Name: visualization, quantification, and mapping of immune cell populations in the tumor microenvironment
Uploaded: 2020-03-25T14:00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment at JoVE.com

Wir danken dem Studienteilnehmer. Wir danken Louise Rousseau, Koordinatorin der HBP Biobank für die Wiederherstellung der Gewebeproben und aller damit verbundenen klinischen Informationen. Wir würdigen die molekularen Pathologie- und Zellbild-Kerneinrichtungen am CRCHUM und Michael Persch von Visiopharm für hervorragende technische Unterstützung. Finanzierung: Diese Studie wurde durch Stipendien der Canadian Liver Foundation, des Fonds de recherche du Québec–Santé (FRQS) AIDS and Infectious Disease Network (Réseau SIDA-MI) und des Canadian Network on Hepatitis C (CanHepC) unterstützt. CanHepC wird durch eine gemeinsame Initiative der Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (NHC-142832) und der Public Health Agency of Canada finanziert. M.F.M. erhielt Stipendien von der Université de Montréal, Bourse Gabriel Marquis und der FRQS. T.F. erhielt Promotionsstipendien von CIHR und CanHepC. S.T. hat den Roger-Des-Groseillers Lehrstuhl für hepatobiliäre und pankreastische onkologische Chirurgie, Université de Montréal.
Autorenbeiträge: M.F.M. entwarf, führte Experimente durch und analysierte Daten. T.F. entwarf Experimente. A.C-B. technische Anleitung. G.S. führte alle pathologischen Bewertungen des Studiengegenstandes durch und lieferte Beiträge zu allen pathologischen Aspekten. L.M. führte H&E-Färbung durch, optimierte und führte die Bildaufnahme durch. M.N.A. führte den PSR-Fleck durch und lieferte wertvolle technische Input. N.B. trug zur Bildanalyse bei. S.T. ist der Hauptprüfer der HBP-Biobank und verantwortlich für die Überwachung des Gesamtbetriebs der Biobank. Er lieferte auch einen unschätzbaren Beitrag zu allen Aspekten des Projekts und seinen klinischen Implikationen. M.F.M. T.F. und N.H.S. konzipierten und gestalteten die Studie. N.H.S. überwachte die Arbeit und erhielt Fördermittel. M.F.M., T.F., A.C-B und N.H.S. schrieben das Manuskript. Alle Autoren überprüften und genehmigten das Manuskript.

