Name: visualization, quantification, and mapping of immune cell populations in the tumor microenvironment
Uploaded: 2020-03-25T14:00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment at JoVE.com

Nous remercions le participant à l’étude. Nous remercions Louise Rousseau, coordonnatrice de la biobanque HBP pour la récupération des échantillons de tissus et de toutes les informations cliniques associées. Nous reconnaissons la pathologie moléculaire et les installations de base d’imagerie cellulaire au CRCHUM et Michael Persch de Visiopharm pour une excellente assistance technique. Financement : Cette étude a été appuyée par des subventions de la Fondation canadienne du foie, du Réseau sida et des maladies infectieuses du Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS) et du Réseau SIDA-MI et du Réseau canadien contre l’hépatite C (CanHepC). CanHepC est financé par une initiative conjointe des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) (NHC-142832) et de l’Agence de la santé publique du Canada. M.F.M. a reçu des bourses de l’Université de Montréal, de la Bourse Gabriel Marquis et de la FRQS. T.F. a reçu des bourses doctorales des IRSC et de CanHepC. S.T. est titulaire de la Chaire Roger-Des-Groseillers en chirurgie hénotobiliaire et pancréatique oncologique, Université de Montréal.
Contributions d’auteurs : M.F.M. a conçu, effectué des expériences et analysé des données. T.F. a conçu des expériences. A.C-B. fourni des conseils techniques. G.S. a effectué toute l’évaluation pathologique du sujet de l’étude et a fourni des commentaires sur tous les aspects pathologiques. L.M. a effectué des colorants, optimisé et effectué l’acquisition d’images. M.N.A. a effectué la tache de RFP et a fourni une contribution technique précieuse. Le N.-B. a contribué à l’analyse de l’image. S.T. est le chercheur principal de la biobanque HBP et est responsable de superviser l’exploitation globale de la biobanque. Il a également fourni des commentaires inestimables sur tous les aspects du projet et ses implications cliniques. M.F.M, T.F., et N.H.S. ont conceptualisé et conçu l’étude. N.H.S. a supervisé le travail et obtenu du financement. M.F.M., T.F., A.C-B et N.H.S. ont écrit le manuscrit. Tous les auteurs ont examiné et approuvé le manuscrit.

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Staining+by+Sequential+Immunostaining+and+Antibody+Removal+on+Routine+Tissue+Sections.">Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li></ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Des techniques simples, accessibles et faciles à exécuter qui permettent la résolution spatiale des cellules immunitaires dans les sections tissulaires sont nécessaires pour cartographier le paysage immunitaire dans le cancer et d’autres troubles immunologiques. Ici, nous décrivons une stratégie qui intègre des techniques d’étiquetage et d’analyse numérique largement disponibles pour élargir la capacité de multiplexage et l’évaluation multidimensionnelle des essais d’imagerie12,13,17,19. La coloration de trois sections en série pour différents marqueurs, et la réutilisation des sections par des techniques de décapage et de réprobation, nous ont permis de visualiser 11 paramètres en plus des taches de H et E et de PSR. Six images de ces sections ont été alignées de façon automatisée à l’aide du module d’alignement des tissus. L’alignement était précis au niveau de la cellule individuelle pour les images provenant de la même section et très concordant pour les images provenant de sections voisines. Le multiplexe virtuel nous a permis de déterminer comment les marqueurs visualisés dans une section se rapportent spatialement à des marqueurs visualisés dans une autre section contigu. Alors que certaines des colorations étiquetées COIs, d’autres étiquetés TCs, nous permettant de quantifier coIs dans les différents TC. L’utilisation d’outils logiciels pour la quantification automatisée des ICO a grandement simplifié et accéléré le traitement des images. En outre, l’analyse numérique a été appliquée à des sections de tissus entiers au lieu de certains champs de vision, ce qui a donné lieu à une représentation impartiale du TME. En outre, parce que les coordonnées tissulaires des COI ont été enregistrées, il était possible de générer des thermomaps tissulaires.
