Name: visualization, quantification, and mapping of immune cell populations in the tumor microenvironment
Uploaded: 2020-03-25T14:00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment at JoVE.com

Vi takker studiedeltageren. Vi takker Louise Rousseau, koordinator for HBP-biobanken for genvinding af vævsprøverne og alle tilknyttede kliniske oplysninger. Vi anerkender den molekylære patologi og celle imaging kernefaciliteter på CRCHUM og Michael Persch fra Visiopharm for fremragende teknisk bistand. Finansiering: Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Canadian Liver Foundation, Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS) AIDS and Infectious Disease Network (Réseau SIDA-MI) og Canadian Network on Hepatitis C (CanHepC). CanHepC er finansieret af et fælles initiativ fra den canadiske Institutes of Health Research (CIHR) (NHC-142832) og Public Health Agency of Canada. M.F.M. modtog stipendier fra Université de Montréal, Bourse Gabriel Marquis og FRQS. T.F. modtog ph.d.-stipendier fra CIHR og CanHepC. ST holder Roger-Des-Groseillers stol i hepatobiliary og pancreas onkologisk kirurgi, Université de Montréal.
Forfatterbidrag: M.F.M. designet, udført eksperimenter, og analyserede data. T.F. designede eksperimenter. A.C-B. teknisk vejledning. G.S. udførte alle de patologiske vurderinger af forsøgspersonen og gav input til alle de patologiske aspekter. L.M. udførte H&E-farvning, optimeret og udført billedanskaffelse. M.N.A. udførte PSR-pletten og leverede værdifulde tekniske input. N.B. bidrog til billedanalysen. S.T. er hovedinvestigator for HBP-biobanken og er ansvarlig for at føre tilsyn med biobankens samlede drift. Han gav også uvurderlige input om alle aspekter af projektet og dets kliniske konsekvenser. M.F.M. T.F., og N.H.S. konceptualiseret og designet undersøgelsen. N.H.S. overvågede arbejdet og opnåede finansiering. M.F.M., T.F., A.C-B og N.H.S. skrev manuskriptet. Alle forfattere gennemgik og godkendte manuskriptet.

