Name: visualization, quantification, and mapping of immune cell populations in the tumor microenvironment
Uploaded: 2020-03-25T14:00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment at JoVE.com

Agradecemos al participante del estudio. Agradecemos a Louise Rousseau, coordinadora del biobanco HBP por la recuperación de las muestras de tejido y toda la información clínica asociada. Reconocemos las instalaciones de geopatología molecular y núcleo de imágenes celulares en el CRCHUM y Michael Persch de Visiopharm por su excelente asistencia técnica. Financiación: Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Canadian Liver Foundation, Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS) AIDS and Infectious Disease Network (Réseau SIDA-MI) y la Red Canadiense sobre Hepatitis C (CanHepC). CanHepC está financiado por una iniciativa conjunta de los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (CIHR) (NHC-142832) y la Agencia de Salud Pública del Canadá. M.F.M. recibió becas de la Universidad de Montreal, Bourse Gabriel Marquis y FRQS. T.F. recibió becas de doctorado de CIHR y CanHepC. S.T. tiene la Cátedra Roger-Des-Groseillers en cirugía oncológica hepatobiliar y pancreática, Université de Montréal.
Contribuciones del autor: M.F.M. diseñó, realizó experimentos y analizó datos. T.F. diseñó experimentos. A.C-B. proporcionaron orientación técnica. G.S. realizó toda la evaluación patológica del sujeto del estudio y aportó información sobre todos los aspectos patológicos. L.M. realizó la tinción de H&E, optimizó y realizó la adquisición de imágenes. M.N.A. realizó la mancha de PSR y proporcionó valiosos aportes técnicos. N.B. contribuyó al análisis de imágenes. S.T. es el investigador principal del biobanco HBP y es responsable de supervisar el funcionamiento general del biobanco. También aportó inestimables aportaciones sobre todos los aspectos del proyecto y sus implicaciones clínicas. M.F.M, T.F. y N.H.S. conceptualizaron y diseñaron el estudio. N.H.S. supervisó el trabajo y obtuvo fondos. M.F.M., T.F., A.C-B y N.H.S. escribieron el manuscrito. Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito.

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	<li>Greten, F. R., Grivennikov, S. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labeling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labeling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).</li><li>Segnani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+Detection+of+Collagen+Fibers+by+Sirius+Red/Fast+Green+Is+More+Sensitive+than+van+Gieson+or+Sirius+Red+Alone+in+Normal+and+Inflamed+Rat+Colon.">Histochemical Detection of Collagen Fibers by Sirius Red/Fast Green Is More Sensitive than van Gieson or Sirius Red Alone in Normal and Inflamed Rat Colon.</a> PloS One. 10 (12), 0144630 (2015).</li><li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Staining+by+Sequential+Immunostaining+and+Antibody+Removal+on+Routine+Tissue+Sections.">Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li></ol>

Los autores no declaran conflictos de intereses.

