Name: visualization, quantification, and mapping of immune cell populations in the tumor microenvironment
Uploaded: 2020-03-25T14:00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment at JoVE.com

Vi takker studiedeltakeren. Vi takker Louise Rousseau, koordinator for HBP biobank for utvinning av vevsprøvene og all tilhørende klinisk informasjon. Vi anerkjenner molekylær patologi og cellebildekjerneanlegg ved CRCHUM og Michael Persch fra Visiopharm for utmerket teknisk assistanse. Finansiering: Denne studien ble støttet av tilskudd fra Canadian Liver Foundation, Fonds de recherche du Québec–Santé (FRQS) AIDS og Infectious Disease Network (Réseau SIDA-MI), og Canadian Network on Hepatitt C (CanHepC). CanHepC er finansiert av et felles initiativ fra Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (NHC-142832) og Public Health Agency of Canada. M.F.M. fikk stipend fra Université de Montréal, Bourse Gabriel Marquis og FRQS. T.F. fikk doktorgradsstipend fra CIHR og CanHepC. S.T. har Roger-Des-Groseillers Chair i hepatobiliær og bukspyttkjertel onkologisk kirurgi, Université de Montréal.
Forfatterbidrag: M.F.M. designet, utførte eksperimenter og analyserte data. T.F. designet eksperimenter. A.C-B. teknisk veiledning. G.S. utførte all den patologiske vurderingen av studieemnet og ga innspill på alle de patologiske aspektene. L.M. utførte H&E-farging, optimalisert og utført bildeoppkjøp. M.N.A. utførte PSR-flekken og ga verdifull teknisk inngang. N.B. bidro til bildeanalysen. S.T. er hovedetterforsker for HBP biobank og er ansvarlig for å overvåke den generelle driften av biobanken. Han ga også uvurderlige innspill på alle aspekter av prosjektet og dets kliniske implikasjoner. M.F.M, T.F., og N.H.S. konseptualisert og designet studien. N.H.S. overvåket arbeidet og fikk finansiering. M.F.M., T.F., A.C-B og N.H.S. skrev manuskriptet. Alle forfattere anmeldte og godkjente manuskriptet.

