Name: visualization, quantification, and mapping of immune cell populations in the tumor microenvironment
Uploaded: 2020-03-25T14:00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment at JoVE.com

हम अध्ययन प्रतिभागी को धन्यवाद देते हैं। हम ऊतक के नमूनों और सभी संबद्ध नैदानिक जानकारी की वसूली के लिए एचबीपी बायोबैंक के समन्वयक लुईस रूसो को धन्यवाद देते हैं। हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए विसिओपंसे से सीआरएचयूएम और माइकल पेर्श में आणविक विकृति और सेल इमेजिंग कोर सुविधाओं को स्वीकार करते हैं। वित्तपोषण: इस अध्ययन को कनाडाई लिवर फाउंडेशन, फोड्स डी रेचेचे डु क्यूबेक-सैंटे (एफआरक्यूएस) एड्स एंड संक्रामक रोग नेटवर्क (रेसेउ सिडा-एमआई) और हेपेटाइटिस सी (CanHepC) पर कनाडाई नेटवर्क से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। CanHepC कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों (CIHR) (एनएचसी-142832) और कनाडा की सार्वजनिक स्वास्थ्य एजेंसी से एक संयुक्त पहल द्वारा वित्त पोषित है । एम.एफ.एम. को यूनीवर्सिट डी मॉन्ट्रियल, बोर्स गेब्रियल मार्क्विस और एफआरक्यूएस से फैलोशिप मिली। टीएफ को CIHR और CanHepC से डॉक्टरेट फैलोशिप प्राप्त हुई । एससी हेपेटोबिलियरी और अग्नाशय ऑन्कोलॉजिकल सर्जरी, यूनीवर्सिट डी मॉन्ट्रियल में रोजर-डेस-ग्रोसिलर्स चेयर रखती है।
लेखक योगदान: M.F.M. डिजाइन, प्रयोग किया, और डेटा का विश्लेषण किया । टीएफ डिजाइन प्रयोग। ए.सी.बी. तकनीकी मार्गदर्शन प्रदान किया। जी.एस. अध्ययन विषय के सभी रोग मूल्यांकन किया और सभी रोग पहलुओं पर इनपुट प्रदान की है। एलएम ने एच एंड ई धुंधला, अनुकूलित और छवि अधिग्रहण किया। एमएने ने पीएसआर दाग का प्रदर्शन किया और मूल्यवान तकनीकी इनपुट प्रदान किया । एनबी छवि विश्लेषण में योगदान दिया । एससी एचबीपी बायोबैंक के लिए प्रमुख अन्वेषक है और बायोबैंक के समग्र संचालन की देखरेख के लिए जिम्मेदार है। उन्होंने परियोजना के सभी पहलुओं और इसके नैदानिक प्रभावों पर अमूल्य इनपुट भी प्रदान किया । M.F.M., T.F., और N.H.S. संकल्पनात्मक और अध्ययन डिजाइन किया । N.H.S. काम की निगरानी की और धन प्राप्त किया । M.F.M., T.F., A.C.B, और N.H.S. पांडुलिपि लिखा था । सभी लेखकों ने पांडुलिपि की समीक्षा की और उसे मंजूरी दी ।

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E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Staining+by+Sequential+Immunostaining+and+Antibody+Removal+on+Routine+Tissue+Sections.">Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li></ol>

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते ।

कैंसर और अन्य इम्यूनोलॉजिकल विकारों में प्रतिरक्षा परिदृश्य को मैप करने के लिए ऊतक वर्गों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्थानिक समाधान की अनुमति देने वाली मल्टीप्लेक्सिंग तकनीकों को निष्पादित करने के लिए सरल, सुलभ और आसान। यहां, हम एक ऐसी रणनीति का वर्णन करते,हैं जो12,,13,17,19के मल्टीप्लेक्सिंग क्षमता और बहुआयामी मूल्यांकन का विस्तार करने के लिए व्यापक रूप से उपलब्ध लेबलिंग और डिजिटल विश्लेषण तकनीकों को एकीकृत करती है।