Name: visualization, quantification, and mapping of immune cell populations in the tumor microenvironment
Uploaded: 2020-03-25T14:00:00
Duration: 11 min
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我们感谢研究参与者。我们感谢HBP生物库协调员路易丝·卢梭（LouiseRousseau）对组织样本和所有相关临床信息的恢复。我们感谢CRCHUM的分子病理学和细胞成像核心设施，以及维西奥普harm的迈克尔·佩尔施，以获得出色的技术援助。供资：这项研究得到了加拿大肝脏基金会、魁北克省艾滋病和传染病网络和加拿大丙型肝炎网络（加拿大艾滋病毒/C）的资助支持。CanHepC由加拿大卫生研究所（NHC-142832）和加拿大公共卫生局的一项联合倡议供资。M.F.M.从蒙特利尔大学、加布里埃尔·马奎斯大学和FRQS获得研究金。T.F. 获得CIHR和CanHepC的博士奖学金。S.T.在蒙特利尔大学肝胆和胰腺肿瘤外科担任罗杰-戴斯-格罗西尔斯讲座。
作者贡献：M.F.M.设计、执行实验和分析数据。T.F.设计了实验。A.C-B.提供技术指导。G.S.对研究对象进行了所有病理评估，并对所有病理方面提供了投入。L.M. 执行 H&E 染色、优化和进行图像采集。M.N.A. 执行 PSR 染色，并提供宝贵的技术投入。N.B. 对图像分析做出了贡献。S.T. 是 HBP 生物库的主要研究员，负责监督生物库的整体运行。他还就项目的各个方面及其临床影响提供了宝贵的投入。M.F.M，T.F.和N.H.S.构思和设计了这项研究。N.H.S.监督这项工作并获得了资金。M.F.M.，T.F.，A.C-B和N.H.S.写了手稿。所有作者审阅并批准了手稿。

从被切除的乙型肝炎病毒（HBV）相关的人类肝细胞癌的三个连续FFPE部分从蒙特利尔大学中心获得，从肝细胞细胞癌临床数据库和生物标本储存库（HBP生物库）。参与此组织库的患者提供了知情同意。这项研究得到机构道德操守委员会（第09.237号议定书）的批准，并根据《赫尔辛基宣言》进行。
1. 赫马托西林和欧辛（H&E）染色协议
注：H&E 染色由蒙特利尔大学中心中心（CRCHUM）的分子病理学核心设施使用 Shandon 多程序机器人滑动染色器使用以下程序进行。
<ol><li>对于去石蜡化，用二甲苯替代，将浸化幻灯片 3x，每次 2.5 分钟。 注意：二甲苯替代品是易燃的，皮肤刺激物，如果吸入有害。</li>
	<li>对于补液，将滑水浸入 100% 乙醇 3x 中，每次 2.5 分钟。在双蒸馏水（ddH2O）中洗涤1分钟以补充水分。</li>
	<li>在血氧林中孵育1分钟。在 ddH2O 中，每洗 3x 1 分钟。</li>
	<li>用 eosin 孵育 5 s。用95%乙醇清洗30s。用100%乙醇洗涤2x1分钟。 注意：乙醇是易燃的，刺激眼睛。欧辛是一种刺激眼睛的人。</li>
	<li>对于脱水，在二甲苯替代品中，每次浸入3倍，每次1.5分钟。手动安装幻灯片。 注： 执行协议的这一部分的估计时间为 30 分钟。</li>
</ol>2. FFPE 部分的多路免疫荧光染色方案
注：本议定书改编自罗伯逊等人17。
<ol><li>去水化和补液 注：在IHC或mIF对FFPE部分进行抗体介导标记之前，应去除石蜡。未能有效地去除石蜡会导致染色不理想。<ol>
<li>将 4 μm FFPE 组织部分滑入玻璃滑架。在烟罩下，将幻灯片浸入包含 37°C 预暖二甲苯的 Coplin 罐子中，浸泡 10 分钟。 注意：二甲苯是易燃的，皮肤刺激，吸入有害。</li>
		<li>每 2 分钟手动搅拌幻灯片 10 秒，在新鲜二甲苯中重复 1x，再搅拌 5 分钟。</li>
		<li>在化学罩中，按顺序将滑道浸入以下每个溶液中 5 分钟：1） 二甲苯：乙醇（1：1 v/v）;2） 100%乙醇;3） 70%乙醇;4） 50%乙醇;5） 30%乙醇;6） 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。 注： 将幻灯片保存在 PBS 中，直到准备好执行抗原检索。始终保持脱蜡部分水合。干燥会导致非特异性抗体结合，因此导致背景染色高。</li>
	</ol></li>
	<li>热诱导抗原检索 注：抗原可以在正式固定时被掩盖，防止抗体结合，从而进行可视化。使用抗原解构缓冲液和程序部分重建表象的原生构象，从而恢复抗体识别。抗原检索缓冲液的类型和持续时间应针对特定的测定条件（例如，靶向、抗体、组织等）进行优化。<ol>
<li>将脱蜡幻灯片浸入包含抗原检索溶液的 Coplin 罐子中（材料表中的配方）。</li>
		<li>将封闭的 Coplin 罐放入带自来水的电压力锅中。水位不应超过罐子高度的一半，以便水不会与抗原回收溶液混合。</li>
		<li>关闭炊具的盖子和压力阀。选择高压 10 分钟并开始。完成后，拔下炊具，释放压力，打开盖子，并将罐子放在炊具内30分钟，让滑片冷却。</li>
	</ol></li>
	<li>阻止非特定绑定<ol>
<li>将带幻灯片的机架传输到充满 PBS 的 Coplin 罐子。用PBS 2x 冲洗出抗原检索缓冲液，每次冲洗 5 分钟。</li>
		<li>用PAP笔包围组织部分，形成疏水屏障。将幻灯片浸入含有 0.1 M 甘氨酸的 COPlin 罐子中。在室温 （RT） 下孵育 15 分钟。 注：甘氨酸饱和抗原检索过程中产生的醛组。这些组可以结合原生和次要抗体，更具体地说。</li>
		<li>用PBS洗2x5分钟冲洗甘氨酸溶液。将滑板放入湿度室，并添加足够的阻塞溶液，以覆盖所有组织部分。避免溢出疏水屏障。在RT孵育30分钟。 注： 阻塞解决方案的配方可以在材料表中找到。阻断溶液应包含一种蛋白质（例如BSA），以阻止非特异性结合位点。它还可以加入像Triton X-100或Tween 20这样的洗涤剂，减少抗体和组织靶点之间的疏水性相互作用，从而使抗原识别更具选择性。从组织来自的物种中添加10%的总血清会阻断Fc受体，从而减少非特异性抗体结合。最后，从二次抗体的培养物种中加入10%的血清，将最大限度地减少继发抗体对组织部分的直接非特异性附着。</li>
	</ol></li>
	<li>免疫荧光标签<ol>