<ol>
	<li>Greten, F. R., Grivennikov, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+Cancer:Triggers,+Mechanisms,+and+Consequences.">Inflammation and Cancer:Triggers, Mechanisms, and Consequences.</a> Immunity. 51 (1), 27-41 (2019).</li><li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+validation+of+the+consensus+Immunoscore+for+the+classification+of+colon+cancer:+a+prognostic+and+accuracy+study.">International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study.</a> Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).</li><li>Binnewies, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+tumor+immune+microenvironment+(TIME)+for+effective+therapy.">Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy.</a> Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).</li><li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+the+tumor+immune+microenvironment+for+staging+and+therapeutics.">Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics.</a> Modern Pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 31 (2), 214-234 (2018).</li><li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+dynamics+of+intratumoral+immune+cells+reveal+the+immune+landscape+in+human+cancer.">Spatiotemporal dynamics of intratumoral immune cells reveal the immune landscape in human cancer.</a> Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).</li><li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+introduction+of+the+'Immunoscore'+in+the+classification+of+malignant+tumours.">Towards the introduction of the 'Immunoscore' in the classification of malignant tumours.</a> The Journal of Pathology. 232 (2), 199-209 (2014).</li><li>Finotello, F., Eduati, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Omics+Profiling+of+the+Tumor+Microenvironment:+Paving+the+Way+to+Precision+Immuno-Oncology.">Multi-Omics Profiling of the Tumor Microenvironment: Paving the Way to Precision Immuno-Oncology.</a> Frontiers in Oncology. 8, 430 (2018).</li><li>Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histo-cytometry:+a+method+for+highly+multiplex+quantitative+tissue+imaging+analysis+applied+to+dendritic+cell+subset+microanatomy+in+lymph+nodes.">Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes.</a> Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).</li><li>Giesen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+imaging+of+tumor+tissues+with+subcellular+resolution+by+mass+cytometry.">Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry.</a> Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).</li><li>Porta Siegel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry+Imaging+and+Integration+with+Other+Imaging+Modalities+for+Greater+Molecular+Understanding+of+Biological+Tissues.">Mass Spectrometry Imaging and Integration with Other Imaging Modalities for Greater Molecular Understanding of Biological Tissues.</a> Molecular Imaging and Biology : MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 20 (6), 888-901 (2018).</li><li>Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry+Imaging:+A+Review+of+Emerging+Advancements+and+Future+Insights.">Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights.</a> Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).</li><li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype.">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).</li><li>Gendusa, R., Scalia, C. R., Buscone, S., Cattoretti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elution+of+High-affinity+(&gt;10-9+KD)+Antibodies+from+Tissue+Sections:+Clues+to+the+Molecular+Mechanism+and+Use+in+Sequential+Immunostaining.">Elution of High-affinity (&gt;10-9 KD) Antibodies from Tissue Sections: Clues to the Molecular Mechanism and Use in Sequential Immunostaining.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (7), 519-531 (2014).</li><li>van der Loos, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunoenzyme+staining:+methods+and+visualizations+for+the+observation+with+spectral+imaging.">Multiple immunoenzyme staining: methods and visualizations for the observation with spectral imaging.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 313-328 (2008).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labeling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labeling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).</li><li>Segnani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+Detection+of+Collagen+Fibers+by+Sirius+Red/Fast+Green+Is+More+Sensitive+than+van+Gieson+or+Sirius+Red+Alone+in+Normal+and+Inflamed+Rat+Colon.">Histochemical Detection of Collagen Fibers by Sirius Red/Fast Green Is More Sensitive than van Gieson or Sirius Red Alone in Normal and Inflamed Rat Colon.</a> PloS One. 10 (12), 0144630 (2015).</li><li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Staining+by+Sequential+Immunostaining+and+Antibody+Removal+on+Routine+Tissue+Sections.">Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Enkle, tilgjengelige og enkle å utføre multipleksingteknikker som tillater romlig oppløsning av immunceller i vevsseksjoner er nødvendig for å kartlegge immunlandskapet i kreft og andre immunologiske lidelser. Her beskriver vi en strategi som integrerer allment tilgjengelige merkings- og digitale analyseteknikker for å utvide multipleksjonsevnen og flerdimensjonal vurdering av bildebehandlingsanalyser12,13,17,19. Farging av tre seriedeler for forskjellige markører, og gjenbruk av seksjoner gjennom stripping og reprobing teknikker, gjorde oss i stand til å visualisere 11 parametere i tillegg til H & E og PSR flekker. Seks bilder fra disse seksjonene ble justert på en automatisert måte ved hjelp av vevjusteringsmodulen. Justeringen var nøyaktig på det enkelte cellenivå for bilder som stammer fra samme del og svært konkordans for bilder som stammer fra nærliggende seksjoner. Virtuell multipleksing gjorde det mulig for oss å bestemme hvordan markører visualisert i en del er romlig knyttet til markører visualisert i en annen sammenhengende del. Mens noen av flekker merket COIer, andre merket TCer, slik at vi kan kvantifisere COI er i de forskjellige TCene. Bruken av programvareverktøy for automatisert kvantifisering av COIer forenklet og akselerert behandling av bilder. Videre ble digital analyse brukt på hele vevsseksjoner i stedet for utvalgte synsfelt, noe som resulterte i en objektiv representasjon av TME. Videre, fordi vevkoordinatene til COI-er ble registrert, var det mulig å generere vevsvarmekart.
