Name: visualization, quantification, and mapping of immune cell populations in the tumor microenvironment
Uploaded: 2020-03-25T14:00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment at JoVE.com

نشكر المشارك في الدراسة. نشكر لويز روسو، منسقة البنك الحيوي HBP لاسترداد عينات الأنسجة وجميع المعلومات السريرية المرتبطة بها. نحن نعترف بعلم الأمراض الجزيئية ومرافق التصوير الخلوي الأساسية في CRCHUM ومايكل بيرش من Visiopharm للحصول على مساعدة تقنية ممتازة. التمويل: تم دعم هذه الدراسة من خلال منح مقدمة من مؤسسة الكبد الكندية، ومؤسسة التنمية الاقتصادية في كيبيك-سانتي (FRQS) شبكة الإيدز والأمراض المعدية (Réseau SIDA-MI)، والشبكة الكندية لالتهاب الكبد C (CanHepC). يتم تمويل CanHepC من خلال مبادرة مشتركة من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (NHC-142832) ووكالة الصحة العامة الكندية. حصل M.F.M. على زمالات من جامعة مونتريال، وبورصة غابرييل ماركيز، وFRQS. حصل T.F. على زمالات الدكتوراه من CIHR و CanHepC. S.T. يحمل كرسي روجر-ديس غروسيليرس في جراحة الأورام الكبدية والبنكرياس، جامعة مونتريال.
مساهمات المؤلف: M.F.M. تم تصميمها وتجربتها وتحليلها وتحليل البيانات. T.F. صممت التجارب. أ. سي بي. قدمت التوجيه التقني. أجرى G.S. جميع التقييم المرضي لموضوع الدراسة وقدم مدخلات حول جميع الجوانب المرضية. قامت L.M. بتلطيخ H & E وتحسينها وتنفيذها. M.N.A. أداء وصمة عار PSR وقدمت مدخلات تقنية قيمة. ساهم N.B. في تحليل الصورة. S.T. هو المحقق الرئيسي للبنك الحيوي HBP وهو مسؤول عن الإشراف على التشغيل العام للبنك الحيوي. كما قدم مدخلات لا تقدر بثمن في جميع جوانب المشروع وآثاره السريرية. M.F.M، T.F. ، وN.H.S. تصور وتصميم الدراسة. وأشرف ت. ه. س. على العمل وحصل على تمويل. كتب م.ف.م، وT.F.، و A.C-B، ون.ه.س. المخطوطة. قام جميع المؤلفين بمراجعة المخطوطة والموافقة عليها.

<ol>
	<li>Greten, F. R., Grivennikov, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+Cancer:Triggers,+Mechanisms,+and+Consequences.">Inflammation and Cancer:Triggers, Mechanisms, and Consequences.</a> Immunity. 51 (1), 27-41 (2019).</li><li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+validation+of+the+consensus+Immunoscore+for+the+classification+of+colon+cancer:+a+prognostic+and+accuracy+study.">International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study.</a> Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).</li><li>Binnewies, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+tumor+immune+microenvironment+(TIME)+for+effective+therapy.">Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy.</a> Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).</li><li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+the+tumor+immune+microenvironment+for+staging+and+therapeutics.">Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics.</a> Modern Pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 31 (2), 214-234 (2018).</li><li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+dynamics+of+intratumoral+immune+cells+reveal+the+immune+landscape+in+human+cancer.">Spatiotemporal dynamics of intratumoral immune cells reveal the immune landscape in human cancer.</a> Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).</li><li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+introduction+of+the+'Immunoscore'+in+the+classification+of+malignant+tumours.">Towards the introduction of the 'Immunoscore' in the classification of malignant tumours.</a> The Journal of Pathology. 232 (2), 199-209 (2014).</li><li>Finotello, F., Eduati, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Omics+Profiling+of+the+Tumor+Microenvironment:+Paving+the+Way+to+Precision+Immuno-Oncology.">Multi-Omics Profiling of the Tumor Microenvironment: Paving the Way to Precision Immuno-Oncology.</a> Frontiers in Oncology. 8, 430 (2018).</li><li>Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histo-cytometry:+a+method+for+highly+multiplex+quantitative+tissue+imaging+analysis+applied+to+dendritic+cell+subset+microanatomy+in+lymph+nodes.">Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes.</a> Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).</li><li>Giesen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+imaging+of+tumor+tissues+with+subcellular+resolution+by+mass+cytometry.">Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry.</a> Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).</li><li>Porta Siegel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry+Imaging+and+Integration+with+Other+Imaging+Modalities+for+Greater+Molecular+Understanding+of+Biological+Tissues.">Mass Spectrometry Imaging and Integration with Other Imaging Modalities for Greater Molecular Understanding of Biological Tissues.</a> Molecular Imaging and Biology : MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 20 (6), 888-901 (2018).</li><li>Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry+Imaging:+A+Review+of+Emerging+Advancements+and+Future+Insights.">Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights.</a> Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).</li><li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype.">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).</li><li>Gendusa, R., Scalia, C. R., Buscone, S., Cattoretti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elution+of+High-affinity+(&gt;10-9+KD)+Antibodies+from+Tissue+Sections:+Clues+to+the+Molecular+Mechanism+and+Use+in+Sequential+Immunostaining.">Elution of High-affinity (&gt;10-9 KD) Antibodies from Tissue Sections: Clues to the Molecular Mechanism and Use in Sequential Immunostaining.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (7), 519-531 (2014).</li><li>van der Loos, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunoenzyme+staining:+methods+and+visualizations+for+the+observation+with+spectral+imaging.">Multiple immunoenzyme staining: methods and visualizations for the observation with spectral imaging.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 313-328 (2008).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labeling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labeling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).</li><li>Segnani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+Detection+of+Collagen+Fibers+by+Sirius+Red/Fast+Green+Is+More+Sensitive+than+van+Gieson+or+Sirius+Red+Alone+in+Normal+and+Inflamed+Rat+Colon.">Histochemical Detection of Collagen Fibers by Sirius Red/Fast Green Is More Sensitive than van Gieson or Sirius Red Alone in Normal and Inflamed Rat Colon.</a> PloS One. 10 (12), 0144630 (2015).</li><li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Staining+by+Sequential+Immunostaining+and+Antibody+Removal+on+Routine+Tissue+Sections.">Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li></ol>