<ol>
	<li>Greten, F. R., Grivennikov, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+Cancer:Triggers,+Mechanisms,+and+Consequences.">Inflammation and Cancer:Triggers, Mechanisms, and Consequences.</a> Immunity. 51 (1), 27-41 (2019).</li><li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+validation+of+the+consensus+Immunoscore+for+the+classification+of+colon+cancer:+a+prognostic+and+accuracy+study.">International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study.</a> Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).</li><li>Binnewies, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+tumor+immune+microenvironment+(TIME)+for+effective+therapy.">Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy.</a> Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).</li><li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+the+tumor+immune+microenvironment+for+staging+and+therapeutics.">Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics.</a> Modern Pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 31 (2), 214-234 (2018).</li><li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+dynamics+of+intratumoral+immune+cells+reveal+the+immune+landscape+in+human+cancer.">Spatiotemporal dynamics of intratumoral immune cells reveal the immune landscape in human cancer.</a> Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).</li><li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+introduction+of+the+'Immunoscore'+in+the+classification+of+malignant+tumours.">Towards the introduction of the 'Immunoscore' in the classification of malignant tumours.</a> The Journal of Pathology. 232 (2), 199-209 (2014).</li><li>Finotello, F., Eduati, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Omics+Profiling+of+the+Tumor+Microenvironment:+Paving+the+Way+to+Precision+Immuno-Oncology.">Multi-Omics Profiling of the Tumor Microenvironment: Paving the Way to Precision Immuno-Oncology.</a> Frontiers in Oncology. 8, 430 (2018).</li><li>Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histo-cytometry:+a+method+for+highly+multiplex+quantitative+tissue+imaging+analysis+applied+to+dendritic+cell+subset+microanatomy+in+lymph+nodes.">Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes.</a> Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).</li><li>Giesen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+imaging+of+tumor+tissues+with+subcellular+resolution+by+mass+cytometry.">Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry.</a> Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).</li><li>Porta Siegel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry+Imaging+and+Integration+with+Other+Imaging+Modalities+for+Greater+Molecular+Understanding+of+Biological+Tissues.">Mass Spectrometry Imaging and Integration with Other Imaging Modalities for Greater Molecular Understanding of Biological Tissues.</a> Molecular Imaging and Biology : MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 20 (6), 888-901 (2018).</li><li>Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry+Imaging:+A+Review+of+Emerging+Advancements+and+Future+Insights.">Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights.</a> Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).</li><li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype.">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).</li><li>Gendusa, R., Scalia, C. R., Buscone, S., Cattoretti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elution+of+High-affinity+(&gt;10-9+KD)+Antibodies+from+Tissue+Sections:+Clues+to+the+Molecular+Mechanism+and+Use+in+Sequential+Immunostaining.">Elution of High-affinity (&gt;10-9 KD) Antibodies from Tissue Sections: Clues to the Molecular Mechanism and Use in Sequential Immunostaining.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (7), 519-531 (2014).</li><li>van der Loos, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunoenzyme+staining:+methods+and+visualizations+for+the+observation+with+spectral+imaging.">Multiple immunoenzyme staining: methods and visualizations for the observation with spectral imaging.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 313-328 (2008).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labeling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labeling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).</li><li>Segnani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+Detection+of+Collagen+Fibers+by+Sirius+Red/Fast+Green+Is+More+Sensitive+than+van+Gieson+or+Sirius+Red+Alone+in+Normal+and+Inflamed+Rat+Colon.">Histochemical Detection of Collagen Fibers by Sirius Red/Fast Green Is More Sensitive than van Gieson or Sirius Red Alone in Normal and Inflamed Rat Colon.</a> PloS One. 10 (12), 0144630 (2015).</li><li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Staining+by+Sequential+Immunostaining+and+Antibody+Removal+on+Routine+Tissue+Sections.">Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Enkel, tilgængelig og nem at udføre multiplexing teknikker, der tillader rumlig opløsning af immunceller i væv sektioner er nødvendige for at kortlægge immunlandskabet i kræft og andre immunologiske lidelser. Her beskriver vi en strategi, der integrerer bredt tilgængelige mærknings- og digitale analyseteknikker for at udvide multiplexing-kapaciteten og flerdimensional vurdering af billeddiagtorer12,13,17,19. Farvning af tre serielle sektioner til forskellige markører, og genbrug af sektioner gennem stripning og reprobing teknikker, gjorde det muligt for os at visualisere 11 parametre ud over H & E og PSR pletter. Seks billeder fra disse sektioner blev justeret på en automatiseret måde ved hjælp af væv justering modul. Justeringen var præcis på det individuelle celleniveau for billeder, der stammer fra samme sektion og meget konkordans for billeder, der stammer fra tilstødende sektioner. Virtuel multipleksing gjorde det muligt for os at bestemme, hvordan markører visualiseret i en sektion relatererumsligt til markører visualiseret i en anden sammenhængende sektion. Mens nogle af de farvninger mærket COI'er, andre mærket TCs, giver os mulighed for at kvantificere cois i de forskellige tcs. Brugen af softwareværktøjer til automatiseret kvantificering af COI'er forenklede og fremskyndede i høj grad behandlingen af billeder. Desuden blev der anvendt digital analyse på hele vævssektioner i stedet for udvalgte synsfelter, hvilket resulterede i en upartisk repræsentation af TME. Da vævkoordinaterne for COI'er blev registreret, var det desuden muligt at generere vævsheatmaps.