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Staining+by+Sequential+Immunostaining+and+Antibody+Removal+on+Routine+Tissue+Sections.">Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li></ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Einfache, zugängliche und einfach auszuführende Multiplexing-Techniken, die eine räumliche Auflösung von Immunzellen in Gewebeabschnitten ermöglichen, sind erforderlich, um die Immunlandschaft bei Krebs und anderen immunologischen Störungen abzubilden. Hier beschreiben wir eine Strategie, die weit verbreitete Etikettierungs- und digitale Analysetechniken integriert, um die Multiplexing-Fähigkeit und die multidimensionale Bewertung von Bildgebungs-Assays12,13,17,19zu erweitern. Die Färbung von drei seriellen Abschnitten für verschiedene Marker und die Wiederverwendung von Abschnitten durch Stripping- und Reprobing-Techniken ermöglichten es uns, 11 Parameter zusätzlich zu H&E- und PSR-Färbungen zu visualisieren. Sechs Bilder aus diesen Abschnitten wurden mit dem Gewebeausrichtungsmodul automatisiert ausgerichtet. Die Ausrichtung war auf der einzelnen Zellebene für Bilder aus demselben Abschnitt präzise und für Bilder aus benachbarten Abschnitten sehr konkordante. Virtuelles Multiplexing ermöglichte es uns zu bestimmen, wie Marker, die in einem Abschnitt visualisiert werden, räumlich mit Markern in einem anderen zusammenhängenden Abschnitt in Beziehung stehen. Während einige der Färbungen COIs markierten, bezeichneten andere TCs, so dass wir COIs in den verschiedenen TCs quantifizieren konnten. Der Einsatz von Software-Tools zur automatisierten Quantifizierung von COIs vereinfachte und beschleunigte die Verarbeitung von Bildern erheblich. Darüber hinaus wurde die digitale Analyse auf ganze Gewebeabschnitte anstelle ausgewählter Sichtfelder angewendet, was zu einer unvoreingenommenen Darstellung der TME führte. Da die Gewebekoordinaten von COIs registriert wurden, war es zudem möglich, Gewebe-Heatmaps zu erstellen.
Es gibt mehrere Bereiche in diesem Protokoll, in denen eine Fehlerbehebung erforderlich sein kann. Erstens kann ein schlechter Antigenabruf die Qualität von mIF beeinflussen, daher sollten die Art des Antigen-Abrufpuffers und die Dauer für die spezifischen Assay-/Biomarker-Bedingungen optimiert werden. Zweitens sollte die Art der verwendeten Sperrlösung an die Gewebe/Antigen/Arten von Primär- und Sekundärantikörpern angepasst werden. In unseren Händen, die Zugabe von 10% Gesamtserum von der Spezies, wo das Gewebe von blockierten Fc-Rezeptoren stammt, und damit reduzierte unspezifische Antikörperbindung. Die Zugabe von 10 % des Serums aus der Art, in der die sekundären Antikörper aufgezogen wurden, würde die direkte unspezifische Anhaftung von sekundären Antikörpern an den Gewebeabschnitt minimieren. Drittens ist die Validierung der Spezifität der primären und sekundären Antikörper unter Verwendung der richtigen positiven und negativen Kontrollen von wesentlicher Bedeutung. Viertens sind erhöhte Autofluoreszenz in einigen Kanälen und die Diffusion von DAPI bei primärer Abispperung von Antikörpern ebenfalls üblich. Um die verbesserte Autofluoreszenz zu beheben, verwendeten wir primäre/sekundäre Antikörperpaare, bei denen das spezifische Signal Intensitätswerte von mindestens 5x der des Hintergrunds hatte. Schließlich können einige Antikörper mit hoher Affinität nicht mit regelmäßigen Stripping-Verfahren eluiert werden. In diesem Fall empfehlen wir die Verwendung solcher Antikörper in der letzten Etikettierungsrunde. Der Benutzer muss möglicherweise verschiedene Färbesequenzen ausprobieren, um die optimale Konfiguration für die Antikörper von Interesse zu finden. Die Wirksamkeit des Abisolierens sollte vor einer zweiten oder dritten Etikettierungsrunde bestätigt werden.