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

هناك حاجة بسيطة وسهلة الوصول إليها لتنفيذ تقنيات متعددة الشينغ التي تسمح بالاستبانة المكانية للخلايا المناعية في أقسام الأنسجة لرسم خريطة للمشهد المناعي في السرطان والاضطرابات المناعية الأخرى. هنا، ونحن نصف استراتيجية تدمج العلامات المتاحة على نطاق واسع وتقنيات التحليل الرقمي لتوسيع قدرة تعدد النصائح والتقييم متعدد الأبعاد من المقالات التصوير12،13،17،19. تلطيخ ثلاثة أقسام المسلسل لعلامات مختلفة ، وإعادة استخدام المقاطع من خلال تقنيات التجريد وإعادة التحقيق ، مكنتنا من تصور 11 المعلمات بالإضافة إلى بقع H & E و PSR. تم محاذاة ست صور من هذه الأقسام بطريقة آلية باستخدام وحدة محاذاة الأنسجة. كانت المحاذاة دقيقة على مستوى الخلية الفردية للصور الناشئة من نفس القسم ومتوافقة للغاية للصور الناشئة من الأقسام المجاورة. متعددة الظاهري مكنتنا من تحديد كيفية علامات تصور في أحد الأقسام تتصل مكانيا إلى علامات تصور في قسم آخر متجاورة. وفي حين أن بعض البقع وصفت بثاني أكسيد الكربون، فإن البعض الآخر وصف بـ TCs، مما يسمح لنا بتحديد كمي لثاني أكسيد الكربون في مختلف اللجان. وقد أدى استخدام أدوات برمجية للقياس الكمي الآلي لـ COIs إلى تبسيط وتسريع معالجة الصور إلى حد كبير. وعلاوة على ذلك، تم تطبيق التحليل الرقمي على أقسام الأنسجة بأكملها بدلاً من مجالات نظر مختارة، مما أدى إلى تمثيل غير متحيز للإدارة المتكاملة للأنسجة. وعلاوة على ذلك، ونظرا ً لأن إحداثيات الأنسجة في COIs تم تسجيلها، كان من الممكن توليد خرائط حرارة الأنسجة.
هناك عدة مناطق في هذا البروتوكول حيث قد تكون هناك حاجة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. أولاً، يمكن أن يؤثر استرداد المستضد الضعيف على جودة الـ mIF، وبالتالي يجب تحسين نوع عازل استرجاع المستضد والمدة لظروف الفحص/العلامات الحيوية المحددة المستخدمة. ثانياً، ينبغي تكييف نوع محلول الحجب المستخدم مع الأنسجة/المستضد/الأنواع من الأجسام المضادة الأولية والثانوية. في أيدينا، إضافة 10٪ مجموع المصل من الأنواع حيث النسيج يأتي من مستقبلات FC منعت، وبالتالي انخفاض غير محدد ربط الأجسام المضادة. إضافة 10٪ من المصل من الأنواع التي أثيرت فيها الأجسام المضادة الثانوية من شأنها أن تقلل من التعلق المباشر غير المحدد للأجسام المضادة الثانوية إلى قسم الأنسجة. ثالثاً، من الضروري التحقق من خصوصية الأجسام المضادة الأولية والثانوية باستخدام الضوابط الإيجابية والسلبية المناسبة. رابعا، زيادة الفلورات في بعض القنوات ونشر DAPI على تجريد الأجسام المضادة الأولية هي أيضا شائعة. لمعالجة الفلور التّيعز المُحسّن، استخدمنا أزواج الأجسام المضادة الأولية/الثانوية حيث كانت الإشارة المحددة تحتوي على قيم كثافة لا تقل عن 5 x تلك التي تحتوي عليها الخلفية. وأخيرا، لا يمكن توصف بعض الأجسام المضادة تقارب عالية مع إجراءات تجريد العادية. في هذه الحالة، نوصي باستخدام مثل هذه الأجسام المضادة في الجولة الأخيرة من وضع العلامات. قد يضطر المستخدم إلى محاولة تسلسل تلطيخ مختلف للعثور على التكوين الأمثل للأجسام المضادة ذات الاهتمام. وينبغي تأكيد كفاءة التجريد قبل الشروع في جولة ثانية أو ثالثة من وضع العلامات.
القيد الرئيسي والتحدي الذي تواجهه هذه الاستراتيجية هو العثور على التوليفات الصحيحة من الأجسام المضادة الفلورية الأولية والثانوية لعلامات الاهتمام. العثور على الأجسام المضادة الأولية التي أثيرت في أنواع مختلفة أو مع isotypes المختلفة التي يمكن استخدامها في وقت واحد محدودة بما هو متاح تجاريا. معظم الماسحات الضوئية الشريحة كلها مجهزة المصابيح والمرشحات التي تسمح التصوير بحد أقصى خمس قنوات، والأجسام المضادة الثانوية في الأنواع الصحيحة والفلوروفور الحق ليست متاحة دائما. لقد تغلبنا جزئيا على هذه القيود باستخدام البقع التسلسلية والعلامات المتسلسلة. قد تحتاج العديد من تركيبات الأجسام المضادة إلى اختبارها للوصول إلى أفضل تركيبة لعلامات الاهتمام. القيد الآخر هو جودة تلطيخ DAPI ، لأن تجريد وإعادة التحقيق قد لا تسمح دائمًا بإجراء تجزئة النوى.
وحدة محاذاة الأنسجة يتطلب الحد الأدنى من التدريب وليس مهارات البرمجة من المستخدمين. البرنامج يسمح نظريا محاذاة عدد غير محدود من الصور. ومع ذلك، تعتمد المحاذاة الدقيقة على صلة المقاطع، حيث يتم محاذاة الأقسام الأقرب التي تكون أكثر توافقًا من الناحية النسيجية بشكل أكثر دقة. استخدمنا وحدة المؤلف من VIS لتوليد APPs. هناك حاجة إلى المعرفة الأساسية لتحليل الصور لإنشاء APPs ، ولكن هذا هو الحال بنفس القدر عند استخدام أي برنامج آخر لتحليل الصور. وتشمل المزايا الفريدة لـ VIS بالمقارنة مع برامج تحليل الصور الأخرى المحاذاة الآلية للصور من الأقسام المعدة باستخدام أساليب مختلفة (على سبيل المثال، IF، كيمياء النسيج، IHC). وهذا يسمح الدراسات توطين مشترك من علامات متعددة من الفائدة باستخدام multixing الظاهري. وعلاوة على ذلك، فإن التصميم المرن والسهل الاستعمال للAPPs يسمح بالتخصيص الخاص بالمستخدم. القياس الكمي الآلي ورسم الخرائط ، وإمكانية معالجة أقسام الأنسجة بأكملها ، يوفر الوقت ويقلل من التحيز مقارنة بالعد اليدوي عن طريق الفحص البصري.
هذه الاستراتيجية هي أداة بحثية مفيدة للغاية لمناعة الأنسجة في سياق السرطان والمناعة الذاتية ولكنها لا تزال غير مصدقة للاستخدام السريري. مع توحيد إضافية والتحقق من صحة, ويمكن استخدامه في المستقبل لتطبيقات متعددة (على سبيل المثال, لرسم خريطة المشهد المناعي في السرطان للتنبؤ ورصد الاستجابة لعوامل العلاج المناعي). كما يمكن تكييفه مع الحالات الالتهابية المختلفة (على سبيل المثال، مرض الأمعاء الالتهابي) للجمع بين التقييم المرضي والمؤشرات الحيوية التكهنية.
وتتمثل الخطوات الحاسمة الرئيسية في هذا البروتوكول في كفاءة/خصوصية وضع العلامات ومتانة الإجراءات المصممة للاستخدام المقصود أو العلامة البيولوجية. وبالتالي ، فإن التحقق من الصحة المنتظم عن طريق الفحص البصري ، وخاصة عند تصميم APP جديد ، أمر ضروري. الاستخدام الفعال لجولات متعددة من تجريد وإعادة التحقيق أو أنواع مختلفة من البقع على نفس القسم هي مكونات حاسمة ويمكن أن تكون أنسجة أو قسم محدد. التحقق من كفاءة هذه العمليات قبل الشروع في تحليل دفعة كبيرة أمر بالغ الأهمية.
باختصار، نحن نقدم استراتيجية تزيد من المعلومات الكمية والمكانية التي يمكن الحصول عليها من عينات الأنسجة السريرية القيمة. ويمكن الوصول على نطاق واسع إلى الموارد والمعدات والمعارف اللازمة لتنفيذ هذه المنهجية. ونحن نقترح هذه المنهجية كدليل مفيد لتخطيط المقالات التي تهدف إلى تحديد مجموعات الخلايا المناعية وقياسها كمياً ورسم خرائط لها في منطقة TME.

