedir. Burada yüksek bir iş-iş tarama yöntemi, combinatorial binders-enabled sseçim CID (COMBINES-CID), cid sistemlerinin de novo mühendislik ligands büyük bir çeşitlilik için geçerli dir. Bu yöntem, ilk ilgi bir ligand ve daha sonra 2) "dimerization bağlayıcılar" sadece bağlantı bağlayıcı-ligand kompleksleri bağlamak bağlamak 1) "çapa bağlayıcıları" elde etmek için bir faj görüntülenen kombinatoryal nanobody kütüphane iki adımlı seçim kullanır. Çapa bağlayıcılarını seçmek için,10'dan fazla 9 tamamlayıcılık belirleyici bölgeden (CDR) randomize nanocisi olan bir kombinatoryal kütüphane biyotinylated ligand ile taranır ve isabetler biyo-katman interferometrisi (BLI) ile etiketlenmemiş ligand ile doğrulanır. Dimerization bağlayıcıları elde etmek için, nanobody kitaplığı pozitif tarama için hedef olarak çapa bağlayıcı-ligand kompleksleri ve negatif tarama için bağlanmamış çapa bağlayıcıları ile taranır. BİrLEŞTİrME-CID, diğer immünglobulin, immünoglobulin olmayan veya ilaç, metabolitler, sinyal molekülleri vb in vitro ve in vivo algılama için biyosensörler oluşturmak için hesaplamalı olarak tasarlanmış iskeleler ile cid bağlayıcıları seçmek için geniş uygulanabilir.

CbD'yi hedef olarak kullanarak 109'dan daha yüksek bir çeşitlilikle kombinatoryal nanobody kütüphanesini taratarak çapa ve dimerizasyon bağlayıcılarının iki aşamalı in vitro seçimi ve doğrulanmasını tanımlıyoruz. Hem çapa hem de dimerizasyon bağlayıcıları için birbirini izleyen seçim turları sırasında faj biyopannasyonunun zenginleştirilmesinin değerlendirilmesi önemlidir. Şekil 5'te gösterildiği gibi 4-6 tur seçimden sonraki tipik zenginleştir...

Watch this Scientific Journal Video about Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library at JoVE

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Herhangi bir küçük molekül ligand için istenilen yakınlık ve özgüllük ile kimyasal kaynaklı protein dimerizasyon sistemleri oluşturma birçok biyolojik algılama ve harekete uygulama olacaktır. Burada, faj la görüntülenen tek etki alanı antikor kütüphanesinin adım adım seçimi yoluyla kimyasal olarak indüklenen dimerizasyon sistemlerinin de novo mühendisliği için etkili, genelleştirilebilir bir yöntemi tanımlıyoruz.

Bir Kombinatoryal Tek Etki Alanı Antikor Kütüphanesi adım wise Faj Seçimi ile Son Derece Spesifik Kimyasal Kaynaklı Protein Dimerization Sistemleri Oluşturma