Die Hauptbeschränkung und Herausforderung dieser Strategie besteht darin, die richtigen Kombinationen von primären und sekundären fluoreszierenden Antikörpern für die Marker von Interesse zu finden. Die Suche nach primären Antikörpern, die bei verschiedenen Arten oder mit verschiedenen Isotypen aufgezogen werden, die gleichzeitig verwendet werden könnten, ist durch das, was kommerziell erhältlich ist, begrenzt. Die meisten ganzen Diascanner sind mit Lampen und Filtern ausgestattet, die eine Bildgebung von maximal fünf Kanälen ermöglichen, und sekundäre Antikörper bei der richtigen Art und dem rechten Fluorophor sind nicht immer verfügbar. Diese Einschränkungen haben wir teilweise durch serielle Färbungen und sequentielle Beschriftungen überstanden. Möglicherweise müssen mehrere Antikörperkombinationen getestet werden, um die beste Kombination für die Marker von Interesse zu erhalten. Eine weitere Einschränkung ist die Qualität der DAPI-Färbung, da Das Abisolieren und Reprobing möglicherweise nicht immer die Durchführung der Kernsegmentierung ermöglicht.
Das Gewebeausrichtungsmodul erfordert minimale Schulungen und keine Programmierkenntnisse von Benutzern. Die Software ermöglicht theoretisch die Ausrichtung einer unbegrenzten Anzahl von Bildern. Die genaue Ausrichtung hängt jedoch von der Verwandtlichkeit von Abschnitten ab, bei denen nähere Abschnitte, die histologisch konkordantesind, genauer ausgerichtet sind. Wir haben das Author-Modul von VIS zum Generieren der APPs verwendet. Grundlegende Kenntnisse der Bildanalyse sind für die Erstellung von APPs erforderlich, aber dies ist auch der Fall, wenn sie eine andere Bildanalysesoftware verwenden. Zu den einzigartigen Vorteilen von VIS im Vergleich zu anderen Bildanalysesoftware gehören die automatisierte Ausrichtung von Bildern aus Abschnitten, die mit unterschiedlichen Methoden (z. B. IF, Histochemie, IHC) erstellt wurden. Dies ermöglicht Kolokalisierungsstudien mehrerer Marker von Interesse mit virtuellem Multiplexing. Darüber hinaus ermöglicht das flexible und benutzerfreundliche Design von APPs eine benutzerspezifische Anpassung. Automatisierte Quantifizierung und Kartierung sowie die Möglichkeit, ganze Gewebeabschnitte zu verarbeiten, sparen Zeit und reduzieren Verzerrungen im Vergleich zur manuellen Zählung durch visuelle Inspektion.
Diese Strategie ist ein sehr nützliches Forschungsinstrument für die Gewebeimmunologie im Zusammenhang mit Krebs und Autoimmunität, bleibt aber für den klinischen Gebrauch nicht validiert. Mit zusätzlicher Standardisierung und Validierung kann es in Zukunft für mehrere Anwendungen eingesetzt werden (z. B. zur Kartierung der Immunlandschaft bei Krebs, um die Reaktion auf immuntherapeutische Wirkstoffe vorherzusagen und zu überwachen). Es kann auch an verschiedene entzündliche Erkrankungen (z.B. entzündliche Darmerkrankungen) angepasst werden, um pathologische Auswertungen mit prognostischen Biomarkern zu kombinieren.
Die wichtigsten kritischen Schritte in diesem Protokoll sind die Effizienz/Spezifität der Etikettierung und die Robustheit der entworfenen APPs für den vorgesehenen Verwendungszweck oder Biomarker. Daher ist eine regelmäßige Validierung durch visuelle Inspektion, insbesondere bei der Entwicklung einer neuen APP, unerlässlich. Die effiziente Verwendung mehrerer Abisolier- und Reprobing-Runden oder verschiedener Fleckentypen auf demselben Abschnitt sind kritische Komponenten und können gewebe- oder abschnittsspezifisch sein. Die Überprüfung der Effizienz solcher Prozesse vor der Durchführung der Großbatchanalyse ist von entscheidender Bedeutung.
Zusammenfassend bieten wir eine Strategie, die die quantitativen und räumlichen Informationen maximiert, die aus wertvollen klinischen Gewebeproben gewonnen werden können. Die Ressourcen, Ausrüstungen und Kenntnisse, die für die Umsetzung dieser Methode erforderlich sind, sind weithin zugänglich. Wir schlagen diese Methode als nützlichen Leitfaden für die Planung von Assays vor, die darauf abzielen, Immunzellpopulationen in der TME zu identifizieren, zu quantifizieren und zu kartieren.