Il y a plusieurs secteurs dans ce protocole où le dépannage peut être nécessaire. Premièrement, une mauvaise récupération d’antigène peut affecter la qualité du mIF, de sorte que le type de tampon et de durée de récupération d’antigènes devrait être optimisé pour les conditions spécifiques d’essai/biomarqueur utilisées. Deuxièmement, le type de solution de blocage utilisée devrait être adapté aux tissus/antigènes/espèces d’anticorps primaires et secondaires. Dans nos mains, l’ajout de sérum total de 10% de l’espèce où le tissu provient des récepteurs bloqués Fc, et donc réduit la liaison des anticorps non spécifiques. L’ajout de 10 % du sérum provenant de l’espèce dans laquelle les anticorps secondaires ont été élevés réduirait au minimum l’attachement direct non spécifique des anticorps secondaires à la section tissulaire. Troisièmement, la validation de la spécificité des anticorps primaires et secondaires à l’aide des contrôles positifs et négatifs appropriés est essentielle. Quatrièmement, l’augmentation de l’autofluorescence dans certains canaux et la diffusion du DAPI lors du décapage primaire des anticorps sont également courantes. Pour répondre à l’autofluorescence améliorée, nous avons utilisé des paires d’anticorps primaires/secondaires où le signal spécifique avait des valeurs d’intensité au moins 5x celle de l’arrière-plan. Enfin, certains anticorps d’affinité élevée ne peuvent pas être écaillés avec des procédures régulières de décapage. Dans ce cas, nous recommandons d’utiliser de tels anticorps dans la dernière série d’étiquetage. L’utilisateur peut avoir à essayer différentes séquences de coloration pour trouver la configuration optimale pour les anticorps d’intérêt. L’efficacité du décapage doit être confirmée avant de passer à une deuxième ou troisième série d’étiquetage.
La principale limitation et le défi de cette stratégie est de trouver les bonnes combinaisons d’anticorps fluorescents primaires et secondaires pour les marqueurs d’intérêt. Trouver des anticorps primaires élevés dans différentes espèces ou avec des isotypes différents qui pourraient être utilisés simultanément est limité par ce qui est disponible dans le commerce. La plupart des scanners à glissière entiers sont équipés de lampes et de filtres qui permettent l’imagerie d’un maximum de cinq canaux, et les anticorps secondaires dans les bonnes espèces et le fluorophore droit ne sont pas toujours disponibles. Nous avons partiellement surmonté ces limitations à l’aide de colorants en série et d’étiquetage séquentiel. Plusieurs combinaisons d’anticorps peuvent devoir être testées pour arriver à la meilleure combinaison pour les marqueurs d’intérêt. Une autre limitation est la qualité de la coloration DAPI, parce que le décapage et la réprobation ne permettent pas toujours d’effectuer la segmentation des noyaux.
Le module d’alignement des tissus nécessite une formation minimale et aucune compétence de programmation de la part des utilisateurs. Le logiciel permet théoriquement l’alignement d’un nombre illimité d’images. Cependant, l’alignement précis dépend de la relation des sections, où des sections plus proches qui sont plus histologically concordant sont plus précisément alignées. Nous avons utilisé le module Auteur de VIS pour générer les APP. Une connaissance de base de l’analyse d’image est nécessaire pour créer des APP, mais c’est également le cas lors de l’utilisation de tout autre logiciel d’analyse d’images. Les avantages uniques de VIS par rapport à d’autres logiciels d’analyse d’images comprennent l’alignement automatisé des images à partir de sections préparées à l’aide de différentes méthodes (p. ex., IF, histochemistry, IHC). Cela permet des études de colocalisation de plusieurs marqueurs d’intérêt à l’aide de multiplexe virtuel. En outre, la conception flexible et conviviale des PPP permet une personnalisation spécifique à l’utilisateur. La quantification et la cartographie automatisées, ainsi que la possibilité de traiter des sections de tissus entiers, permet d’économiser du temps et de réduire les biais par rapport au comptage manuel par inspection visuelle.
Cette stratégie est un outil de recherche très utile pour l’immunologie tissulaire dans le contexte du cancer et de l’autoimmunité, mais elle n’est pas en mesure d’être utilisée cliniquement. Avec une normalisation et une validation supplémentaires, il peut être utilisé à l’avenir pour de multiples applications (p. ex., cartographier le paysage immunitaire du cancer afin de prédire et de surveiller la réponse aux agents immunothérapeutiques). Il peut également être adapté à différentes conditions inflammatoires (p. ex., maladie inflammatoire de l’intestin) pour combiner l’évaluation pathologique avec les biomarqueurs pronostiques.