<li>用 PBS-Tween 冲洗 （0.1% v/v） 2x，每次 5 分钟，并将滑轨放回湿度室。</li>
		<li>在阻塞溶液中加入重新悬浮的原抗体的混合物。在4°C孵育过夜。本研究使用的主要和次要抗体列在材料表中。 注：原抗体的混合物应含有不同物种或同一物种的抗体，但含有不同的等号。有关本研究中使用的初级二次抗体对的列表，请参阅表 2。所用所有抗体的详细信息见材料表和表2。</li>
		<li>用 PBS-Tween 冲洗 （0.1% v/v） 3x 5 分钟，并将滑轨放回湿度室。在黑暗中，加入二次抗体的混合物，在RT孵育1小时。 注：当主要抗体来自不同物种时，应选择二次抗体，以便每个抗体只与一种主要抗体结合，而不是相互结合。这通常是通过使用在同一物种中产生的二次抗体来实现的，只要该物种不同于产生主要抗体的物种。如果主要抗体在同一物种中升高，但同类型不同，则应使用等等型特异性二次抗体。</li>
		<li>用 PBS-Tween 冲洗 （0.1% v/v） 3x，每次 5 分钟。用 ddH2O 冲洗，去除多余的液体，然后用 DAPI 安装在安装介质中。使用的卷取决于节的大小。通常 40 μL 足以覆盖常规显微镜幻灯片的表面。</li>
		<li>将盖滑到该部分，轻轻挤出多余的安装介质，避免气泡形成。让幻灯片在黑暗中在 RT 处干燥 20 分钟，并在 4°C 下储存，直到准备好采集。</li>
		<li>使用整个幻灯片扫描仪获取所有通道的图像（参见材料表）。 注：抗体被验证使用人类肝细胞癌组织作为积极的控制。对于每个原抗体，三个串行部分分别沾染了原抗体、等同型控制或仅阻塞溶液，在染色协议的其余部分没有变化。对获得的图像进行了比较，以确定染色的特异性。当与原抗体孵育的部分的信号具有预期模式且易于与背景区分时，染色被认为是具体的。在等型中提供高背景信号或标记组织成分且没有主要抗体部分的主要抗体被认为是非特异性。完成协议的这一部分的估计时间是 2 天。所需的控制包括：（1） 等体型控制，以建立主要抗体对背景信号的非特异性结合的贡献。一个部分被染色的方式与其他样本组织相同，只不过它与原抗体的等值和来源相同的抗体孵育，但针对组织部分所缺少的目标特异性。如果没有适当的等体对照抗体，则可以由主要抗体升高的同一物种的总IgG取代;（2） 无主要抗体控制（即阴性控制），以确定染色的特异性，并估计二次抗体的非特异性结合对背景信号的贡献。在这种情况下，控制部分与其他部分的染色方式相同，但未添加主抗体;（3） 积极控制，以确定染色工作。在这种情况下，染色是在已知表达原抗体识别的标记的组织部分上进行的。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 皮罗-天狼星红色 （PSR）/快速绿色染色协议
注：这种染色的目标是在FFPE组织部分可视化纤维蛋白原蛋白I和III。该协议改编自塞格纳尼等人18世。所有步骤均在化学罩中执行。
<ol><li>执行与 FFPE 部分的多路免疫荧光染色方案类似的组织部分的去石蜡化和补液（第 2.1 节）。 注：如果要染色的部分以前用于免疫荧光标记，并且石蜡已经去除，则去石蜡补水步骤可用于去除安装介质。DAPI 不会使用此过程删除，但它不会明显干扰 PSR 染色。</li>
	<li>将幻灯片浸入包含皮罗-天狼星红色/快速绿色溶液（材料表中的配方）的罐子中，在RT孵育30分钟（超过30分钟会导致肝细胞核的非特异性染色）。</li>
	<li>以 ddH2O（5 次浸渍）快速清洗滑轨。然后，在乙醇中快速洗涤100%（5浸）。用二甲苯-100%乙醇（1：1 v/v）清洗30 s。用二甲苯清洗30 s。在二甲苯完全蒸发之前安装安装介质（参见材料表），这有助于安装。 注： 执行协议的这一部分的估计时间为 1 小时。</li>
</ol>4. 从组织部分排泄抗体
注：为了在顺序标签测定中重复使用组织部分，需要完全去除原抗体和二级抗体。结合抗体被剥离，如先前描述的13。
将水浴预热至 56 °C。将部分放入装有剥离缓冲液的罐子内（材料表中的配方），关闭盖子，用石蜡薄膜胶带密封，以防止在晃动过程中泄漏。
<ol><li>将罐子放入水浴中，用搅拌孵育30分钟。</li>
	<li>在 RT 中，在 ddH2O 中，每冲洗 4x 15 分钟，使用 PBS-Tween 冲洗（0.1% v/v）。</li>
	<li>将部分水合在PBS-Tween或水中，直到准备好用第二轮原抗体重新探测该部分。 注： 执行协议的这一部分的估计时间为 2 小时。</li>
	<li>验证抗体洗脱程序的效率。 注：在顺序标签测定中使用抗体洗脱协议之前，应验证去除原抗体和二级抗体的效率。<ol>
<li>执行具有给定原发性抗体对感兴趣的部分的染色和图像采集，如 FFPE 部分的多路免疫荧光染色协议（第 2.1-2.4.6 节）所示。</li>
		<li>在图像采集时，执行第 4.1~4.3 节中所示的组织结合初级二次抗体复合物的洗脱。</li>
		<li>用步骤 2.4.3 中使用的相同二次抗体和相同的条件孵育该部分。</li>
		<li>执行 2.4.4~2.4.6 所示的洗涤、安装和图像采集步骤。</li>
		<li>并排比较剥离前后采集的图像，以确定特定信号是否已消失。 注：抗体去除前后图像的比较将验证洗脱程序的效率。但是，在所有通道中看到背景信号增加以及 DAPI 的扩散是正常的。这限制了可以在同一组织部分执行的剥离轮次数。三轮剥离似乎是最大的。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 图像采集
<ol><li>使用整个幻灯片扫描仪生成图像。</li>
	<li>使用 20x 0.75NA 目标镜头，分辨率为 0.3225 μm/像素。</li>
</ol>6. 图像分析
注： 此处概述的方法引用当前示例。请参阅表1和文本以适应其他特定示例。
<ol><li>使用图像分析软件的 Tissualign 模块（此协议中的 VIS，请参阅材料表）执行组织对齐。<ol>
<li>打开图像分析软件并单击组织对齐选项卡。</li>
		<li>通过访问文件将要对齐的图像导入幻灯片托盘 |数据库并选择要对齐的第一个图像。返回组织对齐选项卡，并通过单击幻灯片托盘中的"加载"按钮加载图像。图像将显示在幻灯片托盘和工作区中。 注：只有感兴趣的堆栈才应加载到幻灯片托盘中。</li>
