Name: visualization, quantification, and mapping of immune cell populations in the tumor microenvironment
Uploaded: 2020-03-25T14:00:00
Duration: 11 min
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研究参加者に感謝します。HBPバイオバンクのコーディネーターであるルイーズ・ルソーは、組織サンプルと関連するすべての臨床情報の回収に感謝します。我々は、優れた技術支援のために、CRCHUMの分子病理学および細胞イメージングコア施設と、Visiopharmのマイケル・パーシュの核施設を認める。資金:この研究は、カナダ肝臓財団、ケベック・サンテ(FRQS)エイズ・感染症ネットワーク(レゾーSIDA-MI)、C型肝炎に関するカナダネットワーク(CanHepC)からの助成金によって支援されました。CanHepCは、カナダ保健研究所(CIHR)(NHC-142832)とカナダ公衆衛生庁の共同イニシアチブによって資金提供されています。M.F.M.はモントリオール大学、ブルス・ガブリエル・マーキス、FRQSからフェローシップを受けました。T.F.はCIHRとCanHepCから博士課程のフェローシップを受けました。S.T.は、モントリオール大学の肝胆管および膵臓の病的手術でロジャー・デ・グロサイユ・チェアを開催しています。
著者の貢献: M.F.M. 設計、実験、および分析データ。T.F.は実験を設計しました。A.C-B.技術指導を受けています。G.S.は、研究対象のすべての病理学的評価を行い、すべての病理学的側面に関するインプットを提供した。L.M.はH&E染色、最適化、画像取得を行いました。M.N.A.はPSR染色を行い、貴重な技術的インプットを提供しました。N.B.は画像解析に貢献しました。S.T.はHBPバイオバンクの主任研究者であり、バイオバンクの全体的な運営を監督する責任があります。彼はまた、プロジェクトのすべての側面とその臨床的影響に関する貴重なインプットを提供しました。M.F.M、T.F.、N.H.S.は、この研究を概念化し、設計しました。N.H.S.は作業を監督し、資金を得ました。M.F.M.、T.F.、A.C-B、N.H.S.が原稿を書いた。すべての著者は原稿をレビューし、承認しました。

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	<li>Greten, F. R., Grivennikov, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+Cancer:Triggers,+Mechanisms,+and+Consequences.">Inflammation and Cancer:Triggers, Mechanisms, and Consequences.</a> Immunity. 51 (1), 27-41 (2019).</li><li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+validation+of+the+consensus+Immunoscore+for+the+classification+of+colon+cancer:+a+prognostic+and+accuracy+study.">International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study.</a> Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).</li><li>Binnewies, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+tumor+immune+microenvironment+(TIME)+for+effective+therapy.">Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy.</a> Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).</li><li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+the+tumor+immune+microenvironment+for+staging+and+therapeutics.">Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics.</a> Modern Pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 31 (2), 214-234 (2018).</li><li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+dynamics+of+intratumoral+immune+cells+reveal+the+immune+landscape+in+human+cancer.">Spatiotemporal dynamics of intratumoral immune cells reveal the immune landscape in human cancer.</a> Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).</li><li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+introduction+of+the+'Immunoscore'+in+the+classification+of+malignant+tumours.">Towards the introduction of the 'Immunoscore' in the classification of malignant tumours.</a> The Journal of Pathology. 232 (2), 199-209 (2014).</li><li>Finotello, F., Eduati, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Omics+Profiling+of+the+Tumor+Microenvironment:+Paving+the+Way+to+Precision+Immuno-Oncology.">Multi-Omics Profiling of the Tumor Microenvironment: Paving the Way to Precision Immuno-Oncology.</a> Frontiers in Oncology. 8, 430 (2018).</li><li>Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. 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R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry+Imaging:+A+Review+of+Emerging+Advancements+and+Future+Insights.">Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights.</a> Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).</li><li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype.">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).</li><li>Gendusa, R., Scalia, C. R., Buscone, S., Cattoretti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elution+of+High-affinity+(&gt;10-9+KD)+Antibodies+from+Tissue+Sections:+Clues+to+the+Molecular+Mechanism+and+Use+in+Sequential+Immunostaining.">Elution of High-affinity (&gt;10-9 KD) Antibodies from Tissue Sections: Clues to the Molecular Mechanism and Use in Sequential Immunostaining.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (7), 519-531 (2014).</li><li>van der Loos, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunoenzyme+staining:+methods+and+visualizations+for+the+observation+with+spectral+imaging.">Multiple immunoenzyme staining: methods and visualizations for the observation with spectral imaging.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 313-328 (2008).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labeling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labeling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).</li><li>Segnani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+Detection+of+Collagen+Fibers+by+Sirius+Red/Fast+Green+Is+More+Sensitive+than+van+Gieson+or+Sirius+Red+Alone+in+Normal+and+Inflamed+Rat+Colon.">Histochemical Detection of Collagen Fibers by Sirius Red/Fast Green Is More Sensitive than van Gieson or Sirius Red Alone in Normal and Inflamed Rat Colon.</a> PloS One. 10 (12), 0144630 (2015).</li><li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Staining+by+Sequential+Immunostaining+and+Antibody+Removal+on+Routine+Tissue+Sections.">Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li></ol>