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Bu protokol, çeşitli küçük moleküller için biyosensör olarak protein dimerizasyon sistemlerinin mühendisliğine genel bir yaklaşım sağladığı için önemlidir. Buna ek olarak, özel ekipman gerek kalmadan verimli ve uygun maliyetli bir şekilde farklı ligands için biyosensörler seçmek için bir son derece çeşitli protein kütüphanesi kullanır. Tasarlanmış biyosensör, hücre davranışını kimyasal olarak kontrol etmek ve hücre metabolitlerinde gerçek zamanlı değişiklikleri izlemek için kullanılabilir.Bu görsel gösteri sayesinde, araştırmacılar deneysel çıktı net bir beklenti ile tekniklerin ayrıntılı bir talimat gözlemleyebilirsiniz. 37 santigrat derece ve dakikada 250 devir de yaklaşık 0,5 600 nanometre emici lik 2YT orta altı mililitre tek bir TG1 elektroporasyon yetkili hücre kolonisi büyüyerek seçim her tura başlayın. En uygun optik yoğunluğa ulaşıldığında, hücreleri buza yerleştirin.Negatif seçim boncukları hazırlamak için, 300 mikrolitre streptavidin kaplı manyetik boncukları üç kez mililitre %05 PBS artı Ara bellek ve bir manyetik ayırma rafında yıkama başına bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın. PBS'de boncukları bir mililitre %1 kazein ile yeniden askıya alın ve boncukların bildirilen bağlama kapasitesinin beş katı biotin ile doygunlayın. Rotasyon ile oda sıcaklığında bir saat sonra, gösterildiği gibi PBS artı Tween ile boncuk beş kez ve PBS ile üç kez yıkayın.Son yıkamadan sonra, 1%kazein de 13 faj parçacıkları için yaklaşık bir kez 10 ve PBS% 1 sığır serum albumin oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için boncuk rotasyon ile ekleyin. Kuluçka sonunda, 1.5 mililitrelik bir tüp içine supernatant aktarın. Biyotinylated ligand bağlı streptavidin boncuklar ile pozitif seçim için, biyotinylated ligand seçim negatif seçim için kullanılan boncuk hacminin yarısını doygunluk beş kez manuel göre hesaplanan tam bağlama kapasitesi.Rotasyon ile oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka sonra, pbs artı Tween ile boncuk beş kez yıkayın ve sadece PBS ile sadece gösterildiği gibi, ve bir mililitre ile boncuk blok 1% kazein ve% 1 sığır serum albumin rotasyon ile bir saat boyunca. Kuluçka sonunda, streptavidin kaplı manyetik boncukları PBS artı Tween'de üç kez ve gösterildiği gibi pbs'de bir kez yıkayın ve streptavidin kaplı manyetik boncukları yeniden askıya almak için sınırsız faj kullanın. Boncukları rahatsız etmeden bağlanmamış faj içeren süpernatant'ı ayıklayın ve giriş olarak kullanılmak üzere numuneyi bir kenara koyun.Daha sonra boncukları PBS artı Tween ile 10 kez ve gösterildiği gibi PBS ile beş kez yıkayın, her üç yıkamadan sonra boncukları tüp duvarlarına bağlı fajların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için yeni bir tüpe aktarın. Bağlı fajları rekabetçi bir şekilde yok etmek için, pozitif seçim boncuklarına biyotinylated olmayan ligand mikromolar konsantrasyonunun 450 mikrolitresini ekleyin ve boncukları 30 dakika boyunca rotasyona koyun. Kuluçka sonunda, çıkış olarak kullanılmak üzere yeni bir tüp içine supernatant aktarın.Giriş titrasyonu için, PBS'de 10 seri seyreltme yi 10 kereye kadar 10 kereye kadar giriş fajı ile dokuz katına kadar hazırlayın. 10 mikrolitre giriş fajını 10 kereden 7'ye 10'a, dokuz seyreltmeden hazırlanan TG1 hücrelerinin 70 mikrolitrelik aliquotlarına aktarın. 37 santigrat derecede 45 dakika sonra, enfekte TG1 hücrelerini mililitrede 100 mikrogram ampisilin ve 37 santigrat derecede bir gecede kuluçka için %2 glikoz içeren tek tek 90 milimetrelik 2YT agar tabaklara koyun.Ertesi sabah, faj girişini hesaplamak için formülü kullanın. Çıkış enfeksiyonu ve titrasyon için, 37 derecelik santigrat su banyosunda 45 dakikalık bir kuluçka için üç mililitre TG1 hücresine eluted fajları ekleyin. Daha sonra taze 2YT ortamda enfekte hücrelerin 10 seri seyreltme hazırlamak bir kez 10 üçüncü konsantrasyon için, ve plaka 90 milimetrelik 2YT agar yemekleri üzerinde her seyreltme 37 santigrat derece onların gecede kuluçka için.Ertesi sabah, formüle göre faj çıktısını hesaplayın. Tek tek klonları zenginleştirilmiş bir alt kütüphaneden izole etmek için, tek kolonileri bir gecede kültürlü, faj ile enfekte TG1 hücre plakalarından, steril derin kuyu plakalarında 37 santigrat derecelik bir gecede kültürleri için iyi başına ampisilin ile takviye edilmiş 2YT ortamına 250 mikrolitreye aktarın. Hücreler yaklaşık 0,5 600 nanometre lik bir yoğunluğa ulaştığında, cm13 yardımcı fajının mililitrebaşına beş katı 10 ekleyin ve hücreleri dakikada 250 dönüşte 37 derecede 45 dakika kuluçkaya yatırın.Kuluçka sonunda, her kuyuya ampisilin ve mililitre başına 50 mikrogram