Det finnes flere områder i denne protokollen der feilsøking kan være nødvendig. For det første kan dårlig antigenhenting påvirke kvaliteten på mIF, derfor bør typen antigengjenfinningsbuffer og varighet optimaliseres for de spesifikke analyse-/biomarkørforholdene som brukes. For det andre bør typen blokkeringsløsning som brukes tilpasses vev/antigen/arter av primære og sekundære antistoffer. I våre hender, tillegg av 10% totalt serum fra arten der vevet kommer fra blokkerte Fc reseptorer, og dermed redusert uspesifikk antistoff binding. Tilsetning av 10% av serum fra arten de sekundære antistoffene ble reist i ville minimere direkte uspesifikk vedlegg av sekundære antistoffer mot vevsseksjonen. For det tredje er validering av spesifisiteten til de primære og sekundære antistoffene ved hjelp av de riktige positive og negative kontrollene avgjørende. Fjerde, økt autofluorescens i noen kanaler og diffusjon av DAPI ved primær antistoff stripping er også vanlig. For å løse den forbedrede autofluorescensen brukte vi primære/sekundære antistoffpar der det spesifikke signalet hadde intensitetsverdier minst 5x som i bakgrunnen. Til slutt kan noen høy affinitetsantistoffer ikke eluted med vanlige strippingprosedyrer. I dette tilfellet anbefaler vi å bruke slike antistoffer i den siste runden med merking. Brukeren må kanskje prøve forskjellige fargesekvenser for å finne den optimale konfigurasjonen for antistoffene av interesse. Effektiviteten av stripping bør bekreftes før du går videre til en andre eller tredje runde med merking.
Hovedbegrensningen og utfordringen med denne strategien er å finne de riktige kombinasjonene av primære og sekundære fluorescerende antistoffer for markører av interesse. Å finne primære antistoffer oppvokst i forskjellige arter eller med forskjellige isotyper som kan brukes samtidig, er begrenset av det som er kommersielt tilgjengelig. De fleste hele lysbildeskannere er utstyrt med lamper og filtre som tillater bildebehandling maksimalt fem kanaler, og sekundære antistoffer i de riktige artene og høyre fluoroforfor er ikke alltid tilgjengelig. Vi overvant delvis disse begrensningene ved hjelp av serielle flekker og sekvensiell merking. Flere antistoffkombinasjoner må kanskje testes for å komme frem til den beste kombinasjonen for markører av interesse. En annen begrensning er kvaliteten på DAPI farging, fordi stripping og reprobing kan ikke alltid tillate utføre kjernesegmentering.
Vevsjusteringsmodulen krever minimal opplæring og ingen programmeringsferdigheter fra brukerne. Programvaren teoretisk tillater justering av et ubegrenset antall bilder. Imidlertid avhenger presis justering av sammenhengen mellom seksjoner, hvor nærmere seksjoner som er mer histologisk konkordans er mer nøyaktig justert. Vi brukte Forfatter-modulen til VIS for å generere APPer. Grunnleggende kunnskap om bildeanalyse er nødvendig for å lage APPer, men dette er like tilfelle når du bruker annen bildeanalyseprogramvare. De unike fordelene med VIS sammenlignet med annen bildeanalyseprogramvare inkluderer automatisert justering av bilder fra seksjoner utarbeidet ved hjelp av forskjellige metoder (f.eks. IF, histochemistry, IHC). Dette gjør det mulig for kolokaliseringsstudier av flere markører av interesse ved hjelp av virtuell multipleksing. Videre tillater den fleksible og brukervennlige utformingen av APPer brukerspesifikk tilpasning. Automatisert kvantifisering og kartlegging, og muligheten for behandling av hele vevseksjoner, sparer tid og reduserer skjevhet sammenlignet med manuell telling ved visuell inspeksjon.
Denne strategien er et svært nyttig forskningsverktøy for vevimmunologi i sammenheng med kreft og autoimmunitet, men forblir ikke validert for klinisk bruk. Med ytterligere standardisering og validering kan den brukes i fremtiden for flere applikasjoner (f.eks. for å kartlegge immunlandskapet i kreft for å forutsi og overvåke responsen på immunterapeutiske midler). Det kan også tilpasses forskjellige inflammatoriske tilstander (f.eks. inflammatorisk tarmsykdom) for å kombinere patologisk evaluering med prognostiske biomarkører.
De viktigste kritiske trinnene i denne protokollen er effektiviteten/spesifisiteten til merkingen og robustheten til de utformede APPer-ene for tiltenkt bruk eller biomarkør. Derfor er regelmessig validering ved visuell inspeksjon, spesielt ved utforming av en ny APP, avgjørende. Effektiv bruk av flere runder med stripping og frastøting eller ulike typer flekker på samme seksjon er kritiske komponenter og kan være vev eller seksjonsspesifikke. Det er avgjørende å verifisere effektiviteten til slike prosesser før du fortsetter med stor batchanalyse.
Oppsummert tilbyr vi en strategi som maksimerer den kvantitative og romlige informasjonen som kan fås fra verdifulle kliniske vevsprøver. Ressursene, utstyret og kunnskapen som kreves for å implementere denne metodikken er allment tilgjengelig. Vi foreslår denne metodikken som en nyttig veiledning for planlegging av analyser som tar sikte på å identifisere, kvantifisere og kartlegge immuncellepopulasjoner i TME.