Se necesitan técnicas de multiplexación simples, accesibles y fáciles de ejecutar que permitan la resolución espacial de las células inmunitarias en las secciones de tejido para mapear el paisaje inmunológico en el cáncer y otros trastornos inmunológicos. Aquí, describimos una estrategia que integra técnicas de etiquetado y análisis digital ampliamente disponibles para ampliar la capacidad de multiplexación y evaluación multidimensional de los ensayos de imágenes12,,13,,17,19. La tinción de tres secciones seriales para diferentes marcadores, y la reutilización de secciones a través de técnicas de desmontaje y reproducción, nos permitió visualizar 11 parámetros además de las manchas H&E y PSR. Seis imágenes de estas secciones se alinearon de forma automatizada utilizando el módulo de alineación de tejidos. La alineación fue precisa a nivel de celda individual para las imágenes procedentes de la misma sección y altamente concordante para las imágenes que se originan en secciones vecinas. La multiplexación virtual nos permitió determinar cómo los marcadores visualizados en una sección se relacionan espacialmente con los marcadores visualizados en otra sección contigua. Mientras que algunas de las tinciones etiquetadas como COI, otras etiquetados como TCs, lo que nos permite cuantificar los COI en las diferentes tCs. El uso de herramientas de software para la cuantificación automatizada de COI simplificó y aceleró en gran medida el procesamiento de imágenes. Además, el análisis digital se aplicó a secciones de tejidos enteros en lugar de campos de visión seleccionados, lo que dio lugar a una representación imparcial del TME. Además, debido a que se registraron las coordenadas tisulares de los COI, fue posible generar mapas de calor tisulares.
Hay varias áreas en este protocolo donde puede ser necesario solucionar problemas. En primer lugar, la recuperación deficiente de antígenos puede afectar a la calidad del mIF, por lo que el tipo de búfer de recuperación de antígenos y la duración deben optimizarse para las condiciones específicas de ensayo/biomarcador utilizadas. En segundo lugar, el tipo de solución de bloqueo utilizada debe adaptarse a los tejidos/antígenos/especies de anticuerpos primarios y secundarios. En nuestras manos, la adición de 10% de suero total de la especie donde el tejido proviene de receptores Fc bloqueados, y por lo tanto redujo la unión inespecífica de anticuerpos. La adición del 10% del suero de la especie en la que se plantearon los anticuerpos secundarios minimizaría la unión directa inespecífica de anticuerpos secundarios a la sección tisular. En tercer lugar, la validación de la especificidad de los anticuerpos primarios y secundarios utilizando los controles positivos y negativos adecuados es esencial. En cuarto lugar, el aumento de la autofluorescencia en algunos canales y la difusión de DAPI tras la extracción de anticuerpos primarios también son comunes. Para abordar la autofluorescencia mejorada, utilizamos pares de anticuerpos primarios/secundarios donde la señal específica tenía valores de intensidad al menos 5 veces mayores que el del fondo. Por último, algunos anticuerpos de alta afinidad no se pueden eludar con procedimientos de desmontaje regulares. En este caso, se recomienda el uso de estos anticuerpos en la última ronda de etiquetado. El usuario puede tener que probar diferentes secuencias de tinción para encontrar la configuración óptima para los anticuerpos de interés. La eficiencia del desmontaje debe confirmarse antes de proceder a una segunda o tercera ronda de etiquetado.
La principal limitación y desafío de esta estrategia es encontrar las combinaciones correctas de anticuerpos fluorescentes primarios y secundarios para los marcadores de interés. Encontrar anticuerpos primarios criados en diferentes especies o con diferentes isotipos que podrían ser utilizados simultáneamente está limitado por lo que está disponible comercialmente. La mayoría de los escáneres de diapositivas enteras están equipados con lámparas y filtros que permiten tomar imágenes de un máximo de cinco canales, y los anticuerpos secundarios en las especies adecuadas y el fluoróforo adecuado no siempre están disponibles. Superamos parcialmente estas limitaciones utilizando manchas en serie y etiquetado secuencial. Es posible que sea necesario probar varias combinaciones de anticuerpos para llegar a la mejor combinación para los marcadores de interés. Otra limitación es la calidad de la tinción DAPI, ya que el desmontaje y la reprobing pueden no permitir siempre la realización de la segmentación de núcleos.
El módulo de alineación de tejido requiere un entrenamiento mínimo y ninguna habilidad de programación de los usuarios. El software teóricamente permite la alineación de un número ilimitado de imágenes. Sin embargo, la alineación precisa depende de la relación de las secciones, donde las secciones más cercanas que son más histológicamente concordantes se alinean con mayor precisión. Usamos el módulo Author de VIS para generar las APPs. El conocimiento básico del análisis de imágenes es necesario para crear APPs, pero esto es igualmente el caso cuando se utiliza cualquier otro software de análisis de imágenes. Las ventajas únicas de VIS en comparación con otros programas de análisis de imágenes incluyen la alineación automatizada de imágenes de secciones preparadas utilizando diferentes métodos (por ejemplo, IF, histoquímica, IHC). Esto permite realizar estudios de colocación de múltiples marcadores de interés mediante multiplexación virtual. Además, el diseño flexible y fácil de usar de las aplicaciones permite la personalización específica del usuario. La cuantificación y el mapeo automatizados, y la posibilidad de procesar secciones de tejido entero, ahorran tiempo y reducen el sesgo en comparación con el recuento manual mediante inspección visual.
Esta estrategia es una herramienta de investigación muy útil para la inmunología de tejidos en el contexto del cáncer y la autoinmunidad, pero sigue sin ser validada para uso clínico. Con estandarización y validación adicionales, se puede utilizar en el futuro para múltiples aplicaciones (por ejemplo, para mapear el paisaje inmune en el cáncer para predecir y monitorear la respuesta a los agentes inmunoterapéuticos). También se puede adaptar a diferentes condiciones inflamatorias (por ejemplo, enfermedad inflamatoria intestinal) para combinar la evaluación patológica con biomarcadores de pronóstico.
Los principales pasos críticos de este protocolo son la eficiencia/especificidad del etiquetado y la robustez de las APP diseñadas para el uso previsto o biomarcador. Por lo tanto, la validación regular por inspección visual, especialmente al diseñar una nueva APP, es esencial. El uso eficiente de múltiples rondas de desmontaje y reprobing o diferentes tipos de manchas en la misma sección son componentes críticos y pueden ser tejidoo o sección específica. Verificar la eficiencia de estos procesos antes de continuar con el análisis de lotes grandes es fundamental.
En resumen, proporcionamos una estrategia que maximiza la información cuantitativa y espacial que se puede obtener de valiosas muestras de tejido clínico. Los recursos, equipos y conocimientos necesarios para implementar esta metodología son ampliamente accesibles. Proponemos esta metodología como una guía útil para la planificación de ensayos destinados a identificar, cuantificar y mapear las poblaciones de células inmunitarias en el TME.