著者らは利益相反を宣言しない。

がんやその他の免疫疾患の免疫の風景をマッピングするために、組織切片の免疫細胞の空間分解能を可能にする、簡単でアクセスしやすく、簡単に多重化技術を実行する必要があります。ここでは、イメージングアッ,セイ12、13、17、19,13,17の多重化能力と多次元評価を拡大するために広く利用可能なラベリングおよびデジタル分析技術を統合した戦略を説明する。19異なるマーカーのための3つの連続セクションの染色、およびストリップと再探査の技術によるセクションの再利用により、H&EおよびPSR染色に加えて11個のパラメータを可視化することができました。これらのセクションからの6つの画像はティッシュの位置合わせモジュールを使用して自動化された方法で整列した。同じセクションから発生した画像の個々のセルレベルでの位置合わせは正確で、隣接するセクションから発生する画像に対しては非常に一致していました。仮想多重化により、あるセクションで視覚化されたマーカーが、別の連続したセクションで視覚化されたマーカーと空間的にどのように関連するかを決定することができました。一部の染色にはCOIとラベル付けされたものもあれば、TCとラベル付けされ、異なるTCでCOIを定量化できるものもあります。COIの自動定量化のためのソフトウェアツールの使用は、画像の処理を大幅に簡素化し、加速しました。さらに、デジタル解析は、選択した視野の代わりに組織切片全体に適用され、TMEの公平な表現をもたらした。さらに、COIの組織座標を登録したため、組織ヒートマップを生成することが可能であった。
このプロトコルには、トラブルシューティングが必要な領域がいくつかあります。まず、不十分な抗原検索はmIFの品質に影響を与える可能性があるため、使用される特定のアッセイ/バイオマーカー条件に合わせて抗原検索バッファーの種類と持続時間を最適化する必要があります。第二に、使用されるブロッキング溶液の種類は、一次および二次抗体の組織/抗原/種に適合すべきである。我々の手では、組織がブロックされたFc受容体から来ている種からの10%の総血清の添加、したがって非特異的抗体結合を減少させた。二次抗体が上げられた種から血清の10%を添加することは、組織セクションへの二次抗体の直接非特異的な結合を最小限に抑えるであろう。第3に、適切な陽性および陰性対照を用いた一次および二次抗体の特異性の検証が必須である。第4に、一次抗体ストリッピング時の一部のチャネルにおける自己蛍光の増加およびDAPIの拡散も一般的である。強化された自己蛍光に対処するために、我々は、特定の信号が背景の少なくとも5倍の強度値を有する一次/二次抗体対を使用した。最後に、一部の高親和性抗体は、通常のストリッピング手順では溶出できません。この場合、我々は、標識の最後のラウンドでそのような抗体を使用することをお勧めします。ユーザは、目的の抗体に最適な構成を見つけるために、異なる染色配列を試す必要があります。ストリッピングの効率は、ラベリングの第2または第3ラウンドに進む前に確認する必要があります。
この戦略の主な制限と課題は、目的のマーカーに対する一次蛍光抗体と二次蛍光抗体の適切な組み合わせを見つけることです。異なる種で、または同時に使用することができる異なるアイソタイプで育てられた一次抗体を見つけることは、市販されているものによって制限される。ほとんどのスライドスキャナーには、最大5チャンネルのイメージングを可能にするランプとフィルタが装備されており、適切な種と右のフルオロフォアの二次抗体は常に利用できるとは限りません。シリアル染色とシーケンシャルラベリングを使用して、これらの制限を部分的に克服しました。いくつかの抗体の組み合わせは、目的のマーカーのための最良の組み合わせに到達するためにテストする必要があります。もう一つの制限は、DAPI染色の品質であり、ストリッピングおよびリプロレーションは常に核セグメンテーションを行うことを可能にするわけではないのでである。
ティッシュの整列モジュールは最低の訓練およびユーザーからのプログラミングの技術を要求しない。ソフトウェアは理論的には、画像の無制限の数の整列を可能にします。しかし、正確な整列は、より組織学的に一致する近いセクションがより正確に整列されるセクションの関連度に依存する。我々は、APPsを生成するためにVISの作者モジュールを使用しました。画像解析の基本的な知識は、APPs を作成するために必要ですが、他の画像解析ソフトウェアを使用する場合も同様です。VISの他の画像解析ソフトウェアと比較したユニークな利点は、異なる方法(例えば、IF、ヒストケミストリー、IHC)を使用して調製されたセクションからの画像の自動整列を含む。これにより、仮想多重化を使用して、関心のある複数のマーカーの共同ローカリゼーション研究が可能になります。さらに、柔軟で使いやすい APP の設計により、ユーザー固有のカスタマイズが可能です。自動化された定量化とマッピング、および組織切片全体を処理する可能性は、時間を節約し、目視検査による手動カウントと比較してバイアスを削減します。
この戦略は、がんと自己免疫の文脈で組織免疫学のための非常に有用な研究ツールですが、臨床使用のために検証されていないまま.追加の標準化と検証により、将来的に複数の用途に使用することができます(例えば、がんの免疫の風景をマッピングして免疫療法薬への応答を予測および監視します)。また、異なる炎症性条件(例えば、炎症性腸疾患)に適応して、予後バイオマーカーと病理学的評価を組み合わせることができる。
このプロトコルの主な重要なステップは、ラベルの効率/特異性と、意図された使用またはバイオマーカー用に設計されたApPの堅牢性です。したがって、目視検査による定期的な検証は、特に新しいアプリを設計する際に不可欠です。ストリッピングとリプロービングの複数のラウンドの効率的な使用、または同じセクション上の異なるタイプの汚れは重要なコンポーネントであり、組織またはセクション固有である可能性があります。大規模なバッチ分析を進める前に、このようなプロセスの効率を確認することが重要です。
要約すると、貴重な臨床組織サンプルから得られる定量的・空間的情報を最大限に活用する戦略を提供します。この方法論を実装するために必要なリソース、設備、知識は広くアクセス可能です。この方法論を、TMEにおける免疫細胞集団の同定、定量、マッピングを目的としたアッセイを計画するための有用なガイドとして提案する。