Der er flere områder i denne protokol, hvor der kan være behov for fejlfinding. For det første kan dårlig antigenudtagning påvirke kvaliteten af mIF, og typen af antigenudtagningsbuffer og varighed bør derfor optimeres for de specifikke assay-/biomarkørbetingelser, der anvendes. For det andet bør den anvendte type blokeringsopløsning tilpasses væv/antigen/arter af primære og sekundære antistoffer. I vores hænder, tilsætning af 10% samlede serum fra de arter, hvor vævet kommer fra blokerede Fc receptorer, og dermed reduceret uspecifik antistof bindende. Tilsætning af 10% serum fra arten de sekundære antistoffer blev rejst i ville minimere direkte uspecifik fastgørelse af sekundære antistoffer til vævssektionen. For det tredje er det vigtigt at validere de primære og sekundære antistoffers specificitet ved hjælp af de korrekte positive og negative kontroller. For det fjerde er øget autofluorescens i nogle kanaler og diffusion af DAPI ved primær antistofstripning også almindelig. For at løse den forbedrede autofluorescens brugte vi primære/sekundære antistofpar, hvor det specifikke signal havde intensitetsværdier mindst 5x baggrundsværdien. Endelig kan nogle højaffinitet antistoffer ikke elueres med regelmæssige stripping procedurer. I dette tilfælde anbefaler vi at bruge sådanne antistoffer i den sidste runde af mærkning. Brugeren kan have til at prøve forskellige farvning sekvenser for at finde den optimale konfiguration for antistoffer af interesse. Effektiviteten af stripningbør bekræftes, før der går videre til en anden eller tredje runde af mærkningen.
Den største begrænsning og udfordring ved denne strategi er at finde de rigtige kombinationer af primære og sekundære fluorescerende antistoffer til markører af interesse. At finde primære antistoffer, der er opdrættet i forskellige arter eller med forskellige isotyper, og som kan anvendes samtidigt, begrænses af, hvad der er kommercielt tilgængeligt. De fleste hele diasscannere er udstyret med lamper og filtre, der tillader billeddannelse maksimalt fem kanaler, og sekundære antistoffer i den rigtige art og højre fluorophore er ikke altid tilgængelige. Vi overvandt delvist disse begrænsninger ved hjælp af serielle farvninger og sekventiel mærkning. Det kan være nødvendigt at teste flere antistofkombinationer for at nå frem til den bedste kombination for de markører, der er interessante. En anden begrænsning er kvaliteten af DAPI farvning, fordi stripning og reprobing ikke altid tillader at udføre kerner segmentering.
Vævet tilpasse modul kræver minimal uddannelse og ingen programmering færdigheder fra brugerne. Softwaren teoretisk tillader tilpasning af et ubegrænset antal billeder. Men præcis tilpasning afhænger af beslægtede sektioner, hvor tættere sektioner, der er mere histologisk konkordans er mere præcist afstemt. Vi brugte author-modulet i VIS til at generere ApPs. Grundlæggende viden om billedanalyse er nødvendig for at skabe APPs, men det er også tilfældet, når du bruger andre billedanalyse software. De unikke fordele ved VIS i forhold til andre billedanalysesoftware omfatter automatiseret justering af billeder fra sektioner, der er udarbejdet ved hjælp af forskellige metoder (f.eks. Dette giver mulighed for colocalization undersøgelser af flere markører af interesse ved hjælp af virtuelle multiplexing. Desuden giver det fleksible og brugervenlige design af AOP'er mulighed for brugerspecifik tilpasning. Automatiseret kvantificering og kortlægning, og muligheden for behandling af hele vævsektioner, sparer tid og reducerer bias sammenlignet med manuel optælling ved visuel inspektion.
Denne strategi er et meget nyttigt forskningsværktøj til vævimmunologi i forbindelse med kræft og autoimmunitet, men forbliver ikke valideret til klinisk brug. Med yderligere standardisering og validering, kan det bruges i fremtiden til flere anvendelser (f.eks at kortlægge immunlandskabet i kræft til at forudsige og overvåge reaktionen på immunterapeutiske midler). Det kan også tilpasses forskellige inflammatoriske tilstande (f.eks. inflammatorisk tarmsygdom) for at kombinere patologisk evaluering med prognostiske biomarkører.
De vigtigste kritiske trin i denne protokol er mærkningens effektivitet/specificitet og de konstruerede AOP'ers robusthed til den tilsigtede anvendelse eller biomarkør. Derfor er regelmæssig validering ved visuel inspektion, især ved at designe en ny APP, afgørende. Effektiv brug af flere runder af stripning og reprobing eller forskellige typer af pletter på samme sektion er kritiske komponenter og kan være væv eller afsnit specifikke. Det er vigtigt at kontrollere effektiviteten af sådanne processer, før du fortsætter med en stor batchanalyse.
Sammenfattende giver vi en strategi, der maksimerer de kvantitative og rumlige oplysninger, der kan opnås fra værdifulde kliniske vævsprøver. De ressourcer, det udstyr og den viden, der er nødvendig for at gennemføre denne metode, er bredt tilgængelige. Vi foreslår denne metode som en nyttig vejledning til planlægning af analyser, der har til formål at identificere, kvantificere og kortlægge immuncellepopulationer i TME.