, विभिन्न मार्कर के लिए तीन धारावाहिक वर्गों का धुंधला, और अलग-अलग तकनीकों के माध्यम से वर्गों का पुन: उपयोग, हमें एच एंड ई और पीएसआर दाग के अलावा 11 मापदंडों की कल्पना करने में सक्षम बनाया। इन वर्गों से छह छवियों को ऊतक संरेखण मॉड्यूल का उपयोग करके स्वचालित फैशन में गठबंधन किया गया था। संरेखण एक ही खंड से उत्पन्न छवियों के लिए व्यक्तिगत सेल स्तर पर सटीक था और पड़ोसी वर्गों से उत्पन्न छवियों के लिए अत्यधिक सामंजस्य था। वर्चुअल मल्टीप्लेक्सिंग ने हमें यह निर्धारित करने में सक्षम बनाया कि एक अनुभाग में कल्पना किए गए मार्कर किसी अन्य समीपस्थ अनुभाग में कल्पना किए गए मार्कर से कैसे संबंधित हैं। जबकि कुछ स्टेनिंग्स ने COIs का लेबल लगाया, अन्य ने टीसी का लेबल लगाया, जिससे हमें विभिन्न टीसी में COIs की मात्रा निर्धारित करने की अनुमति मिली । COIs के स्वचालित मात्राकरण के लिए सॉफ्टवेयर उपकरणों के उपयोग ने छवियों के प्रसंस्करण को बहुत सरल और त्वरित किया। इसके अलावा, डिजिटल विश्लेषण को चयनित क्षेत्रों के बजाय पूरे ऊतक वर्गों पर लागू किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप TME का निष्पक्ष प्रतिनिधित्व होता है। इसके अलावा, क्योंकि सीओआई के ऊतक निर्देशांक पंजीकृत थे, ऊतक हीटमैप उत्पन्न करना संभव था।
इस प्रोटोकॉल में कई क्षेत्र हैं जहां समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती है। सबसे पहले, गरीब एंटीजन पुनर्प्राप्ति mIF की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं, इसलिए एंटीजन पुनर्प्राप्ति बफर और अवधि के प्रकार विशिष्ट परख के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए/ दूसरा, उपयोग किए जाने वाले अवरुद्ध समाधान के प्रकार को प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी के ऊतकों/एंटीजन/प्रजातियों के अनुकूल किया जाना चाहिए । हमारे हाथों में, प्रजातियों से 10% कुल सीरम के अलावा जहां ऊतक अवरुद्ध एफसी रिसेप्टर्स से आता है, और इस प्रकार गैर विशिष्ट एंटीबॉडी बाध्यकारी कम। प्रजातियों से सीरम के 10% के अलावा माध्यमिक एंटीबॉडी में उठाया गया था ऊतक अनुभाग के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के प्रत्यक्ष गैर विशिष्ट लगाव को कम करेगा । तीसरा, उचित सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों का उपयोग करके प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी की विशिष्टता का सत्यापन आवश्यक है। चौथा, कुछ चैनलों में ऑटोफ्लोरेसेंस में वृद्धि और प्राथमिक एंटीबॉडी विपठ्ठन पर डीपीआई का प्रसार भी आम है। बढ़ी हुई ऑटोफ्लोरेसेंस को संबोधित करने के लिए, हमने प्राथमिक/माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़े का उपयोग किया जहां विशिष्ट संकेत में पृष्ठभूमि के कम से कम 5x तीव्रता मूल्य थे । अंत में, कुछ उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी नियमित रूप से अलग करना प्रक्रियाओं के साथ नहीं किया जा सकता है । इस मामले में, हम लेबलिंग के अंतिम दौर में इस तरह के एंटीबॉडी का उपयोग करने की सलाह देते हैं। उपयोगकर्ता को ब्याज के एंटीबॉडी के लिए इष्टतम विन्यास खोजने के लिए अलग-अलग धुंधला दृश्यों की कोशिश करनी पड़ सकती है। लेबलिंग के दूसरे या तीसरे दौर में आगे बढ़ने से पहले अलग करने की दक्षता की पुष्टि की जानी चाहिए ।
इस रणनीति की मुख्य सीमा और चुनौती ब्याज के मार्कर के लिए प्राथमिक और माध्यमिक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के सही संयोजन खोज रही है। विभिन्न प्रजातियों में या विभिन्न आइसोटाइप के साथ उठाए गए प्राथमिक एंटीबॉडी ढूंढना जो एक साथ उपयोग किया जा सकता है, वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध है द्वारा सीमित है। अधिकांश पूरी स्लाइड स्कैनर लैंप और फिल्टर से लैस हैं जो इमेजिंग को अधिकतम पांच चैनलों की अनुमति देते हैं, और सही प्रजातियों और सही फ्लोरोफोर में माध्यमिक एंटीबॉडी हमेशा उपलब्ध नहीं होते हैं। हम आंशिक रूप से धारावाहिक धुंधला और अनुक्रमिक लेबलिंग का उपयोग कर इन सीमाओं पर काबू पा लिया । ब्याज के मार्कर के लिए सबसे अच्छा संयोजन पर पहुंचने के लिए कई एंटीबॉडी संयोजनों का परीक्षण करने की आवश्यकता हो सकती है। एक और सीमा डीपीआई धुंधला की गुणवत्ता है, क्योंकि अलग करना और पुनर्जांच हमेशा नाभिक विभाजन प्रदर्शन की अनुमति नहीं दे सकता है।