がんの発症は、悪性細胞とTMEとの間の相互相互作用を含む多段階のプロセスの結果である。腫瘍細胞以外に、TMEは、非悪性細胞、間質細胞、免疫細胞集団、および細胞外マトリックス(ECM)1から構成される。1腫瘍組織の異なる細胞および構造成分の空間的構成と癌と隣接する非癌細胞との動的交換は、最終的に腫瘍の進行と応答を調節する2,3,,4.癌における免疫応答は、時空間的に調節される55,66が示されている。腫瘍性病変および隣接組織に浸透する異なる免疫細胞集団は、独特の空間分布パターンおよび異なる機能に関連する多様な活性化および分化状態(例えば、プロ対抗腫瘍)を示す。これらの異なる免疫集団およびそれらのパラメータは、腫瘍および間質コンパートメントと残業を共存させる。
単一細胞マルチオミクスプロファイリングを可能にする技術の出現は、発がんおよび腫瘍進行を調節する多数の細胞および分子ネットワークに対する我々の理解を指数関数的に増加させてきた。しかし、ほとんどの単一細胞ベースのハイスループット分析ツールは、組織の破壊と単一細胞の単一の分離を必要とし、細胞の空間組織と細胞と細胞の相互作用に関する情報を失う結果 7.TME内の特定の免疫細胞の位置と配置は診断および予後の価値を有するため、空間分解能を可能にする技術は、単一細胞ベースの免疫プロファイリング技術の不可欠な補完である。
従来、免疫体化学(IHC)や多重免疫蛍光(mIF)などのイメージング技術は、同時に可視化できる少数のバイオマーカーに制限されてきました。この制限は、腫瘍浸潤免疫細胞の時空間的ダイナミクスの研究を妨げているが、これは典型的には複数の表向きのマーカーによって定義される。近年、イメージングや解析ツールの進歩により、多重化の可能性が広がっています。ヒストサイトメトリーやイメージング質量サイトメトリーなどの新しい抗体ベースの標識技術は、それぞれ88,99個のバイオマーカーをそれぞれ12個と32個まで空間的に分離するために用いられている。質量分析法イメージングは、標識を必要としない技術であり、1つの組織セクション10、11,11において数千のバイオマーカーを同時に画像化する可能性を有する。これらの技術は、すでに癌の組織免疫景観を解剖するための大きな可能性を示しているが、彼らは非常に洗練された高価な機器やソフトウェアを使用し、研究者の大半に容易にアクセスすることはできません。
あるいは、従来のIHCおよびmIFの多重化能力は、シリアルイメージング、シーケンシャルなラベ,リング、およびスペクトルイメージング7、12、13、14、15、1612,13を使用して拡張された。14,15,167これらの技術は、同じまたはシリアル組織セクションから複数の画像を生成し、画像解析ソフトウェアを使用して仮想マルチパラメータースライドに統合することができます。その結果、同時に視覚化および解析できるマーカーの数が増加します。
ここでは、市販の試薬、手頃な顕微鏡装置、およびユーザーフレンドリーなソフトウェアを用いた組織多重アッセイの合理的設計戦略を提案する(図1)。この方法論は、シリアルイメージング、シーケンシャルマルチプレックスラベリング、組織全体のイメージング、組織アライメントを統合して、組織切片内の免疫細胞の自動定量とマッピングに使用できる仮想マルチパラメータスライドを生成します。この戦略を用いて、11個のバイオマーカーと2つの頻繁に使用される組織学的ステイン(ヘマトキシリンとエオシン(H&E)とピクロシリウスレッド(PSR)からなる1つの仮想スライドを作成しました。複数の免疫細胞集団を同定し、異なる組織区画内で同定し、同定し、定量化し、組織ヒートマップを用いてそれらの空間分布を解決した。この戦略は、限られた臨床検体から得ることができる情報を最大化し、組織全体、コアニードルバイオプシー、および組織マイクロアレイを含むホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)アーカイブ組織サンプルに適用可能です。この方法論を、TMEにおける免疫細胞集団の同定、定量、マッピングのためのカスタムアッセイを設計するための有用なガイドとして提案する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1419px;" width="1418">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:649px;">Antigen Retrieval Solution: Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% v/v Tween 20, pH 6.0)</td>
			<td style="width:257px;"></td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blocking Solution: 1 % BSA, 10 % filtered human serum, 10 % filtered donkey serum, 0.1 % Tween 20, and 0.3% Triton in PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>800-095-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coplin jars (EASYDIP SLIDE STAINING SYSTEM)</td>
			<td>Newcomersupply</td>
			<td>5300KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545E 22*50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Direct Red 80</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td align="right">365548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol 100%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electric pressure cooker</td>
			<td>Salton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eosin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td align="right">3801600</td>
			<td>CAUTION, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td>CAUTION, harmful by inhalation, ingestion and skin absortion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FFPE section (4&#956;m) slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycine 0,1 M in PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hematoxylin Stain Solution, Gil 1. Formulation, Regular Strength</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3535-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Holder (EasyDip Staining Jar Holder)</td>
			<td>Newcomersupply</td>
			<td>5300RK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td align="right">22210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Humidity chamber</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z670138-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pap pen</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS-Tween 20 (0.1% v/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Permount Mounting Media</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Picric Acid 1.3 %</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6744</td>
			<td>CAUTION, skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Picro-Sirius Red/Fast Green solution: Fast Green 0.1 % w/v + Sirius Red 0.2 % w/v in 1,3 % picric acid solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-&#945;SMA</td>