Kræft udvikling er resultatet af en multistep proces, der involverer gensidige interaktioner mellem maligne celler og TME. Andre end tumorceller, TME er sammensat af nonmaligne celler, stromale celler, immuncellepopulationer, og ekstracellulære matrix (ECM)1. Den rumlige organisation af de forskellige cellulære og strukturelle komponenter i tumorvævet og den dynamiske udveksling mellem kræft og tilstødende ikke-kræftceller i sidste ende modulere tumor progression og respons på terapi2,3,4. Det har vist sig, at immunresponset i kræft er spatiotemporally reguleret5,6. Forskellige immuncellepopulationer, der infiltrerer den neoplastiske læsion og det tilstødende væv, udviser karakteristiske rumlige fordelingsmønstre og forskellige aktiverings- og differentieringstilstande forbundet med forskellige funktioner (f.eks. pro- versus antitumor). Disse forskellige immunpopulationer og deres parametre skaber overarbejde med tumoren og de stromale rum.
Fremkomsten af teknologier, der tillader encellede multiomics profilering har eksponentielt øget vores forståelse af de mange cellulære og molekylære netværk, der regulerer carcinogenese og tumor progression. De fleste analyseværktøjer med høj gennemløb kræver imidlertid vævsforstyrrelser og isolation af en enkelt celle, hvilket resulterer i tab af oplysninger om den rumlige organisation af celler og cellecelleinteraktioner7. Da placeringen og placeringen af specifikke immunceller i TME har diagnostisk og prognostisk værdi, er teknologier, der muliggør rumlig opløsning, et vigtigt supplement til encellede immunprofileringsteknikker.
Traditionelt har billeddannelsesteknikker som immunhistokemi (IHC) og multiplex immunfluorescens (mIF) været begrænset til et lille antal biomarkører, der kan visualiseres samtidigt. Denne begrænsning har hæmmet studiet af spatiotemporal dynamik tumor-infiltrerende immunceller, som typisk er defineret af flere fænotypiske markører. De seneste fremskridt inden for billedbehandling og analytiske værktøjer har udvidet mulighederne for multipleksing. Nye antistofbaserede mærkningsteknologier som histocytometri og billeddannelse af massecytometri er blevet anvendt til rumligt at adskille op til henholdsvis 12 og 32 biomarkører, henholdsvis 8,9. Massespektrometri imaging, en teknik, der ikke kræver mærkning, har potentiale til at billedet tusindvis af biomarkører samtidigt i et enkelt væv afsnit10,11. Selv om disse teknikker allerede har vist et stort potentiale for at dissekere vævsimmunlandskabet i kræft, bruger de meget sofistikeret og dyrt udstyr og software og er ikke umiddelbart tilgængelige for de fleste forskere.
Alternativt er multipleksing evnen til traditionelle IHC og mIF blevet udvidet ved hjælp af seriel billeddannelse, sekventielle runder af mærkning, og spektral billeddannelse7,12,13,14,15,16. Disse teknikker genererer flere billeder fra samme eller fra seriel væv sektioner, der kan konsolideres i virtuelle multiparameter dias ved hjælp af billedanalyse software. Derfor øges antallet af markører, der kan visualiseres og analyseres samtidigt.
Her foreslår vi en strategi for rationel tæring af vævsmultiplex-analyser ved hjælp af kommercielt tilgængelige reagenser, kopiudstyr til overkommelige beløb og brugervenlig software (figur 1). Denne metode integrerer seriel billeddannelse, sekventiel multiplex mærkning, hele væv simaging, og væv tilpasning til at generere virtuelle multiparameter dias, der kan bruges til automatiseret kvantificering og kortlægning af immunceller i væv sektioner. Ved hjælp af denne strategi, skabte vi en virtuel dias bestående af 11 biomarkører plus to hyppigt anvendte histologiske pletter: hematoxylin og eosin (H & E) og picrosirius rød (PSR). Flere immuncellepopulationer blev identificeret, placeret og kvantificeret i forskellige vævsrum, og deres rumlige fordeling blev løst ved hjælp af vævsheatmaps. Denne strategi maksimerer de oplysninger, der kan opnås fra begrænsede kliniske prøver og gælder for formalin-faste paraffin-indlejrede (FFPE) arkiverede vævsprøver, herunder hele væv, kernenålbiopsier, og vævsmikroarrays. Vi foreslår denne metode som en nyttig vejledning til at designe brugerdefinerede analyser til identifikation, kvantificering og kortlægning af immuncellepopulationer i TME.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1419px;" width="1418">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:649px;">Antigen Retrieval Solution: Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% v/v Tween 20, pH 6.0)</td>
			<td style="width:257px;"></td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blocking Solution: 1 % BSA, 10 % filtered human serum, 10 % filtered donkey serum, 0.1 % Tween 20, and 0.3% Triton in PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>800-095-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coplin jars (EASYDIP SLIDE STAINING SYSTEM)</td>
			<td>Newcomersupply</td>
			<td>5300KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545E 22*50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Direct Red 80</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td align="right">365548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol 100%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electric pressure cooker</td>
			<td>Salton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eosin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td align="right">3801600</td>