Die Krebsentwicklung ist das Ergebnis eines mehrstufigen Prozesses, bei dem es um wechselseitige Wechselwirkungen zwischen bösartigen Zellen und der TME geht. Anders als Tumorzellen besteht das TME aus nichtbösartigen Zellen, Stromalzellen, Immunzellpopulationen und extrazellulärer Matrix (ECM)1. Die räumliche Organisation der verschiedenen zellulären und strukturellen Komponenten des Tumorgewebes und der dynamische Austausch zwischen dem Krebs und benachbarten Nicht-Krebszellen modulieren letztlich die Tumorprogression und das Ansprechen auf Therapie2,3,4. Es hat sich gezeigt, dass die Immunantwort bei Krebs räumlich reguliert ist5,6. Verschiedene Immunzellpopulationen, die die neoplastische Läsion und das angrenzende Gewebe infiltrieren, weisen ausgeprägte räumliche Verteilungsmuster auf und unterschiedliche Aktivierungs- und Differenzierungszustände, die mit verschiedenen Funktionen (z.B. Pro- versus Antitumor) verbunden sind. Diese verschiedenen Immunpopulationen und ihre Parameter koalieren Überstunden mit dem Tumor und den Stromalkompartimenten.
Das Aufkommen von Technologien, die das Profiling von Einzelzellmultiomics ermöglichen, hat unser Verständnis der zahlreichen zellulären und molekularen Netzwerke, die die Karzinogenese und Tumorprogression regulieren, exponentiell verbessert. Die meisten einzelzellbasierten Analysetools mit hohem Durchsatz erfordern jedoch Gewebestörungen und Einzelzellisolation, was zu einem Verlust von Informationen über die räumliche Organisation von Zellen und Zell-Zell-Wechselwirkungenführt 7. Da die Lage und Anordnung spezifischer Immunzellen in der TME diagnostischen und prognostischen Wert haben, sind Technologien, die eine räumliche Auflösung ermöglichen, eine wesentliche Ergänzung der einzelzellbasierten Immunprofilierungstechniken.
Traditionell sind bildgebende Verfahren wie Immunhistochemie (IHC) und Multiplex-Immunfluoreszenz (mIF) auf eine kleine Anzahl von Biomarkern beschränkt, die gleichzeitig visualisiert werden können. Diese Einschränkung hat die Untersuchung der räumlich-zeitlichen Dynamik tumorinfiltrierender Immunzellen behindert, die typischerweise durch mehrere phänotypchende Marker definiert werden. Jüngste Fortschritte in der Bildgebung und analytischen Tools haben die Möglichkeiten des Multiplexings erweitert. Neue Antikörper-basierte Etikettierungstechnologien wie Histozytometrie und bildgebende Massenzytometrie wurden verwendet, um bis zu 12 bzw. 32 Biomarker räumlich zu trennen, bzw.8,9. Die Bildgebung der Massenspektrometrie, eine Technik, die keine Etikettierung erfordert, hat das Potenzial, Tausende von Biomarkern gleichzeitig in einem einzigen Gewebeabschnitt10,11abzubilden. Obwohl diese Techniken bereits ein großes Potenzial zur Zersebung der Gewebeimmunlandschaft bei Krebs gezeigt haben, verwenden sie hochentwickelte und teure Geräte und Software und sind für die Mehrheit der Forscher nicht leicht zugänglich.
Alternativ wurde die Multiplexing-Fähigkeit von traditionellen IHC und mIF durch die Verwendung von serieller Bildgebung, sequenziellen Runden der Etikettierung und Spektralbildgebung7,12,13,14,15,16erweitert. Diese Techniken generieren mehrere Bilder aus demselben oder aus seriellen Gewebeabschnitten, die mithilfe einer Bildanalysesoftware in virtuellen Multiparameter-Folien konsolidiert werden können. Dadurch steigt die Anzahl der Marker, die gleichzeitig visualisiert und analysiert werden können.
Hier schlagen wir eine Strategie für die rationale Gestaltung von Gewebemultiplex-Assays mit handelsüblichen Reagenzien, erschwinglichen Mikroskopiegeräten und benutzerfreundlicher Software vor (Abbildung 1). Diese Methode integriert serielle Bildgebung, sequenzielle Multiplex-Beschriftung, gesamte Gewebebildgebung und Gewebeausrichtung, um virtuelle Multiparameter-Dias zu generieren, die für die automatisierte Quantifizierung und Kartierung von Immunzellen in Gewebeabschnitten verwendet werden können. Mit dieser Strategie haben wir eine virtuelle Folie mit 11 Biomarkern plus zwei häufig verwendeten histologischen Flecken erstellt: Hämatoxylin und Eosin (H&E) und Picrosirius rot (PSR). Mehrere Immunzellpopulationen wurden in verschiedenen Gewebeteilen identifiziert, lokalisiert und quantifiziert und ihre räumliche Verteilung mithilfe von Gewebe-Heatmaps aufgelöst. Diese Strategie maximiert die Informationen, die aus begrenzten klinischen Proben gewonnen werden können, und ist auf formalinfixierte, paraffinintegrierte (FFPE) archivierte Gewebeproben anwendbar, einschließlich vollgewebter, Kernnadelbiopsien und Gewebemikroarrays. Wir schlagen diese Methode als nützlichen Leitfaden für die Gestaltung von benutzerdefinierten Assays zur Identifizierung, Quantifizierung und Kartierung von Immunzellpopulationen in der TME vor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1419px;" width="1418">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:649px;">Antigen Retrieval Solution: Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% v/v Tween 20, pH 6.0)</td>
			<td style="width:257px;"></td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blocking Solution: 1 % BSA, 10 % filtered human serum, 10 % filtered donkey serum, 0.1 % Tween 20, and 0.3% Triton in PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>800-095-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coplin jars (EASYDIP SLIDE STAINING SYSTEM)</td>
			<td>Newcomersupply</td>
			<td>5300KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545E 22*50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Direct Red 80</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td align="right">365548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol 100%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electric pressure cooker</td>