		<li>重复步骤 6.1.2 对要对齐的顺序中的所有图像，逐个加载它们。将所有感兴趣的图像加载到幻灯片托盘上后，继续通过按功能区中的"工作流步骤"中的"下一步"来链接图像。</li>
		<li>接下来，在第一个图像顶部拖放第二个图像。第一和第二个图像现在链接。重复此步骤，以便以有序的方式逐个对齐其他图像。第一个图像的名称将更改，表示它已链接到其他图像。同时，链接的图像将显示在幻灯片托盘右侧的工作区中。</li>
		<li>此时，使用自动对齐、半自动对齐或手动对齐来对齐图像。最好先尝试自动对齐。要自动对齐，请按功能区中的工作流步骤（步骤 3）中的"下一步"按钮。</li>
		<li>通过导航组织的不同位置并直观地验证不同图像中的相应结构是否以相同的方式排列在图像的两个维度中，查看自动对齐。</li>
		<li>如果自动对齐的结果不令人满意，请使用引脚（每张图像至少使用三个针脚），指示链接图像中的同源组织特征。一旦引脚放置在链接图像中的同源位置，用户有两种选择：半自动对齐或手动对齐。对于半自动对齐，请单击基于色带中的当前定点自动对齐按钮。要手动对齐，请单击色带上"应用针脚"按钮。</li>
		<li>对对齐结果满意时，单击工作流步骤中的"下一步"按钮，并将复合图像保存在数据库中。 注：在显示的分析中，对齐跨越 11 个标记的六张幻灯片以及 H&E 和 PSR 图像需要 15 分钟。</li>
	</ol></li>
	<li>使用用户定义的协议分析协议包 1（APP 1，表 1）执行组织检测。<ol>
<li>单击功能区中的"图像分析"选项卡，打开软件的图像分析模块。</li>
		<li>通过访问文件导入复合（对齐）图像|数据库并选择感兴趣的图像，然后单击"图像分析"选项卡。</li>
		<li>通过单击"打开 APP"图标并选择要使用的分析协议包 （APP） 来打开 APP 选择对话框。在这种情况下，选择APP 1进行组织检测。</li>
		<li>打开 APP 1 后，通过前往选定的组织位置并单击"预览"按钮，确认 APP1 工作正常。如果结果令人满意，则转到下一步。</li>
		<li>单击以运行 APP 1 并使用所选 APP 处理图像。</li>
		<li>通过单击"文件/导出"完成分析时，导出数据（例如图像、测量值等）。 注：APP 1 创建一个感兴趣的区域 （ROI） 对组织 （ROI 组织） 进行划分并计算组织区域。</li>
		<li>通过访问文件，使用新创建的 ROI 保存修改后的图像|保存。 注：在所述图像分析站中，使用 APP 1 检测组织并创建 ROI 需要 5 分钟。处理的组织面积为3.2厘米2厘米。</li>
	</ol></li>
	<li>使用 APP 2（表 1）将组织分割到斯特罗马和帕伦奇马中。 注：APP 2 适用于预定义的 ROI 组织。APP 2 将组织分割成 ROIs 斯特罗马和帕伦奇马。<ol>
<li>单击功能区中的"图像分析"选项卡，打开图像分析模块。</li>
		<li>通过访问文件导入包含 ROI 组织的图像|数据库并选择保存在步骤 6.2.7 中的图像。返回"图像分析"选项卡，并通过单击幻灯片托盘中的"加载"按钮加载图像。图像将显示在幻灯片托盘和工作区中。</li>
		<li>使用 APP 选择对话框打开 APP 2，如 6.2.3 中。</li>
		<li>通过在选定的视图字段中处理来预览 APP 2。如果结果令人满意，请单击"运行"按钮在完整映像上运行 APP 2。作为 APP 2 的输出，ROI 组织在 ROIs 斯特罗马和帕伦奇马及其各自区域中进行了细分。导出结果为 6.2.6。将修改后的图像保存为 6.2.7 中。 注：在分析站中，使用APP 2分段斯特罗马和帕伦奇马的组织需要4小时。处理的组织面积为3.2厘米2厘米。</li>
	</ol></li>
	<li>使用用户定义的协议 APP 3（表 1）识别和量化 FoxP3hiCD4+ 单元。 注：APP 3 适用于预定义的 ROIs 斯特罗玛和帕伦奇马。<ol>
<li>打开图像分析模块并导入包含 ROIs 斯特罗玛和帕伦奇马的图像，如 6.3.1 和 6.3.2 所示。使用 APP 选择对话框打开 APP 3，如 6.2.3 中。</li>
		<li>在 FoxP3高CD4+ 单元格中丰富的选定视场中预览 APP 3 处理。如果结果令人满意，则在完整映像上运行 APP 3。作为 APP 3 的输出，所有单独的 FoxP3hiCD4+ 对象都将被标记并存储其组织坐标。将确定 ROIs 斯特罗马和帕伦奇马中的 FoxP3hiCD4+ 物体的密度。导出结果，如 6.2.6。</li>
		<li>对 FoxP3高CD4+ 标记对象执行组织热映射。<ol>
<li>使用 APP 选择对话框（如 6.2.3 中）打开用户定义的协议 FoxP3hiCD4+ MAP。 注：FoxP3hiCD4+ MAP 使用 FoxP3高CD4+ 标记对象的坐标来生成密度热图。使用 APP 3 识别和计数 FoxP3hiCD4+ 标记的对象在描述的图像分析站中花了 25 分钟。处理的组织面积为3.2厘米2厘米。</li>
			<li>通过按下"运行"按钮运行 FoxP3高CD4+ MAP。通过单击"文件" 导出组织热图|出口 |工作区。 注：使用 FoxP3高CD4+ MAP 映射 FoxP3hiCD4+ 标记对象，在描述的图像分析站中花了 5 分钟。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>识别并量化 CD8+、CD68+、MPO+、#SMA 和 CD34 + 对象，分别使用用户定义的协议 APP 4、APP5、APP6、APP7 和 APP 8（表 1），如第 6.4 节至 6.4.3.2 节中加载每个案例中感兴趣的 APP。 注：APAP 4 到 8 在预定义的 ROIs 斯特罗玛和帕伦奇马上工作。</li>
</ol>

<ol>