			<td>CAUTION, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td>CAUTION, harmful by inhalation, ingestion and skin absortion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FFPE section (4&#956;m) slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycine 0,1 M in PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hematoxylin Stain Solution, Gil 1. Formulation, Regular Strength</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3535-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Holder (EasyDip Staining Jar Holder)</td>
			<td>Newcomersupply</td>
			<td>5300RK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td align="right">22210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Humidity chamber</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z670138-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pap pen</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS-Tween 20 (0.1% v/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Permount Mounting Media</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Picric Acid 1.3 %</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6744</td>
			<td>CAUTION, skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Picro-Sirius Red/Fast Green solution: Fast Green 0.1 % w/v + Sirius Red 0.2 % w/v in 1,3 % picric acid solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-&#945;SMA</td>
			<td>Mouse IgG2a 1A4</td>
			<td>Sigma A2547</td>
			<td>Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD34</td>
			<td>Mouse IgG1 HPCA1/763</td>
			<td>Novus Biologicals NBP2-44568</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-Cytokeratin 8/18</td>
			<td>Rabbit EP17/EP30</td>
			<td>Agilent IR09461-2</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD68</td>
			<td>Mouse KP1</td>
			<td>Abcam ab955</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-Desmin</td>
			<td>Rabbit Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen PA5-16705</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD4</td>
			<td>Mouse N1UG0</td>
			<td>Affymetrix 14-2444</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-FoxP3</td>
			<td>Rabbit 1054C</td>
			<td>R &#38; D MAB8214</td>
			<td>Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-MPO</td>
			<td>Goat Polyclonal</td>
			<td>R &#38; D Systems AF3667</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD3</td>
			<td>Rabbit SP7</td>
			<td>Abcam ab16669</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD8</td>
			<td>Mouse C8/144B</td>
			<td>Invitrogen 14-0085-80</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-mouse A488</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-21202</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-Rabbit A488</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-21206</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-goat A568</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-11057</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-rabbit A647</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-31573</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Rat anti-mouse IgG1 A647</td>
			<td>RMG1-1</td>
			<td>Biolegend 406618</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Goat anti-mouse IgG2a CF568</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Sigma Aldrich SAB4600315</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-mouse DyLight 755</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen SA5-10171</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-rabbit DyLight 755</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen SA5-10043</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SDS</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SDS001,500</td>
			<td>CAUTION, oral skin and eye toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shandon multi-program robotic slide stainer</td>
			<td>LabX</td>
			<td align="right">11384903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shandon Xylene Substitute,</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CA89413-336</td>
			<td>CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shaking water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SlowFade Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td align="right">1545801</td>
			<td>CAUTION, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stripping Buffer: mix 20 ml 10% w/v SDS with 12.5 ml 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), and 67.5 ml ultra-pure water. Under a fume hood, add 800 uL of 2-mercapto ethanol (114,4 mM final concentration)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-HCl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VIS Software</td>
			<td>Visiopharm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Whole slide scanner Olympus BX61VS</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Microscope: Olympus Slide Scanner BX61VS, 5 slides scanner, motorized stage, autofocus. Camera: Lightsource: Xcite-120. Filters: BrightLine&#174; Sedat filter set (# LED-DA/FI/TR/Cy5-4X4M-B-000, Semrock)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736-4L</td>
			<td>CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylene : Ethanol solution (1:1 v/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>CAUTION, harmful by ingestion, inhalation, fatal if sking absortion. Eye irritation. Use fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization, quantification, and mapping of immune cell populations in the tumor microenvironment