ऊतक संरेखित मॉड्यूल के लिए उपयोगकर्ताओं से न्यूनतम प्रशिक्षण और कोई प्रोग्रामिंग कौशल की आवश्यकता होती है। सॉफ्टवेयर सैद्धांतिक रूप से असीमित संख्या में छवियों के संरेखण की अनुमति देता है। हालांकि, सटीक संरेखण वर्गों की संबंधितता पर निर्भर करता है, जहां करीब वर्ग जो अधिक हिस्टोलॉजिकल रूप से सामंजस्यपूर्ण हैं, अधिक सटीक रूप से गठबंधन कर रहे हैं। हमने एपीपी उत्पन्न करने के लिए विज़ के लेखक मॉड्यूल का उपयोग किया। एपीपी बनाने के लिए छवि विश्लेषण के बुनियादी ज्ञान की आवश्यकता होती है, लेकिन किसी अन्य छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करते समय यह समान रूप से मामला है। अन्य छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर की तुलना में विज़ के अद्वितीय फायदों में विभिन्न तरीकों (जैसे, आईएफ, हिस्टोकेमिस्ट्री, आईएचसी) का उपयोग करके तैयार किए गए वर्गों से छवियों का स्वचालित संरेखण शामिल है। यह वर्चुअल मल्टीप्लेक्सिंग का उपयोग करके ब्याज के कई मार्कर के सहस्थानीयकरण अध्ययन की अनुमति देता है। इसके अलावा, एपीपी का लचीला और उपयोगकर्ता के अनुकूल डिजाइन उपयोगकर्ता-विशिष्ट अनुकूलन की अनुमति देता है। स्वचालित मात्राीकरण और मानचित्रण, और पूरे ऊतक वर्गों को संसाधित करने की संभावना, समय बचाता है और दृश्य निरीक्षण द्वारा मैनुअल गिनती की तुलना में पूर्वाग्रह को कम करता है।
यह रणनीति कैंसर और ऑटोइम्युनिटी के संदर्भ में ऊतक इम्यूनोलॉजी के लिए एक बहुत ही उपयोगी अनुसंधान उपकरण है लेकिन नैदानिक उपयोग के लिए अमान्य बनी हुई है। अतिरिक्त मानकीकरण और सत्यापन के साथ, इसका उपयोग भविष्य में कई अनुप्रयोगों (उदाहरण के लिए, कैंसर में प्रतिरक्षा परिदृश्य को भविष्यवाणी करने और इम्यूनोथेरप्यूटिक एजेंटों की प्रतिक्रिया की निगरानी करने के लिए मैप करने के लिए किया जा सकता है)। शकुन बायोमार्कर के साथ रोग मूल्यांकन गठबंधन करने के लिए इसे विभिन्न भड़काऊ स्थितियों (उदाहरण के लिए, भड़काऊ आंत्र रोग) के अनुकूल भी बनाया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल में मुख्य महत्वपूर्ण कदम लेबलिंग की दक्षता/विशिष्टता और इच्छित उपयोग या बायोमार्कर के लिए डिजाइन किए गए एपीपी की मजबूती है । इसलिए, दृश्य निरीक्षण द्वारा नियमित सत्यापन, विशेष रूप से एक नया ऐप डिजाइन करने पर, आवश्यक है। एक ही खंड पर अलग करने और फिर से जांच या विभिन्न प्रकार के दाग के कई दौरों का कुशल उपयोग महत्वपूर्ण घटक हैं और ऊतक या अनुभाग विशिष्ट हो सकते हैं। बड़े बैच विश्लेषण के साथ आगे बढ़ने से पहले ऐसी प्रक्रियाओं की दक्षता की पुष्टि करना महत्वपूर्ण है।
संक्षेप में, हम एक रणनीति प्रदान करते हैं जो मात्रात्मक और स्थानिक जानकारी को अधिकतम करती है जिसे मूल्यवान नैदानिक ऊतक नमूनों से प्राप्त किया जा सकता है। इस पद्धति को लागू करने के लिए आवश्यक संसाधन, उपकरण और ज्ञान व्यापक रूप से सुलभ हैं। हम TME में प्रतिरक्षा सेल आबादी की पहचान करने, मात्रा निर्धारित करने और मानचित्रण करने के उद्देश्य से परखों की योजना बनाने के लिए एक उपयोगी गाइड के रूप में इस पद्धति का प्रस्ताव करते हैं।

कैंसर विकास एक मल्टीस्टेप प्रक्रिया का परिणाम है जिसमें घातक कोशिकाओं और TME के बीच पारस्परिक बातचीत शामिल है। ट्यूमर कोशिकाओं के अलावा, TME गुटनिरपेक्ष कोशिकाओं, स्ट्रोमल कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिका आबादी, और एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम)1से बना है । ट्यूमर ऊतक के विभिन्न सेलुलर और संरचनात्मक घटकों का स्थानिक संगठन और कैंसर और पड़ोसी गैर - कैंसर कोशिकाओं के बीच गतिशील आदान - प्रदान अंततः ट्यूमर की प्रगति और चिकित्सा2,3,,4के प्रति प्रतिक्रिया को मिलाना । यह दर्शाया गया है कि कैंसर में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 5,6कोविनियमित कर रही है । नियोप्लास्टिक घाव और आसन्न ऊतक में घुसपैठ करने वाली विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिका आबादी विशिष्ट स्थानिक वितरण पैटर्न और विभिन्न सक्रियण और भेदभाव राज्यों को विभिन्न कार्यों (जैसे, समर्थक बनाम एंटीट्यूमर) से जुड़ी प्रदर्शित करती है। ये अलग-अलग प्रतिरक्षा आबादी और उनके पैरामीटर ट्यूमर और स्ट्रोमल डिब्बों के साथ ओवरटाइम को विकसित करते हैं।