تطور السرطان هو نتيجة لعملية متعددة الخطوات تنطوي على تفاعلات متبادلة بين الخلايا الخبيثة وTME. بخلاف الخلايا السرطانية ، يتكون TME من خلايا غير خبيثة ، وخلايا سترومال ، وتجمعات الخلايا المناعية ، ومصفوفة خارج الخلية (ECM)1. التنظيم المكاني للمكونات الخلوية والهيكلية المختلفة للأنسجة الورم والتبادل الديناميكي بين السرطان والخلايا المجاورة غير السرطانية في نهاية المطاف تعديل تطور الورم والاستجابة للعلاج2،3،4. وقد ثبت أن الاستجابة المناعية في السرطان هو تنظيم spatiotemporally5,6. مجموعات مختلفة من الخلايا المناعية التي تتسلل إلى آفة البلاستيك النيولي والأنسجة المجاورة تظهر أنماط توزيع مكانية مميزة وحالات تنشيط وتمايز متنوعة مرتبطة بوظائف مختلفة (على سبيل المثال، الموالية مقابل المضادة للورم). هذه الفئات المختلفة المناعية ومعلماتها تتطور العمل الإضافي مع الورم والمقصورات سترومال.
وقد أدى ظهور التقنيات التي تسمح بتنميط متعدد الخلايا المفردة إلى زيادة فهمنا للعديد من الشبكات الخلوية والجزيئية التي تنظم التسرطن وتطور الورم. ومع ذلك، تتطلب معظم الأدوات التحليلية عالية الإنتاجية القائمة على الخلية الواحدة تعطيل الأنسجة وعزل الخلية الواحدة، مما يؤدي إلى فقدان المعلومات حول التنظيم المكاني للخلايا والتفاعلات بين الخليةوالخلية 7. لأن موقع وترتيب خلايا مناعية محددة في TME لها قيمة تشخيصية وتشخيصية، والتكنولوجيات التي تسمح الاستبانة المكانية هي تكملة أساسية لتقنيات التنميط المناعي الواحدة القائمة على الخلية.
تقليديا، تقنيات التصوير مثل الكيمياء المناعية (IHC) والفلورالمناعة متعددة (mIF) وقد اقتصرت على عدد قليل من المؤشرات الحيوية التي يمكن تصورها في وقت واحد. وقد أعاق هذا القيد دراسة الديناميات الصدغية للخلايا المناعية المتسللة للورم ، والتي يتم تعريفها عادة من خلال العديد من العلامات النفية. وقد أدت التطورات الأخيرة في أدوات التصوير والتحليل إلى توسيع إمكانيات تعدد الإرسال. وقد استخدمت تقنيات جديدة القائمة على الأجسام المضادة وضع العلامات مثل القياس الهسهي والقياس الخلوي الشامل التصويري لفصل مكان مكاني تصل إلى 12 و 32 المؤشرات الحيوية، على التوالي8،9. التصوير الطيفي الشامل، وهي تقنية لا تتطلب وضع العلامات، لديه القدرة على صورة الآلاف من المؤشرات الحيوية في وقت واحد في قسم نسيج واحد10،11. على الرغم من أن هذه التقنيات قد أظهرت بالفعل إمكانات كبيرة لتشريح المناظر الطبيعية المناعية النسيج في السرطان، فإنها تستخدم معدات وبرامج متطورة للغاية ومكلفة وغير متاحة بسهولة لغالبية الباحثين.
بدلا من ذلك، تم توسيع قدرة تعدد الإمكانات من IHC التقليدية وmIF من خلال استخدام التصوير التسلسلي، وجولات متتابعة من وضع العلامات، والتصوير الطيفي7،12،1313،14،15،16. هذه التقنيات تولد صورا متعددة من نفس أو من أقسام الأنسجة التسلسلية التي يمكن دمجها في الشرائح الظاهرية متعددة المعلمات باستخدام برامج تحليل الصور. ونتيجة لذلك، يزداد عدد العلامات التي يمكن تصورها وتحليلها في وقت واحد.
هنا ، نقترح استراتيجية للتصميم العقلاني لمقالات متعددة الأنسجة باستخدام الكواشف المتاحة تجاريًا ، ومعدات المجهر بأسعار معقولة ، والبرامج سهلة الاستخدام(الشكل 1). تدمج هذه المنهجية التصوير التسلسلي، ووضع العلامات المتسلسلة متعددة، وتصوير الأنسجة بأكملها، ومحاذاة الأنسجة لتوليد شرائح متعددة المعلمات الظاهرية التي يمكن استخدامها للقياس الكمي الآلي ورسم خرائط الخلايا المناعية في أقسام الأنسجة. باستخدام هذه الاستراتيجية، أنشأنا شريحة واحدة افتراضية تتألف من 11 علامة حيوية بالإضافة إلى اثنين من البقع النسيجية المستخدمة بشكل متكرر: الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) وpicrosirius الأحمر (PSR). تم تحديد مجموعات متعددة من الخلايا المناعية، وتحديد موقعها، وقياسها كميا في مقصورات الأنسجة المختلفة وحل توزيعها المكاني باستخدام خرائط حرارة الأنسجة. هذه الاستراتيجية تعظيم المعلومات التي يمكن الحصول عليها من عينات سريرية محدودة وينطبق على الفورماين ثابتة جزءا لا يتجزأ من عينات الأنسجة المؤرشفة (FFPE) ، بما في ذلك الأنسجة الكاملة ، خزعات إبرة الأساسية ، والخلايا الدقيقة الأنسجة. نقترح هذه المنهجية كدليل مفيد لتصميم المقالات المخصصة لتحديد وتحديد كمية ورسم خرائط مجموعات الخلايا المناعية في TME.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1419px;" width="1418">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:649px;">Antigen Retrieval Solution: Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% v/v Tween 20, pH 6.0)</td>
			<td style="width:257px;"></td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blocking Solution: 1 % BSA, 10 % filtered human serum, 10 % filtered donkey serum, 0.1 % Tween 20, and 0.3% Triton in PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>800-095-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coplin jars (EASYDIP SLIDE STAINING SYSTEM)</td>
			<td>Newcomersupply</td>
			<td>5300KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545E 22*50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Direct Red 80</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td align="right">365548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol 100%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electric pressure cooker</td>
			<td>Salton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eosin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td align="right">3801600</td>
			<td>CAUTION, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td>CAUTION, harmful by inhalation, ingestion and skin absortion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FFPE section (4&#956;m) slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycine 0,1 M in PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hematoxylin Stain Solution, Gil 1. Formulation, Regular Strength</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3535-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Holder (EasyDip Staining Jar Holder)</td>