			<td>Mouse IgG2a 1A4</td>
			<td>Sigma A2547</td>
			<td>Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD34</td>
			<td>Mouse IgG1 HPCA1/763</td>
			<td>Novus Biologicals NBP2-44568</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-Cytokeratin 8/18</td>
			<td>Rabbit EP17/EP30</td>
			<td>Agilent IR09461-2</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD68</td>
			<td>Mouse KP1</td>
			<td>Abcam ab955</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-Desmin</td>
			<td>Rabbit Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen PA5-16705</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD4</td>
			<td>Mouse N1UG0</td>
			<td>Affymetrix 14-2444</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-FoxP3</td>
			<td>Rabbit 1054C</td>
			<td>R &#38; D MAB8214</td>
			<td>Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-MPO</td>
			<td>Goat Polyclonal</td>
			<td>R &#38; D Systems AF3667</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD3</td>
			<td>Rabbit SP7</td>
			<td>Abcam ab16669</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD8</td>
			<td>Mouse C8/144B</td>
			<td>Invitrogen 14-0085-80</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-mouse A488</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-21202</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-Rabbit A488</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-21206</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-goat A568</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-11057</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-rabbit A647</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-31573</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Rat anti-mouse IgG1 A647</td>
			<td>RMG1-1</td>
			<td>Biolegend 406618</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Goat anti-mouse IgG2a CF568</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Sigma Aldrich SAB4600315</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-mouse DyLight 755</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen SA5-10171</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-rabbit DyLight 755</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen SA5-10043</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SDS</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SDS001,500</td>
			<td>CAUTION, oral skin and eye toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shandon multi-program robotic slide stainer</td>
			<td>LabX</td>
			<td align="right">11384903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shandon Xylene Substitute,</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CA89413-336</td>
			<td>CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shaking water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SlowFade Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td align="right">1545801</td>
			<td>CAUTION, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stripping Buffer: mix 20 ml 10% w/v SDS with 12.5 ml 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), and 67.5 ml ultra-pure water. Under a fume hood, add 800 uL of 2-mercapto ethanol (114,4 mM final concentration)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-HCl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VIS Software</td>
			<td>Visiopharm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Whole slide scanner Olympus BX61VS</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Microscope: Olympus Slide Scanner BX61VS, 5 slides scanner, motorized stage, autofocus. Camera: Lightsource: Xcite-120. Filters: BrightLine&#174; Sedat filter set (# LED-DA/FI/TR/Cy5-4X4M-B-000, Semrock)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736-4L</td>
			<td>CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylene : Ethanol solution (1:1 v/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>CAUTION, harmful by ingestion, inhalation, fatal if sking absortion. Eye irritation. Use fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization, quantification, and mapping of immune cell populations in the tumor microenvironment