एकल सेल मल्टीोमिक्स प्रोफाइलिंग की अनुमति देने वाली प्रौद्योगिकियों के उद्भव ने कैंसरजन्यऔर ट्यूमर प्रगति को विनियमित करने वाले कई सेलुलर और आणविक नेटवर्क ों की हमारी समझ को तेजी से बढ़ाया है। हालांकि, अधिकांश एकल सेल-आधारित उच्च-थ्रूपुट विश्लेषणात्मक उपकरणों को ऊतक व्यवधान और एकल सेल अलगाव की आवश्यकता होती है, जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं के स्थानिक संगठन और सेल-सेल इंटरैक्शन7के बारे में जानकारी की हानि होती है। क्योंकि TME में विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्थान और व्यवस्था में नैदानिक और शकुन मूल्य है, स्थानिक संकल्प की अनुमति देने वाली प्रौद्योगिकियां एकल कोशिका-आधारित प्रतिरक्षा प्रोफाइलिंग तकनीकों का एक अनिवार्य पूरक हैं।
परंपरागत रूप से, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) और मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस (एमआईएफ) जैसी इमेजिंग तकनीकों को कम संख्या में बायोमार्कर तक सीमित किया गया है जिन्हें एक साथ कल्पना की जा सकती है। इस सीमा ने ट्यूमर-घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं की स्थानिक गतिशीलता के अध्ययन में बाधा डाली है, जो आमतौर पर कई फेनोटाइपिक मार्कर द्वारा परिभाषित किए जाते हैं। इमेजिंग और एनालिटिकल टूल्स में हाल ही में हुई प्रगति ने मल्टीप्लेक्सिंग की संभावनाओं का विस्तार किया है। हिस्टो-साइटोमेट्री और इमेजिंग मास साइटोमेट्री जैसी नई एंटीबॉडी आधारित लेबलिंग प्रौद्योगिकियों का उपयोगक्रमशः8,9तक 12 और 32 बायोमार्कर को अलग करने के लिए किया गया है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग, लेबलिंग की आवश्यकता नहीं तकनीक, एक ऊतक अनुभाग10,,11में एक साथ हजारों बायोमार्कर छवि की क्षमता रखता है। हालांकि इन तकनीकों को पहले से ही कैंसर में ऊतक प्रतिरक्षा परिदृश्य विच्छेदन के लिए महान क्षमता दिखाई है, वे अत्यधिक परिष्कृत और महंगे उपकरण और सॉफ्टवेयर का उपयोग करें और शोधकर्ताओं के बहुमत के लिए आसानी से सुलभ नहीं हैं ।
वैकल्पिक रूप से, पारंपरिक आईएचसी और mIF की मल्टीप्लेक्सिंग क्षमता का विस्तार धारावाहिक इमेजिंग, लेबलिंग के अनुक्रमिक दौर और स्पेक्ट्रल इमेजिंग7,,12,,13,,14,,15,,16के उपयोग के माध्यम से किया गया है। ये तकनीकें उसी से या धारावाहिक ऊतक वर्गों से कई छवियां उत्पन्न करती हैं जिन्हें छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके आभासी मल्टीपैरामीटर स्लाइड में समेकित किया जा सकता है। नतीजतन, मार्कर की संख्या है कि कल्पना की जा सकती है और एक साथ विश्लेषण बढ़ जाती है ।
यहां, हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रिएजेंट्स, किफायती माइक्रोस्कोपी उपकरण, और उपयोगकर्ता के अनुकूल सॉफ्टवेयर(चित्रा 1)का उपयोग करके ऊतक मल्टीप्लेक्स परखों के तर्कसंगत डिजाइन के लिए एक रणनीति का प्रस्ताव करते हैं। यह पद्धति वर्चुअल मल्टीपैरामीटर स्लाइड उत्पन्न करने के लिए सीरियल इमेजिंग, अनुक्रमिक मल्टीप्लेक्स लेबलिंग, पूरे टिश्यू इमेजिंग और ऊतक संरेखण को एकीकृत करती है जिसका उपयोग ऊतक वर्गों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्वचालित परिमाणीकरण और मानचित्रण के लिए किया जा सकता है। इस रणनीति का उपयोग करते हुए, हमने