			<td>Newcomersupply</td>
			<td>5300RK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td align="right">22210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Humidity chamber</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z670138-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pap pen</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS-Tween 20 (0.1% v/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Permount Mounting Media</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Picric Acid 1.3 %</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6744</td>
			<td>CAUTION, skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Picro-Sirius Red/Fast Green solution: Fast Green 0.1 % w/v + Sirius Red 0.2 % w/v in 1,3 % picric acid solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-&#945;SMA</td>
			<td>Mouse IgG2a 1A4</td>
			<td>Sigma A2547</td>
			<td>Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD34</td>
			<td>Mouse IgG1 HPCA1/763</td>
			<td>Novus Biologicals NBP2-44568</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-Cytokeratin 8/18</td>
			<td>Rabbit EP17/EP30</td>
			<td>Agilent IR09461-2</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD68</td>
			<td>Mouse KP1</td>
			<td>Abcam ab955</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-Desmin</td>
			<td>Rabbit Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen PA5-16705</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD4</td>
			<td>Mouse N1UG0</td>
			<td>Affymetrix 14-2444</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-FoxP3</td>
			<td>Rabbit 1054C</td>
			<td>R &#38; D MAB8214</td>
			<td>Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-MPO</td>
			<td>Goat Polyclonal</td>
			<td>R &#38; D Systems AF3667</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD3</td>
			<td>Rabbit SP7</td>
			<td>Abcam ab16669</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD8</td>
			<td>Mouse C8/144B</td>
			<td>Invitrogen 14-0085-80</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-mouse A488</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-21202</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-Rabbit A488</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-21206</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-goat A568</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-11057</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-rabbit A647</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-31573</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Rat anti-mouse IgG1 A647</td>
			<td>RMG1-1</td>
			<td>Biolegend 406618</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Goat anti-mouse IgG2a CF568</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Sigma Aldrich SAB4600315</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-mouse DyLight 755</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen SA5-10171</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-rabbit DyLight 755</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen SA5-10043</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SDS</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SDS001,500</td>
			<td>CAUTION, oral skin and eye toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shandon multi-program robotic slide stainer</td>
			<td>LabX</td>
			<td align="right">11384903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shandon Xylene Substitute,</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CA89413-336</td>
			<td>CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shaking water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SlowFade Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td align="right">1545801</td>
			<td>CAUTION, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stripping Buffer: mix 20 ml 10% w/v SDS with 12.5 ml 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), and 67.5 ml ultra-pure water. Under a fume hood, add 800 uL of 2-mercapto ethanol (114,4 mM final concentration)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-HCl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VIS Software</td>
			<td>Visiopharm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Whole slide scanner Olympus BX61VS</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Microscope: Olympus Slide Scanner BX61VS, 5 slides scanner, motorized stage, autofocus. Camera: Lightsource: Xcite-120. Filters: BrightLine&#174; Sedat filter set (# LED-DA/FI/TR/Cy5-4X4M-B-000, Semrock)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736-4L</td>
			<td>CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylene : Ethanol solution (1:1 v/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>CAUTION, harmful by ingestion, inhalation, fatal if sking absortion. Eye irritation. Use fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization, quantification, and mapping of immune cell populations in the tumor microenvironment