			<td>Salton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eosin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td align="right">3801600</td>
			<td>CAUTION, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td>CAUTION, harmful by inhalation, ingestion and skin absortion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FFPE section (4&#956;m) slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycine 0,1 M in PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hematoxylin Stain Solution, Gil 1. Formulation, Regular Strength</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3535-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Holder (EasyDip Staining Jar Holder)</td>
			<td>Newcomersupply</td>
			<td>5300RK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td align="right">22210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Humidity chamber</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z670138-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pap pen</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS-Tween 20 (0.1% v/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Permount Mounting Media</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Picric Acid 1.3 %</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6744</td>
			<td>CAUTION, skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Picro-Sirius Red/Fast Green solution: Fast Green 0.1 % w/v + Sirius Red 0.2 % w/v in 1,3 % picric acid solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-&#945;SMA</td>
			<td>Mouse IgG2a 1A4</td>
			<td>Sigma A2547</td>
			<td>Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD34</td>
			<td>Mouse IgG1 HPCA1/763</td>
			<td>Novus Biologicals NBP2-44568</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-Cytokeratin 8/18</td>
			<td>Rabbit EP17/EP30</td>
			<td>Agilent IR09461-2</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD68</td>
			<td>Mouse KP1</td>
			<td>Abcam ab955</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-Desmin</td>
			<td>Rabbit Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen PA5-16705</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD4</td>
			<td>Mouse N1UG0</td>
			<td>Affymetrix 14-2444</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-FoxP3</td>
			<td>Rabbit 1054C</td>
			<td>R &#38; D MAB8214</td>
			<td>Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-MPO</td>
			<td>Goat Polyclonal</td>
			<td>R &#38; D Systems AF3667</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD3</td>
			<td>Rabbit SP7</td>
			<td>Abcam ab16669</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD8</td>
			<td>Mouse C8/144B</td>
			<td>Invitrogen 14-0085-80</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-mouse A488</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-21202</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-Rabbit A488</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-21206</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-goat A568</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-11057</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-rabbit A647</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-31573</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Rat anti-mouse IgG1 A647</td>
			<td>RMG1-1</td>
			<td>Biolegend 406618</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Goat anti-mouse IgG2a CF568</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Sigma Aldrich SAB4600315</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-mouse DyLight 755</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen SA5-10171</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-rabbit DyLight 755</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen SA5-10043</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SDS</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SDS001,500</td>
			<td>CAUTION, oral skin and eye toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shandon multi-program robotic slide stainer</td>
			<td>LabX</td>
			<td align="right">11384903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shandon Xylene Substitute,</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CA89413-336</td>
			<td>CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shaking water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SlowFade Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td align="right">1545801</td>
			<td>CAUTION, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stripping Buffer: mix 20 ml 10% w/v SDS with 12.5 ml 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), and 67.5 ml ultra-pure water. Under a fume hood, add 800 uL of 2-mercapto ethanol (114,4 mM final concentration)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-HCl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VIS Software</td>
			<td>Visiopharm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Whole slide scanner Olympus BX61VS</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Microscope: Olympus Slide Scanner BX61VS, 5 slides scanner, motorized stage, autofocus. Camera: Lightsource: Xcite-120. Filters: BrightLine&#174; Sedat filter set (# LED-DA/FI/TR/Cy5-4X4M-B-000, Semrock)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736-4L</td>
			<td>CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylene : Ethanol solution (1:1 v/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>CAUTION, harmful by ingestion, inhalation, fatal if sking absortion. Eye irritation. Use fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization, quantification, and mapping of immune cell populations in the tumor microenvironment