एक वर्चुअल स्लाइड बनाई जिसमें 11 बायोमार्कर प्लस दो अक्सर इस्तेमाल किए जाने वाले हिस्टोलॉजिकल दाग: हेमैटोक्सिलिन और इओसिन (एच एंड ई) और पिप्रोसिरियस रेड (पीएसआर) शामिल हैं। कई प्रतिरक्षा कोशिका आबादी की पहचान की गई, स्थित है, और विभिन्न ऊतक डिब्बों में मात्रा निर्धारित और उनके स्थानिक वितरण ऊतक हीटमैप ्स का उपयोग करहल किया। यह रणनीति उन जानकारी को अधिकतम करती है जिन्हें सीमित नैदानिक नमूनों से प्राप्त किया जा सकता है और पूरे ऊतक, कोर सुई बायोप्सी और ऊतक माइक्रोरेस सहित फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) संग्रहीत ऊतक नमूनों पर लागू होता है। हम TME में प्रतिरक्षा कोशिका आबादी की पहचान, मात्राकरण और मानचित्रण के लिए कस्टम परख डिजाइन करने के लिए एक उपयोगी गाइड के रूप में इस पद्धति का प्रस्ताव करते हैं।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1419px;" width="1418">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:649px;">Antigen Retrieval Solution: Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% v/v Tween 20, pH 6.0)</td>
			<td style="width:257px;"></td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blocking Solution: 1 % BSA, 10 % filtered human serum, 10 % filtered donkey serum, 0.1 % Tween 20, and 0.3% Triton in PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>800-095-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coplin jars (EASYDIP SLIDE STAINING SYSTEM)</td>
			<td>Newcomersupply</td>
			<td>5300KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545E 22*50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Direct Red 80</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td align="right">365548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol 100%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electric pressure cooker</td>
			<td>Salton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eosin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td align="right">3801600</td>
			<td>CAUTION, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td>CAUTION, harmful by inhalation, ingestion and skin absortion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FFPE section (4&#956;m) slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycine 0,1 M in PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hematoxylin Stain Solution, Gil 1. Formulation, Regular Strength</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3535-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Holder (EasyDip Staining Jar Holder)</td>
			<td>Newcomersupply</td>
			<td>5300RK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td align="right">22210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Humidity chamber</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z670138-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pap pen</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS-Tween 20 (0.1% v/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Permount Mounting Media</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Picric Acid 1.3 %</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6744</td>
			<td>CAUTION, skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Picro-Sirius Red/Fast Green solution: Fast Green 0.1 % w/v + Sirius Red 0.2 % w/v in 1,3 % picric acid solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-&#945;SMA</td>