المشهد المناعي للبيئة الدقيقة للورم (TME) هو عامل حاسم في تطور السرطان والاستجابة للعلاج. على وجه التحديد ، فإن كثافة وموقع الخلايا المناعية في TME لها قيم تشخيصية وتشخيصية مهمة. وقد أدى التنميط متعدد المجالات للTME إلى زيادة فهمنا للعديد من الشبكات الخلوية والجزيئية التي تنظم بدء الورم وتطوره. ومع ذلك، لا توفر هذه التقنيات معلومات حول التنظيم المكاني للخلايا أو تفاعلات الخلية الخلية. هناك حاجة إلى تقنيات متعددة السهولة يمكن الحصول عليها بأسعار معقولة ومتاحة وسهلة التنفيذ تسمح بالاستبانة المكانية للخلايا المناعية في أقسام الأنسجة لاستكمال تقنيات الإنتاجية العالية القائمة على الخلايا الواحدة. هنا ، نحن نصف استراتيجية تدمج التصوير التسلسلي ، والوسم التسلسلي ، ومحاذاة الصورة لتوليد شرائح متعددة المعلمات الظاهرية من أقسام الأنسجة بأكملها. يتم تحليل الشرائح الظاهرية لاحقًا بطريقة تلقائية باستخدام بروتوكولات محددة من قبل المستخدم تمكن من تحديد مجموعات الخلايا ذات الأهمية وتقديرها الكمي وتعيينها. يتم تحليل الصورة ، في هذه الحالة باستخدام وحدات التحليل من حيث الأنسجة والمؤلف وHISTOmap. نقدم مثالاً حيث طبقنا هذه الاستراتيجية بنجاح على عينة سريرية واحدة، وتعظيم المعلومات التي يمكن الحصول عليها من عينات الأنسجة المحدودة وتوفير وجهة نظر غير متحيزة من TME في قسم الأنسجة بأكمله.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment at JoVE.com

Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment

هنا، نصف استراتيجية بسيطة ويمكن الوصول إليها لتصور وقياس ورسم خرائط الخلايا المناعية في أقسام أنسجة الورم المدمجة البارافين. تجمع هذه المنهجية بين تقنيات التصوير والتحليل الرقمي الحالية بهدف توسيع قدرة تعدد الإرسال وتحليل المعلمات المتعددة لفحوصات التصوير.

التصور، القياس الكمي، ورسم خرائط للخلايا المناعية في البيئة الدقيقة الورم

The immune landscape of the tumor microenvironment (TME) is a determining factor in cancer progression and response to therapy. Specifically, the density ...

التنظيم المكاني للخلايا المناعية في البيئة الدقيقة للورم له قيمة سريرية. يمكن استخدام هذه الاستراتيجية بسهولة لتصور الخلايا المناعية داخل أنسجة الورم وتحديدها وتحديدها ورسم خرائطها. وقد أحدث العلاج المناعي ثورة في علاج السرطان.ومع ذلك، ليس كل المرضى يستجيبون بشكل جيد. قد تعمل هذه الاستراتيجية على تحديد التواقيع المناعية للأنسجة التي يمكن أن تتنبأ باستجابة جيدة لمكافحة الورم. قبل إجراء تجربة، اختبار تركيبات الأجسام المضادة وتقنيات تجريد على الأنسجة التحكم والتحقق من أن APPs دقيقة في اكتشافها من علامات الفائدة.كما وصف مكتوب من أساليب تحليل الصور استخدام لغة التقنية المتطورة، والجمع بين النص والفيديو يسهل فهم أفضل وتكرار المنهجية. لاسترجاع مستضد من أقسام أنسجة الورم المضمنة في البرولين الثابتة ، غمر عينة الأنسجة dewaxed في جرة كوبلين من محلول استرجاع المستضد ووضع الجرة في طنجرة ضغط كهربائية تحتوي على مياه الصنبور. يجب أن لا يتجاوز مستوى المياه نصف ارتفاع الجرة حتى لا تختلط المياه مع محلول استرجاع المستضد.أغلق الغطاء وصمام الضغط على الطباخ وعالج الشرائح بضغط عال لمدة 10 دقائق. في نهاية العلاج، افصلي الطباخ، حرري الضغط، وافتحي الغطاء. بعد أن تبرد الشرائح في طنجرة لمدة 30 دقيقة، وغسل العينات مرتين لمدة خمس دقائق في برنامج تلفزيوني الطازجة لكل غسل في جرة كوبلين جديدة، ثم استخدام قلم الماء لرسم حاجز حول كل قسم الأنسجة.المقبل، غمر الشرائح في 0.1-الضرس الجليسين في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل شطف الشرائح مرتين في برنامج تلفزيوني كما هو موضح. بعد الغسيل الثاني، قم بنقل الشرائح إلى غرفة رطوبة وغطي كل قسم من الأنسجة بمحلول الحجب. بعد 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، شطف المقاطع مرتين لمدة خمس دقائق في برنامج تلفزيوني-توين الطازجة في غسل ثم إضافة الأجسام المضادة الأولية من الفائدة، المخفف في محلول حجب، إلى كل شريحة، محمية من الضوء.في نهاية الحضانة، شطف الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني-توين الطازجة لمدة خمس دقائق لكل غسل، ثم تسمية المقاطع مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، شطف الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني جديد-توين لمدة خمس دقائق لكل غسل. اتبع مع شطف واحد في الماء المقطر المزدوج.إزالة المياه الزائدة من كل شريحة وجبل الأنسجة مع تصاعد المتوسطة تستكمل مع DAPI وشريحة الغطاء. بعد الضغط على متوسطة التركيب الزائدة ، دع الشرائح تجف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء ، قبل الحصول على صور لجميع القنوات باستخدام ماسح ضوئي كامل الشريحة. بعد المسح الضوئي، افتح الصور في برنامج تحليل الصور وانقر فوق علامة التبويب محاذاة الأنسجة.لاستيراد الصور التي سيتم محاذاتها إلى حاوية الشرائح، حدد الصورة الأولى التي سيتم محاذاتها من قاعدة البيانات. عند تحميل كافة الصور، انقر فوق التالي في خطوات سير العمل لربط الصور وسحب كافة الصور وإفلاتها لمحاذاتها إلى الصورة الأولى. عندما يتم ربط جميع الصور حسب الاقتضاء، استخدم ما لا يقل عن ثلاثة دبابيس لكل صورة تشير إلى ميزات الأنسجة المتماثلة في الصور المرتبطة.استخدم دبوسًا لتتبع الصورة الأولى للتحقق من جودة المحاذاة الناتجة. إذا تم الحصول على محاذاة مرضية، انقر فوق التالي لعرض طبقات الصورة وحفظ الصورة المركبة في قاعدة البيانات. لإجراء الكشف عن الأنسجة باستخدام البروتوكول المحدد من قبل المستخدم APP 1، افتح علامة التبويب تحليل الصور وافتح الصورة المركبة في وحدة تحليل الصور.انقر فوق رمز APP فتح ثم حدد APP المناسبة. للتأكد من أن APP يعمل، انتقل إلى موقع نسيج محدد وانقر فوق معاينة. إذا كانت النتائج مرضية، انقر لمعالجة الصورة باستخدام APP المحدد.