Les principales étapes critiques de ce protocole sont l’efficacité/spécificité de l’étiquetage et la robustesse des APP conçus pour l’utilisation ou le biomarqueur prévu. Par conséquent, une validation régulière par inspection visuelle, en particulier lors de la conception d’une nouvelle APP, est essentielle. L’utilisation efficace de plusieurs séries de décapage et de réprobation ou différents types de taches sur la même section sont des composants critiques et peuvent être spécifiques aux tissus ou à la section. Il est essentiel de vérifier l’efficacité de ces processus avant de procéder à une analyse de lots volumines.
En résumé, nous fournissons une stratégie qui maximise l’information quantitative et spatiale qui peut être obtenue à partir d’échantillons de tissus cliniques précieux. Les ressources, l’équipement et les connaissances nécessaires à la mise en œuvre de cette méthodologie sont largement accessibles. Nous proposons cette méthodologie comme un guide utile pour la planification des essais visant à identifier, quantifier et cartographier les populations de cellules immunitaires dans le TME.

Le développement du cancer est le résultat d’un processus multistep impliquant des interactions réciproques entre les cellules malignes et le TME. Autre que les cellules tumorales, le TME est composé de cellules nonmalignantes, de cellules stromales, de populations de cellules immunitaires et de matrice extracellulaire (ECM)1. L’organisation spatiale des différents composants cellulaires et structurels du tissu tumoral et l’échange dynamique entre le cancer et les cellules non cancéreuses voisines modulent finalement la progression et la réponse de tumeur à la thérapie2,3,4. Il a été démontré que la réponse immunitaire dans le cancer est spatiotemporally réglementée5,6. Différentes populations de cellules immunitaires infiltrant la lésion néoplastique et le tissu adjacent présentent des modèles de distribution spatiale distinctifs et des états variés d’activation et de différenciation associés à différentes fonctions (p. ex., pro- contre antitumor). Ces différentes populations immunitaires et leurs paramètres coevolve heures supplémentaires avec la tumeur et les compartiments stromaux.
L’émergence de technologies permettant le profilage multiomique à cellules individuelles a augmenté de façon exponentielle notre compréhension des nombreux réseaux cellulaires et moléculaires régulant la carcinogenèse et la progression tumorale. Cependant, la plupart des outils analytiques à haut débit à base de cellules simples nécessitent une perturbation tissulaire et l’isolement cellulaire unique, ce qui entraîne une perte d’information sur l’organisation spatiale des cellules et les interactions cellule-cellule7. Étant donné que l’emplacement et l’arrangement de cellules immunitaires spécifiques dans le TME ont une valeur diagnostique et pronostique, les technologies permettant la résolution spatiale sont un complément essentiel des techniques de profilage immunitaire à base de cellules uniques.
Traditionnellement, les techniques d’imagerie comme l’immunohistochimie (IHC) et l’immunofluorescence multiplexe (MIF) ont été limitées à un petit nombre de biomarqueurs qui peuvent être visualisés simultanément. Cette limitation a entravé l’étude de la dynamique spatiotemporal des cellules immunitaires tumeur-infiltrement, qui sont typiquement définies par plusieurs marqueurs phénotypiques. Les progrès récents dans les outils d’imagerie et d’analyse ont élargi les possibilités du multiplexe. De nouvelles technologies d’étiquetage à base d’anticorps comme l’histo-cytométrie et la cytométrie de masse d’imagerie ont été utilisées pour séparer spatialement jusqu’à 12 et 32 biomarqueurs, respectivement8,9. L’imagerie par spectrométrie de masse, une technique qui ne nécessite pas d’étiquetage, a le potentiel d’imager simultanément des milliers de biomarqueurs dans une seule section tissulaire10,11. Bien que ces techniques aient déjà montré un grand potentiel pour disséquer le paysage immunitaire des tissus dans le cancer, elles utilisent des équipements et des logiciels très sophistiqués et coûteux et ne sont pas facilement accessibles à la majorité des chercheurs.
Alternativement, la capacité de multiplexage de l’IHC traditionnel et mIF a été élargie grâce à l’utilisation de l’imagerie en série, des cycles séquentiels d’étiquetage, et l’imagerie spectrale7,12,13,14,15,16. Ces techniques génèrent plusieurs images à partir de la même ou à partir de sections de tissus série qui peuvent être consolidées en diapositives multiparameter virtuelles à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Par conséquent, le nombre de marqueurs pouvant être visualisés et analysés simultanément augmente.