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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labeling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labeling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).</li><li>Segnani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+Detection+of+Collagen+Fibers+by+Sirius+Red/Fast+Green+Is+More+Sensitive+than+van+Gieson+or+Sirius+Red+Alone+in+Normal+and+Inflamed+Rat+Colon.">Histochemical Detection of Collagen Fibers by Sirius Red/Fast Green Is More Sensitive than van Gieson or Sirius Red Alone in Normal and Inflamed Rat Colon.</a> PloS One. 10 (12), 0144630 (2015).</li><li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Staining+by+Sequential+Immunostaining+and+Antibody+Removal+on+Routine+Tissue+Sections.">Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li></ol>

提交人声明没有利益冲突。

简单、方便且易于执行的复用技术，允许组织部分免疫细胞的空间分辨率，以绘制癌症和其他免疫性疾病的免疫景观图。在这里，我们描述了一个策略，它集成了广泛可用的标签和数字分析技术，以扩展成像测定的多路复用能力和多维评估12，13，17，19。12,13,17,19不同标记的三个串行部分的染色，以及通过剥离和重新探测技术重复使用部分，使我们能够可视化除 H&E 和 PSR 污渍之外的 11 个参数。使用组织对齐模块，以自动方式对齐这些部分的六幅图像。对于来自同一部分的图像，在单个单元级别进行对齐，对于来自相邻部分的图像，对齐高度一致。虚拟多路复用使我们能够确定一个节中可视化的标记如何与另一个连续部分中可视化的标记在空间上关联。虽然一些染色标记了 COIs，但其他标记了 TC，使我们能够量化不同 TC 中的 COIn。使用软件工具自动量化COI大大简化了图像的处理，加快了图像的处理。此外，数字分析应用于整个组织部分，而不是选定的视场，导致TME的无偏表示。此外，由于COI的组织坐标已经登记，因此可以生成组织热图。
此协议中有几个领域可能需要进行故障排除。首先，抗原检索不良会影响mIF的质量，因此抗原检索缓冲液的类型和持续时间应针对所使用的特定测定/生物标记条件进行优化。其次，使用的阻断溶液的类型应适应原发抗体和二级抗体的组织/抗原/种类。在我们手中，从组织来自阻塞的Fc受体的物种中加入10%的总血清，从而减少非特异性抗体结合。从培养的物种中加入10%的血清，将最大限度地减少继发抗体对组织部分的直接非特异性附着。第三，必须验证使用适当的正和负对照的初级和二级抗体的特异性。第四，某些通道的自荧光增加，在原抗体剥离时DAPI的扩散也很常见。为了解决增强的自荧光问题，我们使用的是特定信号的强度值至少是背景的5倍的初级/二次抗体对。最后，一些高亲和力抗体不能用常规剥离程序来洗脱。在这种情况下，我们建议在最后一轮的标签中使用此类抗体。用户可能必须尝试不同的染色序列，以找到感兴趣的抗体的最佳配置。在进行第二轮或第三轮贴标之前，应确认剥离效率。
这一策略的主要局限性和挑战是找到适合感兴趣的标记的初级和二次荧光抗体的正确组合。寻找不同物种或不同等值类型可同时使用的主要抗体受商业上可用物的限制。大多数滑扫描仪都配备了灯具和滤镜，允许成像最多五个通道，而正确的种类和右荧光的二次抗体并不总是可用的。我们使用串行染色和顺序标记部分克服了这些限制。可能需要测试几种抗体组合，以得出感兴趣的标记的最佳组合。另一个限制是 DAPI 染色的质量，因为剥离和重新探测可能并不总是允许执行核分割。
组织对齐模块需要最少的培训，无需用户编程技能。从理论上讲，该软件允许对无限数量的图像进行对齐。但是，精确对齐取决于各节的相关性，其中更紧密、组织学上一致的部分可以更准确地对齐。我们使用 VIS 的作者模块生成 AP。创建 ASP 需要图像分析的基本知识，但在使用任何其他图像分析软件时也是如此。与其他图像分析软件相比，VIS 的独特优势包括使用不同方法（例如 IF、组织化学、IHC）准备的部分图像自动对齐。这允许使用虚拟多路复用对多个感兴趣的标记进行共本地化研究。此外，ApP 的灵活且用户友好的设计允许用户特定的自定义。与通过目视检查进行手动计数相比，自动定量和映射以及处理整个组织部分的可能性可节省时间并减少偏差。
此策略是癌症和自身免疫背景下组织免疫学非常有用的研究工具，但临床使用仍未经过验证。通过额外的标准化和验证，它将来可用于多种应用（例如，绘制癌症的免疫环境图，以预测和监测对免疫治疗剂的反应）。它也可以适应不同的炎症条件（例如，炎症性肠病），将病理评估与预后生物标志物相结合。
该协议的主要关键步骤是标签的效率/特异性以及设计 AP 用于预期用途或生物标志物的鲁棒性。因此，通过目视检查进行定期验证至关重要，尤其是在设计新 APP 时。在同一部分上高效使用多轮剥离和重新探测或不同类型的污渍是关键成分，可以是组织或截面特定的。在进行大批量分析之前，验证此类流程的效率至关重要。
总之，我们提供一种策略，使从有价值的临床组织样本中获得的数量和空间信息最大化。实施这种方法所需的资源、设备和知识是可广泛获取的。我们建议使用这种方法作为规划旨在识别、量化和绘制 TME 中免疫细胞种群的检测的有用指南。

癌症的发展是恶性细胞和TME之间相互相互作用的多步骤过程的结果。除了肿瘤细胞，TME由非恶性细胞、基质细胞、免疫细胞群和细胞外基质（ECM）1组成。1肿瘤组织不同细胞和结构成分的空间组织，以及肿瘤与邻近非癌细胞之间的动态交换，最终调节肿瘤进展和对治疗的反应22、3、4。3,4研究表明，癌症的免疫反应是暂时调节的5，6。6不同的免疫细胞群渗入肿瘤病变和邻近组织，表现出独特的空间分布模式，与不同功能（例如，亲肿瘤与抗肿瘤）相关的激活和分化状态各不相同。这些不同的免疫种群及其参数与肿瘤和基质腔室共同进化。