腫瘍微小環境(TME)の免疫景観は、がんの進行および治療に対する応答の決定因子である。具体的には、TMEにおける免疫細胞の密度と位置は、重要な診断および予後値を有する。TMEの多元的プロファイリングは、腫瘍の開始と進行を調節する多数の細胞および分子ネットワークに対する我々の理解を指数関数的に増加させてきた。ただし、これらの手法では、セルの空間的な構成やセルとの相互作用に関する情報は提供されません。単一細胞ベースのハイスループット技術を補完するために、組織切片内の免疫細胞の空間分解能を可能にする、手頃な価格でアクセスしやすく、簡単に多重化技術が必要です。ここでは、シリアルイメージング、シーケンシャルラベリング、画像アライメントを統合して、組織セクション全体の仮想マルチパラメータスライドを生成する戦略を説明します。仮想スライドは、ユーザー定義のプロトコルを使用して、対象となる細胞集団の識別、定量、マッピングを可能にする、自動化された方法で分析されます。画像解析は、この場合、組織整列、作成者、および HISTOmap 解析モジュールを使用して行われます。この戦略を1つの臨床標本にうまく適用し、限られた組織サンプルから得られる情報を最大化し、組織セクション全体でTMEの公平な見解を提供する例を紹介します。

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Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment

ここでは、ホルマリン固定パラフィン埋め込み腫瘍組織切片における免疫細胞の可視化、定量、およびマッピングのための簡単でアクセス可能な戦略について述べている。この方法論は、既存のイメージングおよびデジタル解析技術と、イメージングアッセイの多重化能力と多パラメータ分析を拡大することを目的と組み合わせたものです。

腫瘍微小環境における免疫細胞集団の可視化、定量化、およびマッピング

The immune landscape of the tumor microenvironment (TME) is a determining factor in cancer progression and response to therapy. Specifically, the density ...