Ici, nous proposons une stratégie pour la conception rationnelle des essais de multiplex tissulaire à l’aide de réactifs disponibles dans le commerce, d’équipements de microscopie abordables et de logiciels conviviaux(figure 1). Cette méthodologie intègre l’imagerie en série, l’étiquetage du multiplexe séquentiel, l’imagerie des tissus entiers et l’alignement des tissus pour générer des diapositives virtuelles multiparameter qui peuvent être utilisées pour la quantification automatisée et la cartographie des cellules immunitaires dans les sections tissulaires. Grâce à cette stratégie, nous avons créé une diapositive virtuelle comprenant 11 biomarqueurs plus deux taches histologiques fréquemment utilisées : l’hématoxyline et l’éosine (H et E) et le picrosirius rouge (PSR). De multiples populations de cellules immunitaires ont été identifiées, localisées et quantifiées dans différents compartiments de tissu et leur distribution spatiale résolue utilisant des maçons de tissu. Cette stratégie maximise l’information qui peut être obtenue à partir de spécimens cliniques limités et s’applique aux échantillons de tissus archivés par la paraffine (FFPE) formalin-fixe, y compris les tissus entiers, les biopsies d’aiguilles de base et les microrésabres de tissu. Nous proposons cette méthodologie comme un guide utile pour concevoir des essais personnalisés pour l’identification, la quantification et la cartographie des populations de cellules immunitaires dans le TME.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1419px;" width="1418">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:649px;">Antigen Retrieval Solution: Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% v/v Tween 20, pH 6.0)</td>
			<td style="width:257px;"></td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blocking Solution: 1 % BSA, 10 % filtered human serum, 10 % filtered donkey serum, 0.1 % Tween 20, and 0.3% Triton in PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>800-095-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coplin jars (EASYDIP SLIDE STAINING SYSTEM)</td>
			<td>Newcomersupply</td>
			<td>5300KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545E 22*50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Direct Red 80</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td align="right">365548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol 100%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electric pressure cooker</td>
			<td>Salton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eosin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td align="right">3801600</td>
			<td>CAUTION, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td>CAUTION, harmful by inhalation, ingestion and skin absortion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FFPE section (4&#956;m) slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycine 0,1 M in PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hematoxylin Stain Solution, Gil 1. Formulation, Regular Strength</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3535-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Holder (EasyDip Staining Jar Holder)</td>
			<td>Newcomersupply</td>
			<td>5300RK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td align="right">22210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Humidity chamber</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z670138-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pap pen</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS-Tween 20 (0.1% v/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Permount Mounting Media</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Picric Acid 1.3 %</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6744</td>
			<td>CAUTION, skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Picro-Sirius Red/Fast Green solution: Fast Green 0.1 % w/v + Sirius Red 0.2 % w/v in 1,3 % picric acid solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-&#945;SMA</td>
			<td>Mouse IgG2a 1A4</td>
			<td>Sigma A2547</td>
			<td>Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD34</td>
			<td>Mouse IgG1 HPCA1/763</td>
			<td>Novus Biologicals NBP2-44568</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-Cytokeratin 8/18</td>
			<td>Rabbit EP17/EP30</td>
			<td>Agilent IR09461-2</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD68</td>
			<td>Mouse KP1</td>
			<td>Abcam ab955</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-Desmin</td>
			<td>Rabbit Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen PA5-16705</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD4</td>
			<td>Mouse N1UG0</td>
			<td>Affymetrix 14-2444</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-FoxP3</td>
			<td>Rabbit 1054C</td>
			<td>R &#38; D MAB8214</td>
			<td>Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-MPO</td>
			<td>Goat Polyclonal</td>
			<td>R &#38; D Systems AF3667</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD3</td>
			<td>Rabbit SP7</td>
			<td>Abcam ab16669</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD8</td>
			<td>Mouse C8/144B</td>