Kreftutvikling er et resultat av en flertrinnsprosess som involverer gjensidige interaksjoner mellom ondartede celler og TME. Annet enn tumorceller består TME av ikke-ondartede celler, stromale celler, immuncellepopulasjoner og ekstracellulær matrise (ECM)1. Den romlige organiseringen av de forskjellige cellulære og strukturelle komponentene i tumorvevet og den dynamiske utvekslingen mellom kreft og nærliggende ikke-kreftceller modulerer til slutt tumorprogresjon og respons på terapi2,,3,4. Det har vist seg at immunresponsen hos kreft er spatiotempoally regulert5,6. Ulike immuncellepopulasjoner som infiltrerer neoplastisk lesjon og tilstøtende vev viser karakteristiske romlige distribusjonsmønstre og varierte aktiverings- og differensieringstilstander forbundet med forskjellige funksjoner (f.eks. pro- versus antitumor). Disse forskjellige immunpopulasjonene og deres parametere dreier seg om overtid med svulsten og stromale rom.
Fremveksten av teknologier som tillater encellede multiomics profilering har eksponentielt økt vår forståelse av de mange cellulære og molekylære nettverk som regulerer kreftfremkallende og tumorprogresjon. De fleste enkeltcellebaserte analytiske verktøy med høy gjennomstrømning krever imidlertid vevsforstyrrelser og encellede isolering, noe som resulterer i tap av informasjon om den romlige organiseringen av celler og cellecelleinteraksjoner7. Fordi plasseringen og plasseringen av spesifikke immunceller i TME har diagnostisk og prognostisk verdi, er teknologier som tillater romlig oppløsning et viktig komplement av enkeltcellebaserte immunprofileringsteknikker.
Tradisjonelt har bildeteknikker som immunohistochemistry (IHC) og multipleks immunofluorescens (mIF) vært begrenset til et lite antall biomarkører som kan visualiseres samtidig. Denne begrensningen har hindret studien av spatiotemporal dynamikken i tumor-infiltrerende immunceller, som vanligvis er definert av flere fenotypisk markører. Nylige fremskritt innen bildebehandling og analytiske verktøy har utvidet mulighetene for multipleksing. Nye antistoffbaserte merkingsteknologier som histo-cytometri og bildemassecytometri har blitt brukt til å skille opptil 12 og 32 biomarkører, henholdsvis8,9. Massespektrometri bildebehandling, en teknikk som ikke krever merking, har potensial til å bilde tusenvis av biomarkører samtidig i en enkelt vev seksjon10,11. Selv om disse teknikkene allerede har vist stort potensial for å dissekere vevimmunlandskapet i kreft, bruker de svært sofistikert og dyrt utstyr og programvare og er ikke lett tilgjengeligfor de fleste forskere.
Alternativt har multipleksjonsevnen til tradisjonell IHC og mIF blitt utvidet gjennom bruk av seriell bildebehandling, sekvensielle runder med merking og spektral bildebehandling7,,12,,13,,14,15,16. Disse teknikkene genererer flere bilder fra samme eller fra serievevseksjoner som kan konsolideres til virtuelle multiparameterlysbilder ved hjelp av bildeanalyseprogramvare. Som et resultat øker antall markører som kan visualiseres og analyseres samtidig.
Her foreslår vi en strategi for rasjonell utforming av vev multipleks analyser ved hjelp av kommersielt tilgjengelige reagenser, rimelig mikroskopi utstyr, og brukervennlig programvare (Figur 1). Denne metoden integrerer seriebilde, sekvensiell multipleksmerking, hele vevsavbildning og vevsjustering for å generere virtuelle multiparameterlysbilder som kan brukes til automatisert kvantifisering og kartlegging av immunceller i vevsseksjoner. Ved hjelp av denne strategien opprettet vi en virtuell lysbilde bestående av 11 biomarkører pluss to ofte brukte histologiske flekker: hematoksylin og eosin (H&E) og picrosirius rød (PSR). Flere immuncellepopulasjoner ble identifisert, lokalisert og kvantifisert i forskjellige vevsrom og deres romlige fordeling løst ved hjelp av vevsvarmekart. Denne strategien maksimerer informasjonen som kan oppnås fra begrensede kliniske prøver og gjelder for formalin-fast parafin-innebygd (FFPE) arkivertvevsprøver, inkludert hele vev, kjerne nål biopsier, og vev mikroarrays. Vi foreslår denne metodikken som en nyttig veiledning for utforming av tilpassede analyser for identifisering, kvantifisering og kartlegging av immuncellepopulasjoner i TME.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1419px;" width="1418">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:649px;">Antigen Retrieval Solution: Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% v/v Tween 20, pH 6.0)</td>
			<td style="width:257px;"></td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blocking Solution: 1 % BSA, 10 % filtered human serum, 10 % filtered donkey serum, 0.1 % Tween 20, and 0.3% Triton in PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>800-095-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coplin jars (EASYDIP SLIDE STAINING SYSTEM)</td>
			<td>Newcomersupply</td>
			<td>5300KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545E 22*50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Direct Red 80</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td align="right">365548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol 100%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electric pressure cooker</td>
			<td>Salton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eosin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td align="right">3801600</td>