Immunlandskabet i tumormikromiljøet (TME) er en afgørende faktor i kræftprogression og respons på terapi. Specifikt har tætheden og placeringen af immunceller i TME vigtige diagnostiske og prognostiske værdier. Multiomic profilering af TME har eksponentielt øget vores forståelse af de mange cellulære og molekylære netværk, der regulerer tumor indledning og progression. Disse teknikker indeholder dog ikke oplysninger om den rumlige organisation af celler eller cellecelleinteraktioner. Overkommelige, tilgængelige og nemme at udføre multiplexing teknikker, der tillader rumlig opløsning af immunceller i væv sektioner er nødvendige for at supplere encellede high-throughput teknologier. Her beskriver vi en strategi, der integrerer seriel billedbehandling, sekventiel mærkning og billedjustering for at generere virtuelle multiparameterdias af hele vævssektioner. Virtuelle slides analyseres efterfølgende på en automatiseret måde ved hjælp af brugerdefinerede protokoller, der muliggør identifikation, kvantificering og kortlægning af cellepopulationer af interesse. Billedet analyse er gjort, i dette tilfælde ved hjælp af analysemoduler Tissuealign, Forfatter, og HISTOmap. Vi præsenterer et eksempel, hvor vi anvendte denne strategi med succes til en klinisk prøve, maksimere de oplysninger, der kan opnås fra begrænsede vævsprøver og giver et upartisk billede af TME i hele vævssektionen.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment at JoVE.com

Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment

Her beskriver vi en enkel og tilgængelig strategi for visualisering, kvantificering og kortlægning af immunceller i formalin-faste paraffin-indlejrede tumorvævsektioner. Denne metode kombinerer eksisterende billedbehandlings- og digitale analyseteknikker med det formål at udvide multipleksingkapaciteten og multiparameteranalysen af billeddiagnostiske analyser.

Visualisering, kvantificering og kortlægning af immuncellepopulationer i tumormikromiljøet

The immune landscape of the tumor microenvironment (TME) is a determining factor in cancer progression and response to therapy. Specifically, the density ...

Den rumlige organisering af immuncellerne i tumormikromiljø har klinisk værdi. Denne strategi kan nemt bruges til at visualisere, kvantificere og kortlægge immunceller i tumorvæv. Immunterapi har revolutioneret kræftbehandling.Men ikke alle patienter reagerer godt. Denne strategi kan tjene til at definere væv-immune signaturer, der kan forudsige en god anti-tumor respons. Før der udføres et eksperiment, testes antistofkombinationerne og strippingteknikkerne på kontrolvæv, og det kontrolleres, at AP'erne er korrekte til påvisning af interessemarkører.Som skriftlige beskrivelser af billedanalyse metoder bruger sofistikeret teknisk sprog, kombinere tekst med video letter en bedre forståelse og replikering af metoden. For antigen hentning af formalin-faste, paraffin-indlejret tumorvæv sektioner, nedsænkes dewaxed vævsprøve i en Coplin krukke med antigen hentning løsning og placere krukken i en elektrisk trykkoger, der indeholder postevand. Vandstanden må ikke overstige halvdelen af glassets højde, så vandet ikke blandes med antigenudtagningsopløsningen.Luk låget og trykventilen på komfuret og behandl rutsjebanerne med højt tryk i 10 minutter. Ved afslutningen af behandlingen skal du tage stikket ud af stikkontakten, slippe trykket og åbne låget. Når objektglassene er afkølet i komfuret i 30 minutter, vaskes prøverne to gange i fem minutter i frisk PBS pr. vask i en ny Coplin-krukke, og brug derefter en hydrofob pen til at tegne en barriere omkring hver vævssektion.Dernæst nedsænkes rutsjebanerne i 0,1-molarglycin i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur, før du skyller objektglassene to gange i PBS som påvist. Efter den anden vask overføres objektglassene til et fugtighedskammer og dækker hver vævssektion med blokerende opløsning. Efter 30 minutter ved stuetemperatur skylles sektionerne to gange i fem minutter i frisk PBS-Tween pr. vask, hvorfra de primære relevante antistoffer, fortyndet i blokerende opløsning, til hvert dias, der er beskyttet mod lys.Ved inkubationens afslutning skylles objektglassene tre gange i frisk PBS-Tween i fem minutter pr. vask, hvor sektionerne mærkes med de relevante sekundære antistoffer i en time ved stuetemperatur. Ved inkubationens afslutning skylles objektglassene tre gange i frisk PBS-Tween i fem minutter pr. vask. Følg med en enkelt skylning i dobbeltdestilleret vand.Fjern det overskydende vand fra hvert dias og montere væv med montering medium suppleret med DAPI og et dæksel dias. Efter at have presset det overskydende monteringsmedium ud, skal du lade objektglassene tørre i 20 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys, før du anskaffer billeder til alle kanaler ved hjælp af en helsinglescanner. Efter scanning skal du åbne billederne i billedanalysesoftwaren og klikke på fanen Vævsjustering.Hvis du vil importere de billeder, der skal justeres i slidebakken, skal du vælge det første billede, der skal justeres fra databasen. Når alle billederne er indlæst, skal du klikke på Næste i trinnene Arbejdsproces for at sammenkæde billederne og trække og slippe alle de billeder, der skal justeres, til det første billede. Når alle billederne er blevet sammenkædet efter behov, skal du bruge mindst tre ben pr. billede, der angiver homologe vævsfunktioner i de sammenkædede billeder.Brug en nål til at spore det første billede for at kontrollere kvaliteten af den resulterende justering. Hvis der er opnået en tilfredsstillende justering, skal du klikke på Næste for at få vist billedlagene og gemme det sammensatte billede i databasen. Hvis du vil udføre en vævsdetektering ved hjælp af den brugerdefinerede protokol APP 1, skal du åbne fanen Billedanalyse og åbne det sammensatte billede i billedanalysemodulet.Klik på ikonet Åbn APP, og marker den relevante APP. Hvis du vil bekræfte, at APPEN fungerer, skal du gå til en valgt vævsplacering og klikke på Eksempel. Hvis resultaterne er tilfredsstillende, skal du klikke for at behandle billedet ved hjælp af den valgte APP.Under behandlingen vil APP afgøre, om pixlen er forbundet med vævet for at tillade konvertering af alle vævsrelaterede pixel til et område af interesse. Den nyoprettede region af interesse kan derefter overføres til nogen af de justerede billeder. I slutningen af analysen skal du klikke på Filer og Gem for at gemme det ændrede billede med det nyoprettede interesseområde.For segmentering af vævet i stroma og parenkym skal du åbne fanen Billedanalyse og vælge de filer af interesse fra databasen. Åben APP 2, APP 2 bruger PSR-farvede billede til væv segmentering. Eksempel på APP 2 ved at behandle billedet i et markeret synsfelt.Hvis resultaterne er