			<td>Invitrogen 14-0085-80</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-mouse A488</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-21202</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-Rabbit A488</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-21206</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-goat A568</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-11057</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-rabbit A647</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-31573</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Rat anti-mouse IgG1 A647</td>
			<td>RMG1-1</td>
			<td>Biolegend 406618</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Goat anti-mouse IgG2a CF568</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Sigma Aldrich SAB4600315</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-mouse DyLight 755</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen SA5-10171</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-rabbit DyLight 755</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen SA5-10043</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SDS</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SDS001,500</td>
			<td>CAUTION, oral skin and eye toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shandon multi-program robotic slide stainer</td>
			<td>LabX</td>
			<td align="right">11384903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shandon Xylene Substitute,</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CA89413-336</td>
			<td>CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shaking water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SlowFade Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td align="right">1545801</td>
			<td>CAUTION, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stripping Buffer: mix 20 ml 10% w/v SDS with 12.5 ml 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), and 67.5 ml ultra-pure water. Under a fume hood, add 800 uL of 2-mercapto ethanol (114,4 mM final concentration)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-HCl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VIS Software</td>
			<td>Visiopharm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Whole slide scanner Olympus BX61VS</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Microscope: Olympus Slide Scanner BX61VS, 5 slides scanner, motorized stage, autofocus. Camera: Lightsource: Xcite-120. Filters: BrightLine&#174; Sedat filter set (# LED-DA/FI/TR/Cy5-4X4M-B-000, Semrock)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736-4L</td>
			<td>CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylene : Ethanol solution (1:1 v/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>CAUTION, harmful by ingestion, inhalation, fatal if sking absortion. Eye irritation. Use fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization, quantification, and mapping of immune cell populations in the tumor microenvironment

Le paysage immunitaire du microenvironnement de tumeur (TME) est un facteur déterminant dans la progression et la réponse de cancer à la thérapie. Plus précisément, la densité et l’emplacement des cellules immunitaires dans le TME ont des valeurs diagnostiques et pronostiques importantes. Le profilage multiommique du TME a augmenté de façon exponentielle notre compréhension des nombreux réseaux cellulaires et moléculaires régulant l’initiation et la progression des tumeurs. Cependant, ces techniques ne fournissent pas d’informations sur l’organisation spatiale des cellules ou des interactions cellule-cellule. Des techniques de multiplexage abordables, accessibles et faciles à exécuter qui permettent la résolution spatiale des cellules immunitaires dans les sections tissulaires sont nécessaires pour compléter les technologies à haut débit à base d’une seule cellule. Ici, nous décrivons une stratégie qui intègre l’imagerie en série, l’étiquetage séquentiel et l’alignement d’images pour générer des diapositives virtuelles multiparameter de sections de tissus entiers. Les diapositives virtuelles sont ensuite analysées de façon automatisée à l’aide de protocoles définis par l’utilisateur qui permettent l’identification, la quantification et la cartographie des populations cellulaires d’intérêt. L’analyse d’image est faite, dans ce cas à l’aide des modules d’analyse Tissuealign, Auteur, et HISTOmap. Nous présentons un exemple où nous avons appliqué cette stratégie avec succès à un spécimen clinique, maximisant l’information qui peut être obtenue à partir d’échantillons de tissus limités et fournissant une vue impartiale du TME dans toute la section tissulaire.

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Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment

Ici, nous décrivons une stratégie simple et accessible pour visualiser, quantifier, et cartographier les cellules immunitaires dans les sections formelles de tissu tumoral paraffin-intégré. Cette méthodologie combine les techniques d’imagerie et d’analyse numérique existantes dans le but d’élargir la capacité de multiplexage et l’analyse multiparameter des essais d’imagerie.

Visualisation, quantification et cartographie des populations de cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral

The immune landscape of the tumor microenvironment (TME) is a determining factor in cancer progression and response to therapy. Specifically, the density ...