			<td>Mouse IgG2a 1A4</td>
			<td>Sigma A2547</td>
			<td>Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD34</td>
			<td>Mouse IgG1 HPCA1/763</td>
			<td>Novus Biologicals NBP2-44568</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-Cytokeratin 8/18</td>
			<td>Rabbit EP17/EP30</td>
			<td>Agilent IR09461-2</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD68</td>
			<td>Mouse KP1</td>
			<td>Abcam ab955</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-Desmin</td>
			<td>Rabbit Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen PA5-16705</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD4</td>
			<td>Mouse N1UG0</td>
			<td>Affymetrix 14-2444</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-FoxP3</td>
			<td>Rabbit 1054C</td>
			<td>R &#38; D MAB8214</td>
			<td>Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-MPO</td>
			<td>Goat Polyclonal</td>
			<td>R &#38; D Systems AF3667</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD3</td>
			<td>Rabbit SP7</td>
			<td>Abcam ab16669</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD8</td>
			<td>Mouse C8/144B</td>
			<td>Invitrogen 14-0085-80</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-mouse A488</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-21202</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-Rabbit A488</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-21206</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-goat A568</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-11057</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-rabbit A647</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-31573</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Rat anti-mouse IgG1 A647</td>
			<td>RMG1-1</td>
			<td>Biolegend 406618</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Goat anti-mouse IgG2a CF568</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Sigma Aldrich SAB4600315</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-mouse DyLight 755</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen SA5-10171</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-rabbit DyLight 755</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen SA5-10043</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SDS</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SDS001,500</td>
			<td>CAUTION, oral skin and eye toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shandon multi-program robotic slide stainer</td>
			<td>LabX</td>
			<td align="right">11384903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shandon Xylene Substitute,</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CA89413-336</td>
			<td>CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shaking water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SlowFade Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td align="right">1545801</td>
			<td>CAUTION, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stripping Buffer: mix 20 ml 10% w/v SDS with 12.5 ml 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), and 67.5 ml ultra-pure water. Under a fume hood, add 800 uL of 2-mercapto ethanol (114,4 mM final concentration)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-HCl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VIS Software</td>