خلال المعالجة فإن APP تحديد ما إذا كان أو لم يكن ويرتبط بكسل مع الأنسجة للسماح لتحويل جميع وحدات البكسل المرتبطة الأنسجة إلى منطقة ذات فائدة. ويمكن بعد ذلك نقل المنطقة التي تم إنشاؤها حديثا من الفائدة إلى أي من الصور الانحياز. في نهاية التحليل، انقر فوق ملف وحفظ لحفظ الصورة المعدلة مع المنطقة التي تم إنشاؤها حديثا من الفائدة.لتجزئة الأنسجة إلى ستروما وparenchyma، افتح علامة التبويب تحليل الصورة وحدد الملفات ذات الأهمية من قاعدة البيانات. فتح APP 2، APP 2 يستخدم صورة PSR الملون لتجزئة الأنسجة. معاينة APP 2 عن طريق معالجة الصورة في حقل عرض محدد.إذا كانت النتائج مرضية، انقر فوق تشغيل لمعالجة APP 2 على الصورة الكاملة. وسيتم تقسيم المنطقة من الاهتمام من الأنسجة إلى ستروما وparenchyma وتحديد مناطق كل منها. المناطق التي تم إنشاؤها حديثا من الفائدة ل stroma وparenchyma يمكن نقلها إلى الصور الانحياز ، ثم تصدير وحفظ الصورة المعدلة كما هو موضح.لتحديد وقياس مجموعات الخلايا ذات الأهمية، قم باستيراد الصورة المجزأة ذات الأهمية في وحدة تحليل الصور. بعد ضبط اللون، افتح APP 3. سوف APP 3 الكشف عن مجموعات الخلايا ذات الاهتمام وقياسها ضمن parenchyma و stroma.إذا كانت النتائج مرضية، تشغيل APP 3 على الصورة الكاملة. سيتم تسمية جميع الخلايا الفردية ذات الاهتمام ، وإحداثيات الأنسجة المخزنة ، وتحديد كثافات الخلايا ذات الاهتمام في المناطق الستروما وparenchymal. يمكن بعد ذلك حفظ الصورة المعدلة كما هو موضح.لتنفيذ heatmapping الأنسجة من الخلايا من مصلحة الكائنات المسمى، افتح البروتوكول المناسب المعرفة من قبل المستخدم في إطار تحديد APP وانقر فوق تشغيل مطالبة APP لاستخدام إحداثيات الأجسام المسمى الأجسام المضادة لإنشاء مخطط الحرارة. مناطق الساخنة بقعة، أبرز باللون الأحمر، تحتوي على أعلى كثافة من السكان الخلية من الفائدة في حين أن المناطق الزرقاء الداكنة لديها أدنى. يمكن فرض خريطة الحرارة لصفة خلايا محددة على الصور المحاذية لتوفير معلومات إضافية حول كيفية تنظيم هذه الخلايا داخل البيئة الدقيقة للورم.ثم تصدير وحفظ خريطة حرارة الأنسجة. من المهم التحقق من خصوصية التسميات ودقة برامج العمل المصممة والكفاءة في إزالة البقع المختلفة الموجودة في نفس القسم وإعادة استخدامها. من خلال دمج التصوير التسلسلي ، والعلامات التسلسلية ، ومحاذاة الأنسجة ، يمكن تصور المزيد من العلامات في وقت واحد ويمكن استخراج المزيد من المعلومات من عينات سريرية محدودة.H & E تلطيخ أقسام أنسجة الورم اضمح يسمح تقييم بنية الأنسجة, مورفولوجيا الخلية, والمعلمات ذات الصلة سريريا مثل نوع الورم الخبيث, الصف الورم, والتسلل المناعي العام. يسمح تلطيخ CD34 باكتشاف الخلايا البطانية. Cytokeratin 8/18 تلطيخ يكشف عن وجود الخلايا الظهارية، ومكافحة ألفا العضلات الملساء تلطيخ العضلات يسمح بتحديد الخلايا الدهنية الليفية، تنشيط، خلايا الكبد.إعادة التنمّ مع الأجسام المضادة ضد CD68 و Desmin تسمح بالكشف عن الضامة و myofibroblasts على التوالي. لتوصيف أفضل تسلل الورم المناعي، تلطيخ لعلامات الخلية T و myeloperoxidase يمكن أن يؤديها. يمكن أيضا أن يتم تنفيذ بيكرو سيريوس الأحمر تلطيخ لتصور الكولاجين فيبريلار وتسهيل ستروما وتجزئة parenchyma.يمكن تحديد وحدات البكسل المرتبطة بالأنسجة داخل الأقسام الملطخة للسماح بتجزئة مقصورات مختلفة داخل منطقة معينة ذات أهمية. ويمكن بعد ذلك تحديد مجموعات الخلايا ذات الأهمية داخل كل منطقة، مما يسمح بتوليد خرائط للأنسجة يتم عرض المناطق ذات الكثافة العالية لخلايا معينة كنقاط ساخنة ومناطق ذات كثافة منخفضة نسبياً على أنها مناطق باردة. يمكن تكييف هذه المنهجية لتحديد الخلايا المناعية في عينات الأنسجة وتحديدها وتحديدها وتحديدها للتحقق من صحتها بالنسبة لأسئلة بحثية محددة وعلامة اهتمام.يمكن تطبيق هذه الاستراتيجية على صفائف صغيرة الأنسجة لتحليل الإنتاجية العالية. ويمكن أيضا أن يقترن بالتهجين في الموقع لفحص البروتين في الموقع والتعبير الجيني في آن واحد. لقد استخدمنا هذه الاستراتيجية لتحديد وخريطة الخلايا المنتجة IL-17A في الموقع في أنسجة الكبد الليفية من المرضى.وكما هو مبين في البروتوكول، فإن العديد من الكواشف خطرة كيميائياً وينبغي تنفيذ الإجراءات ذات الصلة في غطاء كيميائي باستخدام معدات الحماية والاحتياطات الشخصية المناسبة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