			<td>CAUTION, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td>CAUTION, harmful by inhalation, ingestion and skin absortion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FFPE section (4&#956;m) slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycine 0,1 M in PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hematoxylin Stain Solution, Gil 1. Formulation, Regular Strength</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3535-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Holder (EasyDip Staining Jar Holder)</td>
			<td>Newcomersupply</td>
			<td>5300RK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td align="right">22210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Humidity chamber</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z670138-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pap pen</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS-Tween 20 (0.1% v/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Permount Mounting Media</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Picric Acid 1.3 %</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6744</td>
			<td>CAUTION, skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Picro-Sirius Red/Fast Green solution: Fast Green 0.1 % w/v + Sirius Red 0.2 % w/v in 1,3 % picric acid solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-&#945;SMA</td>
			<td>Mouse IgG2a 1A4</td>
			<td>Sigma A2547</td>
			<td>Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD34</td>
			<td>Mouse IgG1 HPCA1/763</td>
			<td>Novus Biologicals NBP2-44568</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-Cytokeratin 8/18</td>
			<td>Rabbit EP17/EP30</td>
			<td>Agilent IR09461-2</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD68</td>
			<td>Mouse KP1</td>
			<td>Abcam ab955</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-Desmin</td>
			<td>Rabbit Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen PA5-16705</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD4</td>
			<td>Mouse N1UG0</td>
			<td>Affymetrix 14-2444</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-FoxP3</td>
			<td>Rabbit 1054C</td>
			<td>R &#38; D MAB8214</td>
			<td>Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-MPO</td>
			<td>Goat Polyclonal</td>
			<td>R &#38; D Systems AF3667</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD3</td>
			<td>Rabbit SP7</td>
			<td>Abcam ab16669</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD8</td>
			<td>Mouse C8/144B</td>
			<td>Invitrogen 14-0085-80</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-mouse A488</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-21202</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-Rabbit A488</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-21206</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-goat A568</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-11057</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-rabbit A647</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-31573</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Rat anti-mouse IgG1 A647</td>
			<td>RMG1-1</td>
			<td>Biolegend 406618</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Goat anti-mouse IgG2a CF568</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Sigma Aldrich SAB4600315</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-mouse DyLight 755</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen SA5-10171</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-rabbit DyLight 755</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen SA5-10043</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SDS</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SDS001,500</td>
			<td>CAUTION, oral skin and eye toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shandon multi-program robotic slide stainer</td>
			<td>LabX</td>
			<td align="right">11384903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shandon Xylene Substitute,</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CA89413-336</td>
			<td>CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shaking water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SlowFade Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td align="right">1545801</td>
			<td>CAUTION, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stripping Buffer: mix 20 ml 10% w/v SDS with 12.5 ml 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), and 67.5 ml ultra-pure water. Under a fume hood, add 800 uL of 2-mercapto ethanol (114,4 mM final concentration)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-HCl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VIS Software</td>
			<td>Visiopharm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Whole slide scanner Olympus BX61VS</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Microscope: Olympus Slide Scanner BX61VS, 5 slides scanner, motorized stage, autofocus. Camera: Lightsource: Xcite-120. Filters: BrightLine&#174; Sedat filter set (# LED-DA/FI/TR/Cy5-4X4M-B-000, Semrock)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736-4L</td>
			<td>CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylene : Ethanol solution (1:1 v/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>CAUTION, harmful by ingestion, inhalation, fatal if sking absortion. Eye irritation. Use fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization, quantification, and mapping of immune cell populations in the tumor microenvironment