Die Immunlandschaft der Tumormikroumgebung (TME) ist ein entscheidender Faktor für die Krebsprogression und die Reaktion auf die Therapie. Insbesondere die Dichte und die Lage von Immunzellen in der TME haben wichtige diagnostische und prognostische Werte. Die multiomische Profilierung der TME hat unser Verständnis der zahlreichen zellulären und molekularen Netzwerke, die die Tumorinitiierung und -progression regulieren, exponentiell verbessert. Diese Techniken enthalten jedoch keine Informationen über die räumliche Organisation von Zellen oder Zell-Zell-Interaktionen. Erschwingliche, zugängliche und einfach auszuführende Multiplexing-Techniken, die eine räumliche Auflösung von Immunzellen in Gewebeabschnitten ermöglichen, sind erforderlich, um einzelzellbasierte Hochdurchsatztechnologien zu ergänzen. Hier wird eine Strategie beschrieben, die serielle Bildgebung, sequenzielle Beschriftung und Bildausrichtung integriert, um virtuelle Multiparameter-Dias ganzer Gewebeabschnitte zu generieren. Virtuelle Folien werden anschließend automatisiert mithilfe benutzerdefinierter Protokolle analysiert, die die Identifizierung, Quantifizierung und Zuordnung von zellbasierten Zellpopulationen ermöglichen. Die Bildanalyse erfolgt in diesem Fall mit den Analysemodulen Tissuealign, Author und HISTOmap. Wir stellen ein Beispiel vor, in dem wir diese Strategie erfolgreich auf eine klinische Probe angewendet haben, indem wir die Informationen, die aus begrenzten Gewebeproben gewonnen werden können, maximiert und einen unvoreingenommenen Blick auf das TME im gesamten Gewebebereich bieten.