tilfredsstillende, skal du klikke på Kør for at behandle APP 2 på det fulde billede. Vævsregionen vil blive opdelt i stroma og parenkym, og deres respektive områder vil blive fastlagt. De nyoprettede regioner af interesse for stroma og parenkym kan overføres til de justerede billeder, derefter eksportere og gemme det ændrede billede som påvist.Hvis du vil identificere og kvantificere cellepopulationer af interesse, skal du importere det segmenterede billede af interesse til billedanalysemodulet. Når du har justeret farven, skal du åbne APP 3. APP 3 vil detektere cellepopulationer af interesse og kvantificere dem inden for parenkym og stroma.Hvis resultaterne er tilfredsstillende, skal du køre APP 3 på det fulde billede. Alle de enkelte celler af interesse vil blive mærket, deres væv koordinater gemt, og tætheden af celler af interesse i stroma og parenkymale regioner bestemmes. Det ændrede billede kan derefter gemmes som vist.Hvis du vil udføre vævsoprulning af de interessecelleobjekter, skal du åbne den relevante brugerdefinerede protokol i app-valgvinduet og klikke på Kør for at bede APP'en om at bruge koordinaterne for de antistofmærkede objekter til at generere varmekortet. Hot spot områder, fremhævet med rødt, indeholder den højeste tæthed af celle befolkning af interesse, mens de mørkeblå områder har den laveste. Varmekortet over en bestemt cellepopulation kan overlejres på de justerede billeder for at give yderligere oplysninger om, hvordan disse celler er organiseret i tumormikromiljøet.Derefter eksportere og gemme væv varme kort. Det er afgørende at kontrollere mærkningens specificitet, nøjagtigheden af de designede APPs og stripnings- og reprobingeffektiviteten af de forskellige pletter på samme sektion. Ved at integrere seriel billeddannelse, sekventiel mærkning og vævsjustering kan flere markører visualiseres samtidigt, og flere oplysninger kan udtrækkes fra begrænsede kliniske prøver.H & E farvning af resected tumorvæv sektioner tillader evaluering af væv arkitektur, celle morfologi, og klinisk relevante parametre såsom typen af malignitet, tumor kvalitet, og samlede immun infiltration. CD34 farvning gør det muligt at detektionere endotelceller. Cytokeratin 8/18 farvning afslører tilstedeværelsen af epitelceller, og anti-alpha glat muskel actin farvning tillader identifikation af fibrogenic, aktiveret, hepatisk stellate celler.Reprobing med antistoffer mod CD68 og Desmin tillader påvisning af makrofager og myofibroblaster henholdsvis. For bedre at karakterisere tumor-immune infiltrere, farvning for T-celle markører og myeloperoxidase kan udføres. Picro Sirius Rød farvning kan også udføres for at visualisere fibrillar kollagen og for at lette stroma og parenkym segmentering.Vævsrelaterede pixel i de farvede sektioner kan identificeres for at muliggøre segmentering af forskellige rum inden for et bestemt område af interesse. De cellepopulationer af interesse kan derefter identificeres inden for hver region, så generering af vævskort, for hvilke regioner med høj tæthed for en given cellepopulation vises som hotspots og regioner med en relativt lav tæthed, vises som kolde pletter. Denne metode til identifikation, kvantificering og kortlægning af immunceller i vævsprøver kan tilpasses og valideres for specifikke forskningsspørgsmål og interessemarkør.Denne strategi kan anvendes på væv mikro arrays for høj gennemløbsanalyse. Det kan også kombineres med in situ hybridisering til samtidig at undersøge in situ protein og genekspression. Vi har brugt denne strategi til at identificere og kortlægge IL-17A-producerende celler in situ i fibrotisk levervæv fra patienter.Som angivet i protokollen er flere reagenser kemisk farlige, og de relevante procedurer bør udføres i en kemisk hætte ved hjælp af det relevante personlige beskyttelsesudstyr og forholdsregler.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging af Mouse Thymus med 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Kvantificering af den Respiratory burstrespons som en indikator for medfødte immunforsvar Sundhed i zebrafisk

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering og analyse for at fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhed til terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

En CFSE-baserede Assay til at studere den Migration af murine Skin dendritiske celler i drænende lymfeknuder Under Infektion med<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacille Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Molekylær diffusion i plasma Membraner af primær lymfocytter målt ved fluorescenskorrelationsspektroskopi

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasiv prøveudtagning af slimhindebelægning væske til kvantificering af In Vivo øvre luftveje immun-mægler niveauer

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Kvantificering af Efferocytosis af encellede Fluorescens mikroskopi

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

En Immunohistopathologic undersøgelse at profilere folat Receptor Beta makrofag og vaskulære immun mikromiljø i kæmpe celle Arteritis

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Flow cytometrisk analyse af lymfocyt infiltration i centralnervesystemet under eksperimentel autoimmun encephalomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...