kanamisin ile takviye edilmiş 2YT ortamının 500 mikrolitresini ekleyin ve plakayı bir gecede dakikada 25 derece ve dakikada 250 dönüşe yerleştirin. Ertesi sabah, faj parçacıklarının toplanması için santrifüj ile hücreleri tortu. ELISA tarafından çapa bağlama doğrulamak için, kat 96-iyi ELISA plakaları ile mililitre streptavidin başına beş mikrolitre 100 mikrolitre kaplama tampon dört derece santigrat bir gecede.Ertesi sabah, hedef kuyulara 100 mikromografi biyotinylated hedef ve 100 mikrolitre tek mikromolar biotin veya uygun kontrol kuyularına hedef homolog eklemeden önce pbs artı Tween 300 mikrolitre plakaları üç kez yıkayın. Oda sıcaklığında bir saat sonra, plakaları yıkama başına PBS artı Ara ile beş kez yıkayın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca her kuyu başına %1 kaze 300 mikrolitre ile spesifik olmayan bağlamayı engelleyin. Kuluçka sonunda, taze PBS artı Tween yıkama başına üç kez plakaları yıkayın ve saflaştırılmış faj supernatant ekleyin.Oda sıcaklığında bir saat sonra, tabakları her yıkamada taze PBS ve Tween ile 10 kez yıkayın. Oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için her kuyuya 100 mikrolitre horseradish peroksidaz M13 majör kat protein antikorekleyin. Daha sonra tabakları gösterildiği gibi üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında veya gözle görülür bir renk değişimi gözlemlenene kadar 10 dakikalık bir kuluçka için her kuyuya 100 mikrolitre TMB substrat ekleyin.Sonra kuyu başına tek molar hidroklorik asit 100 mikrolitre ile reaksiyonu durdurmak ve bir spektrofotometre üzerinde 450 nanometre plaka okuyun. Çapa bağlayıcı doğrulaması yapıldıktan sonra, demirbağlayıcı-ligand kompleksini hedefleyen aynı protein kitaplığı kullanılarak dimerizasyon bağlayıcı taraması da yapılmalıdır. Dört ila altı tur seçimden sonraki tipik zenginleştirme sonuçları, alt kütüphanelerde potansiyel isabet oranının yüksek olduğunun iyi bir göstergesidir ve bu durumda daha fazla seçim turuna gerek olmayabilir.Tek klonlu ELISA, çapa ve dimerizasyon bağlayıcılarının göreceli bağlama afiyetini ve seçiciliğini analiz etmek için uygundur ve klonlar arasında bağlayıcı seçiciliğin karşılaştırılmasını kolaylaştırır. Aynı şekilde, dimerization bağlayıcı seçimi sadece ligand veya olmadan immobilize çapa bağlayıcı ile bir heterodimer oluşturan klonların belirlenmesini sağlar. Bu ligand konsantrasyonuna bağlı bağlayıcı veriler, test edilen nanocisimlerin, kontrol numunelerinin gösterdiği zayıf bağlamaya kıyasla kimyasal olarak indüklenen bir dimerizasyon sistemi oluşturmak için uygun olduğunu göstermektedir.Ayrıca, analitik boyut dışlama kromatografisi ligand varlığında çapa ve dimerizasyon bağlayıcılar arasındaki heterodimer oluşumunu doğrulamak için kullanılabilir. Örneğin, bu deneyde, çapa ve dimerizasyon bağlayıcıları ve kannabidiol karıştırıldığında bir dimerization tepe gözlendi. Buna karşılık, cannabidiol yokluğunda veya her bağlayıcı tek başına sütuna yüklendiğinde hiçbir dimerization tepe algılandı.Protein dimerizasyon sistemi, in vivo uygulamaları geliştirmek için seçilen biyosensörlerin daha fazla doğrulanmasına olanak sağlamak için genetik olarak maya veya memeli hücrelerinde kodlanmalıdır. Bu yöntemin diğer araştırmacılara önemli metabolitleri, sinyal molekülleri veya yüksek spatiotemporal çözünürlükte in vivo ilaçları tespit etmek için etkili ve gerekli araçları sunmasını bekliyoruz.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Antikor parçalarının bir kütüphanenin taranması için bakteriyel iç zar görüntü

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

Verimli ve Siteye özgü Gerilme-terfi Azid-alkin Siklokatılma tarafından Antikor Etiketleme

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Ko-çöktürme yoluyla F-aktine Bağlı Proteinin Ölçülmesi

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film kızılötesi elektrokimya H2 oksidasyon çalışma için [NiFe] Hydrogenase tarafından gösterdi

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Proteinler ve onların izoformlarının kapiller Isoelectric odaklanarak yöntemi tarafından son derece hassas ve nicel tespiti

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Bir iyon kanal protein biyo-katman Interferometry tahlil tarafından küçük molekülleri ile etkileşimi Kinetik yakalama

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Alpaka (Lama Paços) Protein antijenleri ve antijen spesifik tek etki alanı antikor üretimi ile bağışıklama

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı Affinities floresans mikroskobu kullanarak rekabet titrasyon tarafından yüksek hassasiyet ölçümü

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...