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Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment

Hier beschreiben wir eine einfache und zugängliche Strategie zur Visualisierung, Quantifizierung und Kartierung von Immunzellen in formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Tumorgewebeabschnitten. Diese Methode kombiniert vorhandene Bildgebungs- und digitale Analysetechniken mit dem Ziel, die Multiplexing-Fähigkeit und die Multiparameteranalyse von Imaging-Assays zu erweitern.

Visualisierung, Quantifizierung und Kartierung von Immunzellpopulationen in der Tumormikroumgebung

The immune landscape of the tumor microenvironment (TME) is a determining factor in cancer progression and response to therapy. Specifically, the density ...

Die räumliche Organisation der Immunzellen in der Tumormikroumgebung hat einen klinischen Wert. Diese Strategie kann leicht für die Visualisierung, Quantifizierung und Kartierung von Immunzellen innerhalb von Tumorgewebe verwendet werden. Die Immuntherapie hat die Krebsbehandlung revolutioniert.Allerdings reagieren nicht alle Patienten gut. Diese Strategie kann dazu dienen, die Gewebe-Immun-Signaturen zu definieren, die eine gute Anti-Tumor-Reaktion vorhersagen können. Testen Sie vor der Durchführung eines Experiments die Antikörperkombinationen und Stripping-Techniken an Kontrollgeweben und überprüfen Sie, ob die APPs bei der Detektion von Markern von Interesse genau sind.Da schriftliche Beschreibungen von Bildanalysemethoden eine ausgeklügelte technische Sprache verwenden, erleichtert die Kombination von Text und Video ein besseres Verständnis und eine bessere Replikation der Methodik. Für die Antigenrückgewinnung von formalinfixierten, paraffineingebetteten Tumorgewebeabschnitten tauchen Sie die entwachste Gewebeprobe in ein Coplin-Glas mit Antigen-Retrieval-Lösung ein und legen Sie das Glas in einen elektrischen Schnellkochtopf, der Leitungswasser enthält. Der Wasserstand sollte die Hälfte der Höhe des Glases nicht überschreiten, damit sich das Wasser nicht mit der Antigen-Retrievallösung vermischt.Schließen Sie den Deckel und das Druckventil am Herd und behandeln Sie die Dias 10 Minuten lang mit hohem Druck. Ziehen Sie am Ende der Behandlung den Herd ab, lassen Sie den Druck los und öffnen Sie den Deckel. Nachdem die Dias im Herd für 30 Minuten abgekühlt sind, waschen Sie die Proben zwei Mal für fünf Minuten in frischem PBS pro Wäsche in einem neuen Coplin-Glas, und verwenden Sie dann einen hydrophoben Stift, um eine Barriere um jeden Gewebeabschnitt zu ziehen.Als nächstes tauchen Sie die Dias in 0,1-Molarenglycin in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur ein, bevor Sie die Dias zweimal in PBS spülen, wie gezeigt. Nach der zweiten Wäsche die Dias in eine Feuchtigkeitskammer geben und jeden Gewebeabschnitt mit einer Blockierlösung abdecken. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur die Abschnitte zweimal für fünf Minuten in frischem PBS-Tween pro Wäsche abspülen und dann die primären, in Blockierlösung verdünnten Antikörper zu jedem Dia, vor Licht geschützt, hinzufügen.Am Ende der Inkubation die Dias dreimal in frischem PBS-Tween für fünf Minuten pro Wäsche abspülen, dann die Abschnitte mit den entsprechenden Sekundärantikörpern für eine Stunde bei Raumtemperatur beschriften. Am Ende der Inkubation spülen Sie die Dias dreimal in frischem PBS-Tween für fünf Minuten pro Wäsche. Folgen Sie mit einer einzigen Spülung in doppelt destilliertem Wasser.Entfernen Sie das überschüssige Wasser von jedem Schlitten und montieren Sie das Gewebe mit Montagemedium, ergänzt durch DAPI und einen Abdeckschlitten. Nachdem Sie das überschüssige Montagemedium herausgequetscht haben, lassen Sie die Dias 20 Minuten bei Raumtemperatur trocknen, geschützt vor Licht, bevor Sie bilder für alle Kanäle mit einem Ganzdiascanner erfassen. Öffnen Sie nach dem Scannen die Bilder in der Bildanalysesoftware, und klicken Sie auf die Registerkarte Tissuealign.Um die Bilder zu importieren, die in das Folienfach ausgerichtet werden sollen, wählen Sie das erste Bild aus, das aus der Datenbank ausgerichtet werden soll. Wenn alle Bilder geladen wurden, klicken Sie in den Schritten Workflow auf Weiter, um die Bilder zu verknüpfen, und ziehen Sie alle Bilder, die am ersten Bild ausgerichtet werden sollen, und legen Sie sie ab. Wenn alle Bilder entsprechend verknüpft wurden, verwenden Sie mindestens drei Pins pro Bild, die homologe Gewebemerkmale in den verknüpften Bildern anzeigen.Verwenden Sie einen Pin, um das erste Bild zu verfolgen, um die Qualität der resultierenden Ausrichtung zu überprüfen. Wenn eine zufriedenstellende Ausrichtung erreicht wurde, klicken Sie auf Weiter, um die Bildebenen anzuzeigen und das zusammengesetzte Bild in der Datenbank zu speichern. Um eine Gewebeerkennung mit dem benutzerdefinierten Protokoll APP 1 durchzuführen, öffnen Sie die Registerkarte Bildanalyse und öffnen Sie das zusammengesetzte Bild im Bildanalysemodul.Klicken Sie auf das Symbol APP öffnen und die entsprechende APP auswählen. Um zu bestätigen, dass die APP funktioniert, navigieren Sie zu einer ausgewählten Gewebeposition, und klicken Sie auf Vorschau. Wenn die Ergebnisse zufriedenstellend sind, klicken Sie auf , um das Bild mit der ausgewählten APP zu verarbeiten.Während der Verarbeitung bestimmt die APP, ob das Pixel mit dem Gewebe verknüpft ist, um die Umwandlung aller gewebeassoziierten Pixel in einen Bereich von Interesse zu ermöglichen. Der neu erstellte Interessenbereich kann dann auf jedes der ausgerichteten Bilder übertragen werden. Klicken Sie am Ende der Analyse auf Datei und Speichern, um das geänderte Bild mit dem neu erstellten Interessenbereich zu speichern.Für die Segmentierung des Gewebes in Stroma und Parenchym öffnen Sie die Registerkarte Bildanalyse und wählen Sie die interessierten Dateien aus der Datenbank aus. Öffnen