允许单细胞多组学分析的技术的出现，使我们对调节致癌性和肿瘤进展的众多细胞和分子网络有了指数化的认识。然而，大多数基于单细胞的高通量分析工具需要组织中断和单细胞分离，导致细胞的空间组织和细胞-细胞相互作用7的信息丢失。由于 TME 中特定免疫细胞的位置和排列具有诊断和预后值，因此允许空间分辨率的技术是单细胞免疫分析技术的重要补充。
传统上，免疫组织化学 （IHC） 和多路免疫荧光 （mIF） 等成像技术仅限于少量可同时可视化的生物标志物。这种限制阻碍了对肿瘤渗透免疫细胞的时空动力学的研究，这些细胞通常由几个球形标记定义。成像和分析工具的最新进展扩大了多路复用的可能性。新的基于抗体的标签技术，如组织细胞学和成像质量细胞测量，已经用于空间分离多达12和32生物标志物，分别为88，9。9质谱成像是一种不需要贴标的技术，它有可能在单个组织第10、11,11节中同时成像数千个生物标志物。虽然这些技术已经显示出在解剖癌症组织免疫环境的巨大潜力，他们使用高度复杂和昂贵的设备和软件，并且不容易接触到大多数研究人员。
另外，传统的IHC和mIF的复用能力已经扩大，通过串行成像，连续轮标签，和光谱成像7,127，12，13，14，15，16。,13,14,15,16这些技术从相同或从串行组织部分生成多个图像，这些部分可以使用图像分析软件合并到虚拟多参数幻灯片中。因此，可同时可视化和分析的标记数量会增加。
在这里，我们提出了一种策略，使用商用试剂、经济实惠的显微镜设备和用户友好的软件合理设计组织多路复用测定（图1）。该方法集成了串行成像、顺序多路复用标记、整个组织成像和组织对齐，可生成虚拟多参数幻灯片，可用于组织部分免疫细胞的自动定量和映射。使用此策略，我们创建了一个虚拟幻灯片，包括 11 个生物标志物以及两个常用的组织学污渍：血红素和欧辛 （H&E） 和双红色 （PSR）。在不同的组织隔间中识别、定位和量化了多个免疫细胞群，并使用组织热图解决了其空间分布问题。此策略可最大化从有限的临床标本中获得的信息，适用于正式固定石蜡嵌入 （FFPE） 存档的组织样本，包括整个组织、核心针活检和组织微阵列。我们建议使用这种方法作为设计TME中免疫细胞群的定制检测的有用指南。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1419px;" width="1418">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:649px;">Antigen Retrieval Solution: Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% v/v Tween 20, pH 6.0)</td>
			<td style="width:257px;"></td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blocking Solution: 1 % BSA, 10 % filtered human serum, 10 % filtered donkey serum, 0.1 % Tween 20, and 0.3% Triton in PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>800-095-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coplin jars (EASYDIP SLIDE STAINING SYSTEM)</td>
			<td>Newcomersupply</td>
			<td>5300KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545E 22*50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Direct Red 80</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td align="right">365548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol 100%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electric pressure cooker</td>
			<td>Salton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eosin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td align="right">3801600</td>
			<td>CAUTION, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td>CAUTION, harmful by inhalation, ingestion and skin absortion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FFPE section (4&#956;m) slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycine 0,1 M in PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hematoxylin Stain Solution, Gil 1. Formulation, Regular Strength</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3535-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Holder (EasyDip Staining Jar Holder)</td>
			<td>Newcomersupply</td>