L’organisation spatiale des cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral a une valeur clinique. Cette stratégie peut être facilement utilisée pour visualiser, quantifier et cartographier les cellules immunitaires dans les tissus tumoraux. L’immunothérapie a révolutionné le traitement du cancer.Cependant, tous les patients ne répondent pas bien. Cette stratégie peut servir à définir les signatures tissu-immunisées qui peuvent prévoir une bonne réponse anti-tumeur. Avant de mener une expérience, testez les combinaisons d’anticorps et les techniques de décapage sur les tissus de contrôle et vérifiez que les AIP sont exacts dans leur détection des marqueurs d’intérêt.Comme les descriptions écrites des méthodes d’analyse d’image utilisent un langage technique sophistiqué, la combinaison du texte avec de la vidéo facilite une meilleure compréhension et réplication de la méthodologie. Pour la récupération antigène des sections de tissu tumoral formalin-fixes et paraffin-incorporées, immerger l’échantillon de tissu déwaxed dans un pot de Coplin de la solution de récupération d’antigène et placer le pot dans un autocuiseur électrique contenant l’eau du robinet. Le niveau d’eau ne doit pas dépasser la moitié de la hauteur du bocal afin que l’eau ne se mélange pas avec la solution de récupération de l’antigène.Fermez le couvercle et la soupape de pression sur la cuisinière et traitez les glissières à haute pression pendant 10 minutes. À la fin du traitement, débranchez la cuisinière, relâchez la pression et ouvrez le couvercle. Après que les glissières se sont refroidies dans la cuisinière pendant 30 minutes, lavez les échantillons deux fois pendant cinq minutes dans du PBS frais par lavage dans un nouveau bocal Coplin, puis utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner une barrière autour de chaque section tissulaire.Ensuite, plongez les diapositives dans de la glycine 0,1 molaire dans PBS pendant 15 minutes à température ambiante avant de rincer les diapositives deux fois dans PBS comme démontré. Après le deuxième lavage, transférer les glissières dans une chambre d’humidité et couvrir chaque section de tissu avec une solution de blocage. Après 30 minutes à température ambiante, rincer les sections deux fois pendant cinq minutes dans du PBS-Tween frais par lavage, puis ajouter les anticorps primaires d’intérêt, dilués dans la solution de blocage, à chaque glissière, à l’abri de la lumière.À la fin de l’incubation, rincer les glissières trois fois dans du PBS-Tween frais pendant cinq minutes par lavage, puis étiqueter les sections avec les anticorps secondaires appropriés pendant une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation, rincer les glissières trois fois dans du PBS-Tween frais pendant cinq minutes par lavage. Suivre d’un seul rinçage à l’eau double distillée.Retirez l’excès d’eau de chaque glissière et montez les tissus avec un milieu de montage complété par dapi et une glissière de couverture. Après avoir pressé le milieu de montage excédentaire, laissez sécher les glissières pendant 20 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière, avant d’acquérir des images pour tous les canaux à l’aide d’un scanner à glissière entière. Après numérisation, ouvrez les images du logiciel d’analyse d’images et cliquez sur l’onglet Tissuealign.Pour importer les images à aligner dans le plateau de diapositives, sélectionnez la première image à être alignée à partir de la base de données. Lorsque toutes les images ont été chargées, cliquez ensuite dans les étapes workflow pour relier les images et faire glisser et laisser tomber toutes les images à aligner sur la première image. Lorsque toutes les images ont été reliées le cas échéant, utilisez un minimum de trois broches par image indiquant les caractéristiques des tissus homologues dans les images liées.Utilisez une goupille pour tracer la première image pour vérifier la qualité de l’alignement qui en résulte. Si un alignement satisfaisant a été obtenu, cliquez sur Suivant pour afficher les couches d’image et enregistrer l’image composite dans la base de données. Pour effectuer une détection des tissus à l’aide du protocole défini par l’utilisateur APP 1, ouvrez l’onglet Analyse d’image et ouvrez l’image composite dans le module d’analyse d’image.Cliquez sur l’icône Open APP et sélectionz l’APPLICATION appropriée. Pour confirmer que l’APP fonctionne, accédez à un emplacement de tissu sélectionné et cliquez sur Aperçu. Si les résultats sont satisfaisants, cliquez pour traiter l’image à l’aide de l’APP sélectionnée.Pendant le traitement, l’APP déterminera si le pixel est associé ou non au tissu pour permettre la conversion de tous les pixels associés aux tissus en une région d’intérêt. La nouvelle région d’intérêt peut ensuite être transférée à l’une des images alignées. À la fin de l’analyse, cliquez sur Fichier et Enregistrer pour enregistrer l’image