App 2, APP 2 verwendet die PSR-gefärbte Bild für Gewebesegmentierung. Vorschau APP 2 durch Verarbeitung des Bildes in einem ausgewählten Sichtfeld.Wenn die Ergebnisse zufriedenstellend sind, klicken Sie auf Ausführen, um APP 2 auf dem vollständigen Bild zu verarbeiten. Die Interessenregion des Gewebes wird in Stroma und Parenchym segmentiert und ihre jeweiligen Bereiche bestimmt. Die neu geschaffenen Bereiche von Interesse für stroma und parenchyma können auf die ausgerichteten Bilder übertragen werden, dann exportieren und speichern Sie das modifizierte Bild wie gezeigt.Um Zellpopulationen von Interesse zu identifizieren und zu quantifizieren, importieren Sie das segmentierte Bild von Interesse in das Bildanalysemodul. Öffnen Sie nach dem Anpassen der Farbe APP 3. APP 3 wird die Zellpopulationen von Interesse erkennen und sie innerhalb des Parenchyms und des Stromas quantifizieren.Wenn die Ergebnisse zufriedenstellend sind, führen Sie APP 3 auf dem vollständigen Bild aus. Alle einzelnen Von interesseten Zellen werden beschriftet, ihre Gewebekoordinaten gespeichert und die Dichte der Voninteresseszellen in den Stroma- und Parenchymalregionen bestimmt. Das geänderte Bild kann dann wie gezeigt gespeichert werden.Um die Gewebe-Wärmezuordnung der mit Der Interessen zelleiver bezeichneten Objekte durchzuführen, öffnen Sie das entsprechende benutzerdefinierte Protokoll im APP-Auswahlfenster, und klicken Sie auf Ausführen, um die APP aufzufordern, die Koordinaten der mit Antikörpern beschrifteten Objekte zum Generieren der Heatmap zu verwenden. Hot-Spot-Bereiche, rot hervorgehoben, enthalten die höchste Dichte der Zellpopulation von Interesse, während die dunkelblauen Bereiche die niedrigsten haben. Die Wärmekarte einer bestimmten Zellpopulation kann auf die ausgerichteten Bilder überlagert werden, um zusätzliche Informationen darüber zu liefern, wie diese Zellen innerhalb der Tumormikroumgebung organisiert sind.Exportieren Und speichern Sie dann die Gewebe-Wärmekarte. Es ist wichtig, die Spezifität der Beschriftung, die Genauigkeit der entworfenen APPs und die Abisolierungs- und Reproduziereffizienz der verschiedenen Flecken auf demselben Abschnitt zu überprüfen. Durch die Integration von serieller Bildgebung, sequentieller Kennzeichnung und Gewebeausrichtung können mehr Marker gleichzeitig visualisiert und weitere Informationen aus begrenzten klinischen Proben extrahiert werden.Die H&E-Färbung von resektierten Tumorgewebeabschnitten ermöglicht die Bewertung der Gewebearchitektur, der Zellmorphologie und klinisch relevanter Parameter wie maligne Art, Tumorgrad und allgemeine Immuninfiltration. CD34 Färbung ermöglicht den Nachweis von Endothelzellen. Cytokeratin 8/18 Färbung zeigt das Vorhandensein von Epithelzellen, und Anti-Alpha glatte Muskel-Actin Färbung ermöglicht die Identifizierung von fibrogenen, aktivierten, leberstellaten Zellen.Das Reprobing mit Antikörpern gegen CD68 und Desmin ermöglicht den Nachweis von Makrophagen bzw. Myofibroblasten. Um das Tumor-Immun-Infiltrat besser charakterisieren zu können, kann eine Färbung nach T-Zell-Markern und Myeloperoxidase durchgeführt werden. Picro Sirius Rote Färbung kann auch durchgeführt werden, um fibrillares Kollagen zu visualisieren und Stroma und Parenchymsegmentierung zu erleichtern.Gewebeassoziierte Pixel innerhalb der gebeizten Abschnitte können identifiziert werden, um die Segmentierung verschiedener Fächer innerhalb eines bestimmten Interessenbereichs zu ermöglichen. Die von Interesse sindden Zellpopulationen können dann innerhalb jeder Region identifiziert werden, so dass Gewebekarten erstellt werden können, für die Regionen mit hoher Dichte für eine bestimmte Zellpopulation als Hotspots und Regionen mit einer relativ geringen Dichte als kalte Flecken angezeigt werden. Diese Methode zur Identifizierung, Quantifizierung und Kartierung von Immunzellen in Gewebeproben kann an spezifische Forschungsfragen und Marker von Interesse angepasst und validiert werden.Diese Strategie kann auf Gewebe-Mikroarrays für die Analyse mit hohem Durchsatz angewendet werden. Es kann auch mit In-situ-Hybridisierung kombiniert werden, um gleichzeitig In-situ-Protein und Genexpression zu untersuchen. Wir haben diese Strategie verwendet, um IL-17A-produzierende Zellen in situ in fibrotischem Lebergewebe von Patienten zu identifizieren und zu kartieren.Wie im Protokoll angegeben, sind mehrere Reagenzien chemisch gefährlich, und die entsprechenden Verfahren sollten in einer chemischen Haube mit der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung und Vorsichtsmaßnahmen durchgeführt werden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Seven Steps to Cells Stellate

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Die Quantifizierung der Atem Burst Antwort als Indikator für Angeborene Immunsystem Gesundheit in Zebrafisch

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

Ein CFSE-basierten Assay die Migration von murinen Haut Dendritischen Zellen in Lymphknoten während der Infektion zu studieren mit<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bazillus Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Molekulare Diffusion in Plasmamembranen von primären Lymphozyten mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie gemessen

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Nicht-invasive Probenahme von Schleimhaut-Flüssigkeit für die Quantifizierung von In Vivo oberen Atemwegen immun-Mediator-Level

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

Eine Immunohistopathologic Untersuchung der Folat-Rezeptor Beta Makrophagen und vaskuläre immun Mikroumgebung in riesige Zelle Arterienentzündung Profil

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Flow Cytometric Analyse der Lymphozyteninfiltration im Zentralnervensystem während der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...