			<td>5300RK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td align="right">22210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Humidity chamber</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z670138-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pap pen</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS-Tween 20 (0.1% v/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Permount Mounting Media</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Picric Acid 1.3 %</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6744</td>
			<td>CAUTION, skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Picro-Sirius Red/Fast Green solution: Fast Green 0.1 % w/v + Sirius Red 0.2 % w/v in 1,3 % picric acid solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-&#945;SMA</td>
			<td>Mouse IgG2a 1A4</td>
			<td>Sigma A2547</td>
			<td>Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD34</td>
			<td>Mouse IgG1 HPCA1/763</td>
			<td>Novus Biologicals NBP2-44568</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-Cytokeratin 8/18</td>
			<td>Rabbit EP17/EP30</td>
			<td>Agilent IR09461-2</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD68</td>
			<td>Mouse KP1</td>
			<td>Abcam ab955</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-Desmin</td>
			<td>Rabbit Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen PA5-16705</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD4</td>
			<td>Mouse N1UG0</td>
			<td>Affymetrix 14-2444</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-FoxP3</td>
			<td>Rabbit 1054C</td>
			<td>R &#38; D MAB8214</td>
			<td>Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-MPO</td>
			<td>Goat Polyclonal</td>
			<td>R &#38; D Systems AF3667</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD3</td>
			<td>Rabbit SP7</td>
			<td>Abcam ab16669</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD8</td>
			<td>Mouse C8/144B</td>
			<td>Invitrogen 14-0085-80</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-mouse A488</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-21202</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-Rabbit A488</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-21206</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-goat A568</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-11057</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-rabbit A647</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-31573</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Rat anti-mouse IgG1 A647</td>
			<td>RMG1-1</td>
			<td>Biolegend 406618</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Goat anti-mouse IgG2a CF568</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Sigma Aldrich SAB4600315</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-mouse DyLight 755</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen SA5-10171</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-rabbit DyLight 755</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen SA5-10043</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SDS</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SDS001,500</td>