腫瘍微小環境における免疫細胞の空間的組織は臨床的価値を有する。この戦略は、腫瘍組織内の免疫細胞の可視化、定量化、マッピングに容易に使用できます。免疫療法はがん治療に革命をもたらしています。しかし、すべての患者がうまく反応するわけではありません。この戦略は、良好な抗腫瘍応答を予測できる組織免疫シグネチャを定義するのに役立つ可能性があります。実験を行う前に、抗体の組み合わせとストリップ技術を対照組織でテストし、ApPが目的のマーカーの検出に正確であることを確認します。画像解析法の記述は、洗練された技術言語を使用して、テキストとビデオを組み合わせることで、方法論のより良い理解と複製を容易にします。ホルマリン固定のパラフィン埋め込み腫瘍組織切片の抗原検索のために、脱ワックス組織サンプルを抗原検索溶液のコプリン瓶に浸し、蛇口水を含む電気圧力鍋に瓶を入れる。水位は、水が抗原の検索溶液と混合しないように、瓶の高さの半分を超えてはならない。調理器の蓋と圧力弁を閉じ、スライドを高圧で10分間処理します。処理の最後に、調理器具を抜き、圧力を解放し、蓋を開けます。スライドが調理器で30分間冷却された後、新しいコプリン瓶で洗浄ごとに新鮮なPBSでサンプルを5分間2回洗浄し、疎水性ペンを使用して各組織セクションの周りに障壁を描きます。次に、スライドをPBSで15分間PBSに浸し、スライドをPBSで2回リンスする。2回目の洗浄後、スライドを湿度チャンバに移し、各組織セクションをブロッキング溶液で覆います。室温で30分後、洗浄ごとに新鮮なPBS-Tweenでセクションを5分間2回洗い流し、対象となる一次抗体をブロッキング溶液に希釈して、各スライドに加え、光から保護します。インキュベーションの終わりに、新鮮なPBS-Tweenで1回5分間スライドを洗い流し、そのセクションに室温で1時間適切な二次抗体をラベル付けします。インキュベーションの終わりに、新鮮なPBS-Tweenでスライドを1回5分間洗い流します。二重蒸留水で単一のすすいで従ってください。各スライドから余分な水を取り除き、DAPIとカバースライドで補充された取り付け媒体で組織を取り付けます。余分な取り付け媒体を絞り出した後、スライドを室温で20分間乾燥させ、光から保護してから、スライド全体のスキャナを使用してすべてのチャンネルの画像を取得します。スキャン後、画像解析ソフトウェアで画像を開き、[組織配置]タブをクリックします。位置合わせするイメージをスライド トレイに読み込むには、データベースから最初に整列するイメージを選択します。すべてのイメージが読み込まれたら、ワークフローステップで「次へ」をクリックして画像をリンクし、位置合わせするすべての画像を最初の画像にドラッグアンドドロップします。すべての画像が適切にリンクされている場合は、リンクされた画像内の相同組織の特徴を示す画像ごとに最低3つのピンを使用します。ピンを使用して最初の画像をトレースし、結果として得られる線形の品質を確認します。適切な位置合わせが得られたら、[次へ] をクリックして画像レイヤーを表示し、複合画像をデータベースに保存します。ユーザー定義プロトコル APP 1 を使用して組織検出を実行するには、[画像解析] タブを開き、画像解析モジュールで合成画像を開きます。[APP を開く] アイコンをクリックし、適切な APP を選択します。APP が動作していることを確認するには、選択した組織の場所に移動し、[プレビュー] をクリックします。結果が満足のいく場合は、選択した APP を使用して画像を処理する] をクリックします。処理中、APPは、すべての組織関連ピクセルを対象領域に変換できるように、ピクセルが組織に関連しているかどうかを判断します。新しく作成された対象領域は、整列した任意の画像に転送できます。解析の最後で、[ファイルと保存]をクリックして、変更した画像を新しく作成した対象領域と共に保存します。組織を間質およびパンキマに分節する場合は、[画像解析]タブを開き、データベースから目的のファイルを選択します。開いているAPP 2、APP 2はティッシュのセグメンテーションのためのPSR染色されたイメージを使用する。選択した視野で画像を処理して、APP 2をプレビューします。結果が満足のいくものであれば、[実行] をクリックして、完全なイメージで APP 2 を処理します。組織の関心領域は、間質およびパレンチマにセグメント化され、それぞれの領域が決定される。新しく作成されたストロマとパレンチマの関心領域を整列した画像に転送し、変更された画像をエクスポートして保存します。対象の細胞集団を特定して定量化するには、対象のセグメント化された画像を画像分析モジュールにインポートします。色を調整したら、APP 3を開きます。APP 3は、関心のある細胞集団を検出し、パレンチマと間質内でそれらを定量化します。結果が満足のいくものであれば、完全なイメージで APP 3 を実行します。