سبع خطوات لخلايا النجمية

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital تصوير الغدة الصعترية باستخدام الماوس 2 فوتون الميكروسكوب

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

الكمي للاستجابة انفجر الجهاز التنفسي باعتبارها مؤشر الفطري المناعي الصحة في الزرد

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

مقايسة على أساس CFSE لدراسة الهجرة من الجلد الفئران الخلايا الجذعية في تصريف الغدد الليمفاوية خلال العدوى مع<em&gt; المتفطرة البقرية</em&gt; عصيات كالميت غيران

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

إنتشار الجزيئي في أغشية البلازما الخلايا اللمفاوية الابتدائية تقاس الإسفار الارتباط الطيفي

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

موسع لأخذ العينات من السوائل البطانة المخاطية للتحديد الكمي للمناعة-الوسيط في فيفو مجرى الهواء العلوي في مستويات

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

التحديد الكمي افيروسيتوسيس بالفحص المجهري Fluorescence خلية واحدة

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

دراسة إيمونوهيستوباثولوجيك الشخصية بلعم بيتا مستقبلات حمض الفوليك والأوعية الدموية المكروية محصنة في الخلية العملاقة الدموية

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

تحليل تدفق Cytometric لتسلل الخلايا اللمفاوية في الجهاز العصبي المركزي أثناء التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...