			<td>CAUTION, oral skin and eye toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shandon multi-program robotic slide stainer</td>
			<td>LabX</td>
			<td align="right">11384903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shandon Xylene Substitute,</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CA89413-336</td>
			<td>CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shaking water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SlowFade Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td align="right">1545801</td>
			<td>CAUTION, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stripping Buffer: mix 20 ml 10% w/v SDS with 12.5 ml 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), and 67.5 ml ultra-pure water. Under a fume hood, add 800 uL of 2-mercapto ethanol (114,4 mM final concentration)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-HCl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VIS Software</td>
			<td>Visiopharm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Whole slide scanner Olympus BX61VS</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Microscope: Olympus Slide Scanner BX61VS, 5 slides scanner, motorized stage, autofocus. Camera: Lightsource: Xcite-120. Filters: BrightLine&#174; Sedat filter set (# LED-DA/FI/TR/Cy5-4X4M-B-000, Semrock)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736-4L</td>
			<td>CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylene : Ethanol solution (1:1 v/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>CAUTION, harmful by ingestion, inhalation, fatal if sking absortion. Eye irritation. Use fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization, quantification, and mapping of immune cell populations in the tumor microenvironment

肿瘤微环境（TME）的免疫环境是癌症进展和治疗反应的决定性因素。具体来说，TME中免疫细胞的密度和位置具有重要的诊断和预后值。TME 的多光分析使我们对调节肿瘤启动和进展的众多细胞和分子网络有了指数化的认识。但是，这些技术不提供有关单元格的空间组织或细胞-细胞交互的信息。需要经济实惠、易于操作且易于执行的复用技术，该技术允许在组织部分中空间解析免疫细胞，以补充单一基于细胞的高通量技术。在这里，我们描述了一种策略，该策略集成了串行成像、顺序标记和图像对齐，以生成整个组织部分的虚拟多参数幻灯片。随后，使用用户定义的协议自动分析虚拟幻灯片，这些协议支持识别、量化和映射感兴趣的细胞群。在这种情况下，使用分析模块组织对齐、作者和 HISTOmap 进行图像分析。我们举了一个例子，我们成功地将这一策略应用于一个临床标本，最大限度地利用从有限组织样本获得的信息，并在整个组织部分提供 TME 的无偏见视图。

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Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment

在这里，我们描述了一种简单易懂的策略，用于在正式固定石蜡嵌入肿瘤组织部分中可视化、量化和映射免疫细胞。该方法将现有的成像和数字分析技术与扩展成像检测的多路复用能力和多参数分析相结合。

肿瘤微环境下免疫细胞种群的可视化、定量和映射