Immunlandskapet i tumormikromiljøet (TME) er en avgjørende faktor i kreftprogresjon og respons på terapi. Spesielt har tettheten og plasseringen av immunceller i TME viktige diagnostiske og prognostiske verdier. Multiomic profilering av TME har eksponentielt økt vår forståelse av de mange cellulære og molekylære nettverk som regulerer tumorinitiering og progresjon. Disse teknikkene gir imidlertid ikke informasjon om den romlige organiseringen av celler eller cellecelleinteraksjoner. Rimelig, tilgjengelig og lett å utføre multipleksing teknikker som tillater romlig oppløsning av immunceller i vev seksjoner er nødvendig for å utfylle enkelt celle-baserte high-throughput teknologier. Her beskriver vi en strategi som integrerer seriebilde, sekvensiell merking og bildejustering for å generere virtuelle multiparameterlysbilder av hele vevsseksjoner. Virtuelle lysbilder analyseres deretter på en automatisert måte ved hjelp av brukerdefinerte protokoller som muliggjør identifisering, kvantifisering og kartlegging av cellepopulasjoner av interesse. Bildeanalysen er gjort, i dette tilfellet ved hjelp av analysemodulene Tissuealign, Author og HISTOmap. Vi presenterer et eksempel der vi brukte denne strategien med hell til en klinisk prøve, maksimere informasjonen som kan fås fra begrensede vevsprøver og gi et objektivt syn på TME i hele vevsdelen.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment at JoVE.com

Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment

Her beskriver vi en enkel og tilgjengelig strategi for visualisering, kvantifisering og kartlegging av immunceller i formalin-faste parafin-innebygde tumorvevseksjoner. Denne metoden kombinerer eksisterende bilde- og digitale analyseteknikker med det formål å utvide multipleksjonsevnen og multiparameteranalysen av bildebehandlingsanalyser.

Visualisering, kvantifisering og kartlegging av immuncellepopulasjoner i tumormikromiljøet

The immune landscape of the tumor microenvironment (TME) is a determining factor in cancer progression and response to therapy. Specifically, the density ...

Den romlige organiseringen av immuncellene i tumormikromiljøet har klinisk verdi. Denne strategien kan enkelt brukes til å visualisere, kvantifisere og kartlegge immunceller i tumorvev. Immunterapi har revolusjonert kreftbehandling.Men ikke alle pasienter reagerer godt. Denne strategien kan tjene til å definere vev-immun signaturer som kan forutsi en god anti-tumor respons. Før du utfører et eksperiment, test antistoffkombinasjoner og stripping teknikker på kontroll vev og kontrollere at APPs er nøyaktig i deres påvisning av markører av interesse.Som skriftlige beskrivelser av bildeanalyse metoder bruker sofistikert teknisk språk, kombinere tekst med video forenkler en bedre forståelse og replikering av metodikken. For antigenhenting av formalin-faste, parafin-innebygde tumorvevsseksjoner, senk den avvoksede vevsprøven i en Coplin-krukke med antigenhentingsløsning og legg krukken i en elektrisk trykkoker som inneholder vann fra springen. Vannstanden bør ikke overstige halvparten av høyden på krukken slik at vannet ikke blandes med antigenhentingsløsningen.Lukk lokket og trykkventilen på komfyren og behandle lysbildene med høyt trykk i 10 minutter. På slutten av behandlingen, koble fra komfyren, slipp trykket og åpne lokket. Etter at lysbildene er avkjølt i komfyren i 30 minutter, vask prøvene to ganger i fem minutter i fersk PBS per vask i en ny Coplin-krukke, og bruk deretter en hydrofob penn til å tegne en barriere rundt hver vevseksjon.Deretter senker du lysbildene i 0,1-molar glycin i PBS i 15 minutter ved romtemperatur før du skyller lysbildene to ganger i PBS som demonstrert. Etter den andre vasken, overfør lysbildene til et fuktighetskammer og dekk hver vevseksjon med blokkeringsløsning. Etter 30 minutter ved romtemperatur, skyll seksjonene to ganger i fem minutter i frisk PBS-Tween per vask og legg deretter til de primære antistoffene av interesse, fortynnet i blokkerende løsning, til hvert lysbilde, beskyttet mot lys.På slutten av inkubasjonen, skyll lysbildene tre ganger i frisk PBS-Tween i fem minutter per vask, og merk deretter seksjonene med de riktige sekundære antistoffene i en time ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen, skyll lysbildene tre ganger i frisk PBS-Tween i fem minutter per vask. Følg med en enkelt skyll i dobbeltdestillert vann.Fjern overflødig vann fra hver sklie og monter vevet med monteringsmediet supplert med DAPI og et dekselsklie. Etter å ha klemt ut det overskytende monteringsmediet, la lysbildene tørke i 20 minutter ved romtemperatur, beskyttet mot lys, før du anskaffer bilder for alle kanalene ved hjelp av en helskysskanner. Etter skanning åpner du bildene i bildeanalyseprogramvaren og klikker kategorien Tissuealign.Hvis du vil importere bildene som skal justeres inn i lysbildeskuffen, velger du det første bildet som skal justeres fra databasen. Når alle bildene er lastet inn, klikker du Neste i arbeidsflyttrinnene for å koble bildene og dra og slippe alle bildene som skal justeres på det første bildet. Når alle bildene er koblet sammen etter behov, bruker du minst tre pinner per bilde som indikerer homologe vevsfunksjoner i de koblede bildene.Bruk en stift til å spore det første bildet for å kontrollere kvaliteten på den resulterende justeringen. Hvis en tilfredsstillende justering er oppnådd, klikker du Neste for å vise bildelagene og lagre det sammensatte bildet i databasen. Hvis du vil utføre en vevsgjenkjenning ved hjelp av den brukerdefinerte protokollen APP 1, åpner du kategorien Bildeanalyse og åpner det sammensatte bildet i bildeanalysemodulen.Klikk på Åpne APP-ikonet, og velg den aktuelle APPEN. Hvis du vil bekrefte at APPEN fungerer, navigerer du til et valgt vevssted og klikker forhåndsvisning. Hvis resultatene er tilfredsstillende, klikker du for å behandle bildet ved hjelp av den valgte APPEN.Under behandlingen avgjør APPEN om pikselen er knyttet til vevet for å tillate konvertering av alle vevsrelaterte piksler til et interesseområde. Det nyopprettede interesseområdet kan deretter overføres til et hvilket som helst av de justerte bildene. Klikk Fil og lagre på slutten av analysen for å lagre det endrede bildet med det nylig opprettede interesseområdet.For segmentering av vevet i stroma og parenchyma, åpne kategorien Bildeanalyse og velg interessefiler fra databasen. Åpne APP 2, APP 2 bruker det PSR-farget bilde for vevsegmentering. Forhåndsvis APP 2 ved å behandle bildet i et valgt synsfelt.Hvis resultatene er tilfredsstillende, klikker du Kjør for å behandle APP 2 på hele bildet. Regionen