関心のある個々の細胞はすべて、それらの組織座標が保存され、そして、間質および小さな領域における対象細胞の密度が決定される。変更した画像は、実例どおりに保存できます。関心のある細胞ラベルオブジェクトの組織ヒートマッピングを実行するには、APP 選択ウィンドウで適切なユーザー定義プロトコルを開き、[実行]をクリックして、抗体標識オブジェクトの座標を使用してヒート マップを生成するよう APP に求めます。赤でハイライト表示されたホット スポット領域には、対象となるセルの人口密度が最も高く、濃い青色の領域が最も低い領域が含まれています。特定の細胞集団のヒートマップを整列画像に重ね合わせ、腫瘍微小環境内で細胞がどのように組織されているかに関する追加情報を提供することができる。その後、組織ヒートマップをエクスポートして保存します。ラベリングの特異性、設計された APPs の精度、および同じセクション上の異なる汚れの除去と再確認の効率を確認することが重要です。連続イメージング、シーケンシャルラベリング、組織アライメントを統合することで、より多くのマーカーを同時に可視化することができ、限られた臨床検体からより多くの情報を抽出することができます。切除された腫瘍組織切片のH&E染色により、組織アーキテクチャ、細胞形態、悪性腫瘍の種類、腫瘍グレード、および全体的な免疫浸潤などの臨床的に関連するパラメータの評価が可能になります。CD34染色は、内皮細胞の検出を可能にする。サイトケラチン8/18染色は上皮細胞の存在を明らかにし、抗α平滑筋アクチン染色は線維原性、活性化された、肝星状細胞の同定を可能にする。CD68およびデスミンに対する抗体による再確認は、それぞれマクロファージおよび筋線維芽細胞の検出を可能にする。腫瘍免疫浸潤をより良く特徴付けるために、T細胞マーカーおよびミエロペルオキシダーゼの染色を行うことができる。ピクロシリウスレッド染色は、線維素体コラーゲンを可視化し、間質およびパレンチマのセグメンテーションを容易にするためにも行うことができる。染色されたセクション内の組織関連ピクセルは、関心のある特定の領域内の異なる区画のセグメンテーションを可能にするために同定することができる。その後、対象となる細胞集団を各領域内で同定し、特定の細胞集団の高密度領域をホットスポットとして表示し、比較的密度の低い領域をコールドスポットとして表示する組織マップを生成することができます。組織サンプル内の免疫細胞を同定、定量、マッピングするためのこの方法論は、特定の研究課題および関心マーカーに適合し、検証することができる。この戦略は、高スループット分析のために組織マイクロアレイに適用できます。また、その場合のハイブリダイゼーションと組み合わせて、その場合のタンパク質と遺伝子発現を同時に調べることもできます。この戦略を用いて、患者の線維化肝組織のIL-17A産生細胞をその際に同定し、マッピングしました。プロトコルに示されているように、いくつかの試薬は化学的に危険であり、関連する手順は適切な個人的な保護具および予防措置を使用して化学フードで行われるべきである。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

細胞星状に7つのステップ

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

2光子顕微鏡を用いてマウスの胸腺の生体内イメージング

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

ゼブラフィッシュにおける自然免疫の健康の指標として呼吸バースト応答の定量化

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

での感染の間に流入領域リンパ節へのマウスの皮膚樹状細胞の移動を研究するためにCFSEベースアッセイ<em&gt;マイコバクテリウム・ボビス</em&gt;カルメット - ゲラン

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

蛍光相関分光法により測定初代リンパ球のプラズマ膜における分子拡散

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

体内上部気道免疫メディエーター レベルの定量化のための粘膜内層流体の非侵襲的サンプリング

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

葉酸受容体ベータ マクロファージと巨細胞性動脈炎で微小血管免疫環境をプロファイリングする Immunohistopathologic 研究

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系におけるリンパ球浸潤のフロー細胞量分析

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...