The immune landscape of the tumor microenvironment (TME) is a determining factor in cancer progression and response to therapy. Specifically, the density ...

肿瘤微环境免疫细胞的空间组织具有临床价值。此策略可以很容易地用于可视化、量化和映射肿瘤组织内的免疫细胞。免疫疗法彻底改变了癌症治疗。然而，并非所有患者反应良好。此策略可能有助于定义组织免疫特征，可以预测良好的抗肿瘤反应。在进行实验之前，在控制组织上测试抗体组合和剥离技术，并验证APP在检测感兴趣的标记时是否准确。由于图像分析方法的书面描述使用复杂的技术语言，因此将文本与视频相结合有助于更好地了解和复制该方法。用于甲醛固定、石蜡嵌入肿瘤组织部分的抗原检索，将露轴组织样本浸入COPlin抗原检索溶液罐中，将罐放入含有自来水的电压力锅中。水位不应超过罐的高度的一半，以便水不会与抗原检索溶液混合。关闭炊具上的盖子和压力阀，用高压处理滑梯 10 分钟。在治疗结束时，拔下炊具，释放压力，然后打开盖子。在炊具中冷却30分钟后，在新的Coplin罐子中每次洗涤，用新鲜PBS清洗样品两次，5分钟，然后用疏水笔在每个组织部分周围画一个屏障。接下来，将幻灯片浸入 PBS 中的 0.1 摩尔甘氨酸中，在室温下浸泡 15 分钟，然后将幻灯片在 PBS 中冲洗两次，如演示。第二次洗涤后，将幻灯片转移到湿度室中，并用阻截溶液覆盖每个组织部分。在室温下30分钟后，每次洗涤时用新鲜PBS-Tween冲洗两次，然后将感兴趣的主要抗体添加到每张幻灯片中，防止光线。在孵育结束时，每次洗涤用新鲜PBS-Tween冲洗幻灯片三次，每次洗涤五分钟，然后在室温下用适当的二次抗体标记部分一小时。在孵育结束时，在新鲜的PBS-Tween中冲洗幻灯片三次，每次洗涤五分钟。在双蒸馏水中进行单次冲洗。从每张幻灯片中去除多余的水，使用辅以 DAPI 和盖板幻灯片的安装介质安装组织。挤出多余的安装介质后，让幻灯片在室温下干燥 20 分钟，防止光线，然后使用全滑动扫描仪获取所有通道的图像。扫描后，打开图像分析软件中的图像，然后单击"组织"选项卡。要将要对齐的图像导入幻灯片纸盒，请选择要从数据库中对齐的第一个图像。加载所有图像后，单击"工作流"步骤中的"下一步"以链接图像，然后拖放所有要对齐的图像到第一个图像上。当所有图像都已酌情链接时，每个图像至少使用三个引脚，指示链接图像中的同源组织特征。使用图钉跟踪第一个图像，以检查生成的对齐质量。如果已获得满意的对齐方式，请单击"下一步"以查看图像图层并保存数据库中的复合图像。要使用用户定义的协议 APP 1 执行组织检测，请打开图像分析选项卡并在图像分析模块中打开复合图像。单击"打开 APP"图标并选择相应的 APP。要确认 APP 工作正常，请导航到选定的组织位置，然后单击"预览"。如果结果令人满意，请单击以使用所选的 APP 处理图像。在处理过程中，APP 将确定像素是否与组织关联，以允许将所有组织关联的像素转换为感兴趣的区域。然后，可以将新创建的感兴趣区域传输到任何对齐的图像。在分析结束时，单击"文件"和"保存"以将修改后的图像与新创建的兴趣区域一起保存。要将组织分割成频闪和帕伦奇玛，请打开"图像分析"选项卡，然后从数据库中选择感兴趣的文件。打开 APP 2，APP 2 使用 PSR 染色图像进行组织分割。通过处理选定视野中的图像来预览 APP 2。如果结果令人满意，请单击"运行"以处理完整图像上的 APP 2。组织感兴趣的区域将被分割成频闪和帕伦奇玛及其各自的区域确定。新创建的频闪和帕伦奇玛感兴趣区域可以传输到对齐的图像，然后导出并保存修改后的图像，如所示。要识别和量化感兴趣的细胞群，请将感兴趣的分段图像导入图像分析模块。调整颜色后，打开 APP 3。APP 3 将检测感兴趣的细胞群，并在帕伦奇玛和频闪内量化它们。如果结果令人满意，请对完整映像运行 APP 3。所有感兴趣的单个细胞将被标记，其组织坐标存储，并确定在频闪和帕伦奇体区域中感兴趣的细胞的密度。然后，可以像演示的一样保存修改后的图像。要对感兴趣的细胞标记对象执行组织热图，请打开 APP 选择窗口中的用户定义协议，然后单击"运行"以提示 APP 使用抗体标记对象的坐标生成热图。以红色突出显示的热点区域包含感兴趣的细胞群体密度最高，而深蓝色区域的密度最低。特定细胞群的热图可以叠加到对齐的图像上，以提供有关这些细胞如何在肿瘤微环境内组织的其他信息。然后导出并保存组织热图。验证标签的特异性、设计中的 AP 的准确性以及同一节上不同污渍的剥离和重新去除效率至关重要。通过集成串行成像、顺序标记和组织对齐，可以同时可视化更多的标记，并从有限的临床标本中提取更多信息。修复肿瘤组织部分的H&E染色允许评估组织结构、细胞形态和临床相关参数，如恶性肿瘤类型、肿瘤等级和整体免疫渗透。CD34染色允许检测内皮细胞。细胞蛋白8/18染色揭示了上皮细胞的存在，而抗阿尔法平滑肌肉活性素染色允许识别纤维化，激活，肝硬质细胞。与CD68和Desmin的抗体结合，分别允许检测巨噬细胞和肌纤维细胞。为了更好地描述肿瘤免疫渗透，可以进行T细胞标记物和血球细胞酶的染色。Picro 天狼星红色染色也可以进行可视化纤维胶原蛋白，并促进频闪和帕伦奇马分割。可以识别染色部分内与组织关联的像素，以便特定感兴趣区域内的不同隔离区进行分割。然后，可以在每个区域内确定感兴趣的细胞群，从而可以生成组织图，其中给定细胞群的高密度区域显示为热点，密度相对较低的区域显示为冷点。这种用于识别、量化和映射组织样本中免疫细胞的方法可以适应并验证特定的研究问题和感兴趣的标记。此策略可应用于组织微阵列，用于高通量分析。它也可以与原位杂交相结合，同时检查原位蛋白质和基因表达。我们利用这个策略从患者身上识别和映射IL-17A产生细胞的原位。如议定书所示，几种试剂具有化学危险性，应在化学罩中使用适当的个人防护装备和预防措施执行相关程序。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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科研

免疫与感染

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活体成像的鼠标使用2 - 光子显微镜的胸腺

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