av interesse for vevet vil bli segmentert i stroma og parenchyma og deres respektive områder bestemt. De nyopprettede områdene av interesse for stroma og parenchyma kan overføres til de justerte bildene, og deretter eksportere og lagre det modifiserte bildet som demonstrert.Hvis du vil identifisere og kvantifisere cellepopulasjoner av interesse, importerer du det segmenterte bildet av interesse til bildeanalysemodulen. Når du har justert fargen, åpner du APP 3. APP 3 vil oppdage cellepopulasjonene av interesse og kvantifisere dem i parenchyma og stroma.Hvis resultatene er tilfredsstillende, kjører du APP 3 på hele bildet. Alle de enkelte cellene av interesse vil bli merket, deres vevkoordinater lagret, og tetthetene til cellene av interesse i stroma og parenchymale regioner bestemmes. Det endrede bildet kan deretter lagres som demonstrert.Hvis du vil utføre vevsvarmekart av de interessecellemerkede objektene, åpner du den aktuelle brukerdefinerte protokollen i appvalgvinduet og klikker Kjør for å be APP om å bruke koordinatene til de antistoffmerkede objektene til å generere varmekartet. Hot spot områder, uthevet i rødt, inneholder den høyeste tettheten av cellepopulasjonen av interesse mens de mørkeblå områdene har lavest. Varmekartet over en bestemt cellepopulasjon kan legges over på de justerte bildene for å gi ytterligere informasjon om hvordan disse cellene er organisert i tumormikromiljøet.Deretter eksportere og lagre vev varme kartet. Det er avgjørende å verifisere spesifisiteten til merkingen, nøyaktigheten av de utformede APPene, og stripping og reprobing effektivitet av de forskjellige flekker på samme seksjon. Ved å integrere serielavbildning, sekvensiell merking og vevsjustering kan flere markører visualiseres samtidig, og mer informasjon kan ekstraheres fra begrensede kliniske prøver.H&E farging av resected tumor vev seksjoner tillater evaluering av vev arkitektur, celle morfologi, og klinisk relevante parametere som type malignitet, tumor karakter, og generell immun infiltrasjon. CD34-farging gjør det mulig å oppdage endotelceller. Cytokeratin 8/18 farging avslører tilstedeværelsen av epitelceller, og anti-alfa glatt muskel actin farging tillater identifisering av fibrogene, aktiverte, lever stellate celler.Reprobing med antistoffer mot CD68 og Desmin tillate påvisning av makrofager og myofibroblaster henholdsvis. For bedre å karakterisere tumor-immun infiltrat, kan farging for T-cellemarkører og myeloperoxidase utføres. Picro Sirius Rød farging kan også utføres for å visualisere fibrillar kollagen og for å lette stroma og parenchyma segmentering.Vevsrelaterte piksler innenfor de beisede delene kan identifiseres for å tillate segmentering av forskjellige rom innenfor et bestemt interesseområde. Cellepopulasjonene av interesse kan deretter identifiseres i hver region, slik at generering av vevskart som områder med høy tetthet for en gitt cellepopulasjon vises som hot spots og regioner med relativt lav tetthet vises som kalde flekker. Denne metodikken for å identifisere, kvantifisere og kartlegge immunceller i vevsprøver kan tilpasses og valideres for et bestemt forskningsspørsmål og markør av interesse.Denne strategien kan brukes på vev mikro arrays for høy gjennomstrømning analyse. Det kan også kombineres med in situ hybridisering for å samtidig undersøke in situ protein og genuttrykk. Vi har brukt denne strategien til å identifisere og kartlegge IL-17A-produserende celler in situ i fibrotisk levervev fra pasienter.Som angitt i protokollen, er flere reagenser kjemisk farlige, og de relevante prosedyrene skal utføres i en kjemisk hette ved hjelp av passende personlig verneutstyr og forholdsregler.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging av Mouse Thymus med 2-Photon Mikroskopi

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Kvantifisering av Respiratory Burst Response som en indikator på medfødte immun Health i sebrafisk

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nøytrofile Isolering og analyse for å fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhet for Terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

En CFSE basert analyse for å studere migrasjon av murine Skin dendrittiske celler i Tømming lymfeknuter Under infeksjon med<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacille Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Molekylær diffusjon i plasmamembraner Primære lymfocytter målt ved fluorescens korrelasjon spektroskopi

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasiv prøvetaking slimhinnene slimhinnen væske for kvantifisering av In Vivo øvre luftveier immun-megler nivåer

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Kvantifisering av Efferocytosis av encellede fluorescens mikroskopi

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

En Immunohistopathologic studie til folat reseptor Beta Macrophage og vaskulær immun Microenvironment i gigantiske celle arteritt

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Flow Cytometric Analyse av lymfocytt infiltrasjon i sentralnervesystemet under eksperimentell autoimmun encefalomyelitt

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...