modifiée avec la nouvelle région d’intérêt.Pour la segmentation du tissu en stroma et parenchyme, ouvrez l’onglet Analyse d’image et sélectionnez les fichiers d’intérêt de la base de données. Open APP 2, APP 2 utilise l’image teintée psr pour la segmentation des tissus. Prévisualisez APP 2 en traitant l’image dans un champ de vision sélectionné.Si les résultats sont satisfaisants, cliquez sur Exécuter pour traiter APP 2 sur l’image complète. La région d’intérêt du tissu sera segmentée en stroma et parenchyme et leurs zones respectives déterminées. Les régions nouvellement créées d’intérêt pour le stroma et le parenchyme peuvent être transférées aux images alignées, puis exporter et enregistrer l’image modifiée comme démontré.Pour identifier et quantifier les populations cellulaires d’intérêt, importez l’image segmentée d’intérêt dans le module d’analyse d’image. Après ajustement de la couleur, ouvrez APP 3. APP 3 détectera les populations cellulaires d’intérêt et les quantifiera dans le parenchyme et le stroma.Si les résultats sont satisfaisants, exécutez APP 3 sur l’image complète. Toutes les cellules d’intérêt individuelles seront étiquetées, leurs coordonnées tissulaires stockées et les densités des cellules d’intérêt dans les régions stroma et parenchymales déterminées. L’image modifiée peut alors être sauvegardée comme démontré.Pour effectuer le démapping tissulaire des objets étiquetés cellule d’intérêt, ouvrez le protocole approprié défini par l’utilisateur dans la fenêtre de sélection APP et cliquez sur Exécuter pour inciter l’APP à utiliser les coordonnées des objets étiquetés anticorps pour générer la carte thermique. Les points chauds, mis en évidence en rouge, contiennent la plus forte densité de la population cellulaire d’intérêt tandis que les zones bleu foncé ont le plus bas. La carte thermique d’une population cellulaire spécifique peut être superposée sur les images alignées pour fournir des informations supplémentaires sur la façon dont ces cellules sont organisées dans le microenvironnement tumoral.Ensuite, exportez et enregistrez la carte thermique des tissus. Il est essentiel de vérifier la spécificité de l’étiquetage, l’exactitude des APU conçus et l’efficacité de décapage et de réprobation des différentes taches sur la même section. En intégrant l’imagerie en série, l’étiquetage séquentiel et l’alignement des tissus, plus de marqueurs peuvent être visualisés simultanément et plus d’informations peuvent être extraites de spécimens cliniques limités.La coloration de H&E des sections réséquées de tissu de tumeur permet l’évaluation de l’architecture de tissu, de la morphologie cellulaire, et des paramètres médicalement pertinents tels que le type de malignité, le grade de tumeur, et l’infiltration immunisée globale. La coloration cd34 permet la détection de cellules endothéliales. La coloration de cytokératine 8/18 révèle la présence des cellules épithéliales, et la coloration anti-alpha lisse d’actine de muscle permet l’identification des cellules stellates fibrogenic, activées, hépatiques.Reprobing avec des anticorps contre CD68 et Desmin permettent la détection des macrophages et des myofibroblastes respectivement. Pour mieux caractériser l’infiltration tumeur-immunisée, la coloration pour des marqueurs de T-cellule et le myeloperoxidase peut être exécutée. Picro Sirius Red coloration peut également être effectuée pour visualiser le collagène fibrillar et pour faciliter la segmentation du stroma et du parenchyme.Les pixels associés aux tissus dans les sections tachées peuvent être identifiés pour permettre la segmentation de différents compartiments dans une région d’intérêt spécifique. Les populations cellulaires d’intérêt peuvent ensuite être identifiées dans chaque région, ce qui permet la production de cartes tissulaires pour lesquelles les régions à forte densité pour une population cellulaire donnée sont affichées comme des points chauds et les régions à densité relativement faible apparaissent comme des points froids. Cette méthodologie d’identification, de quantification et de cartographie des cellules immunitaires dans les échantillons de tissus peut être adaptée et validée pour une recherche spécifique et un marqueur d’intérêt.Cette stratégie peut être appliquée aux micro-réseaux tissulaires pour l’analyse à haut débit. Il peut également être combiné avec l’hybridation in situ pour examiner simultanément l’expression in situ des protéines et des gènes. Nous avons utilisé cette stratégie pour identifier et cartographier les cellules productrices d’IL-17A in situ dans le tissu hépatique fibreux des patients.Comme indiqué dans le protocole, plusieurs réadageurs sont dangereuses sur le plan chimique et les procédures pertinentes devraient être effectuées dans une hotte chimique à l’aide de l’équipement de protection individuelle approprié et des précautions.

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