			<td>Visiopharm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Whole slide scanner Olympus BX61VS</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Microscope: Olympus Slide Scanner BX61VS, 5 slides scanner, motorized stage, autofocus. Camera: Lightsource: Xcite-120. Filters: BrightLine&#174; Sedat filter set (# LED-DA/FI/TR/Cy5-4X4M-B-000, Semrock)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736-4L</td>
			<td>CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylene : Ethanol solution (1:1 v/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>CAUTION, harmful by ingestion, inhalation, fatal if sking absortion. Eye irritation. Use fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization, quantification, and mapping of immune cell populations in the tumor microenvironment

ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट (TME) की प्रतिरक्षा परिदृश्य कैंसर की प्रगति और चिकित्सा के प्रति प्रतिक्रिया में एक निर्धारक कारक है। विशेष रूप से, टीएमई में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के घनत्व और स्थान में महत्वपूर्ण नैदानिक और शकुन मूल्य हैं। TME की मल्टीोमिक प्रोफाइलिंग ने ट्यूमर दीक्षा और प्रगति को विनियमित करने वाले कई सेलुलर और आणविक नेटवर्क की हमारी समझ में तेजी से वृद्धि की है। हालांकि, ये तकनीक कोशिकाओं या सेल-सेल इंटरैक्शन के स्थानिक संगठन के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करती है। एकल सेल-आधारित उच्च-थ्रूपुट प्रौद्योगिकियों के पूरक के लिए ऊतक वर्गों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्थानिक समाधान की अनुमति देने वाली मल्टीप्लेक्सिंग तकनीकों को निष्पादित करने में सस्ती, सुलभ और आसान। यहां, हम एक रणनीति का वर्णन करते हैं जो पूरे ऊतक वर्गों की आभासी मल्टीपैरामीटर स्लाइड उत्पन्न करने के लिए सीरियल इमेजिंग, अनुक्रमिक लेबलिंग और छवि संरेखण को एकीकृत करती है। आभासी स्लाइड बाद में उपयोगकर्ता-परिभाषित प्रोटोकॉल का उपयोग करके स्वचालित फैशन में विश्लेषण किया जाता है जो ब्याज की कोशिका आबादी की पहचान, मात्रा और मानचित्रण को सक्षम करता है। छवि विश्लेषण किया जाता है, इस मामले में विश्लेषण मॉड्यूल टिश्यूसंरेखित, लेखक और हिस्ताओमैप का उपयोग करके। हम एक उदाहरण प्रस्तुत करते हैं जहां हमने इस रणनीति को सफलतापूर्वक एक नैदानिक नमूने पर लागू किया, जो सीमित ऊतक नमूनों से प्राप्त की जा सकने वाली जानकारी को अधिकतम करता है और पूरे ऊतक अनुभाग में टीएमई का निष्पक्ष दृश्य प्रदान करता है।

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Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment

यहां, हम फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड ट्यूमर ऊतक वर्गों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की कल्पना, मात्रा और मानचित्रण के लिए एक सरल और सुलभ रणनीति का वर्णन करते हैं। यह पद्धति मौजूदा इमेजिंग और डिजिटल विश्लेषण तकनीकों को मल्टीप्लेक्सिंग क्षमता और इमेजिंग परखों के बहुमापदंडीय विश्लेषण के विस्तार के उद्देश्य से जोड़ती है।

ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट में रोग, परिमाणीकरण और प्रतिरक्षा सेल आबादी का मानचित्रण

The immune landscape of the tumor microenvironment (TME) is a determining factor in cancer progression and response to therapy. Specifically, the density ...

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