El desarrollo del cáncer es el resultado de un proceso de varios pasos que implica interacciones recíprocas entre las células malignas y el TME. Aparte de las células tumorales, el TME se compone de células no malignas, células estromales, poblaciones de células inmunitarias y matriz extracelular (ECM)1. La organización espacial de los diferentes componentes celulares y estructurales del tejido tumoral y el intercambio dinámico entre el cáncer y las células no cancerosas vecinas modulan en última instancia la progresión tumoral y la respuesta a la terapia2,,3,4. Se ha demostrado que la respuesta inmune en el cáncer está regulada espaciotemporalmente5,,6. Diferentes poblaciones de células inmunitarias que se infiltran en la lesión neoplásica y el tejido adyacente presentan patrones de distribución espacial distintivos y estados variados de activación y diferenciación asociados con diferentes funciones (por ejemplo, pro- versus antitumoral). Estas diferentes poblaciones inmunes y sus parámetros coevolucionan las horas extras con el tumor y los compartimentos estromales.
La aparición de tecnologías que permiten el perfilado multiómico de una sola célula ha aumentado exponencialmente nuestra comprensión de las numerosas redes celulares y moleculares que regulan la carcinogénesis y la progresión tumoral. Sin embargo, la mayoría de las herramientas analíticas de alto rendimiento basadas en células simples requieren interrupción del tejido y aislamiento de una sola célula, lo que resulta en la pérdida de información sobre la organización espacial de las células y las interacciones de células celulares7. Debido a que la ubicación y disposición de células inmunitarias específicas en el TME tienen valor diagnóstico y pronóstico, las tecnologías que permiten la resolución espacial son un complemento esencial de las técnicas de perfilado inmune basadas en células únicas.
Tradicionalmente, las técnicas de imagen como la inmunohistoquímica (IHC) y la inmunofluorescencia múltiple (mIF) se han restringido a un pequeño número de biomarcadores que se pueden visualizar simultáneamente. Esta limitación ha obstaculizado el estudio de la dinámica espaciotemporal de las células inmunitarias infiltrantes tumorales, que normalmente se definen mediante varios marcadores fenotípicos. Los recientes avances en herramientas analíticas y de imágenes han ampliado las posibilidades de multiplexación. Se han utilizado nuevas tecnologías de etiquetado basadas en anticuerpos como la histocitometría y la citometría de masas por imágenes para separar espacialmente hasta 12 y 32 biomarcadores, respectivamente8,9. La punción de espectrometría de masas, una técnica que no requiere etiquetado, tiene el potencial de crear imágenes de miles de biomarcadores simultáneamente en una sola sección10de tejido,11. Aunque estas técnicas ya han demostrado un gran potencial para disuader el paisaje inmune del tejido en el cáncer, utilizan equipos y software altamente sofisticados y costosos y no son fácilmente accesibles para la mayoría de los investigadores.
Alternativamente, la capacidad de multiplexación de IHC y mIF tradicionales se ha ampliado mediante el uso de imágenes en serie, rondas secuenciales de etiquetado e imágenes espectrales7,12,13,14,15,16. Estas técnicas generan varias imágenes a partir de la misma o de secciones de tejido serie que se pueden consolidar en diapositivas virtuales multiparámetro utilizando el software de análisis de imágenes. Como resultado, el número de marcadores que se pueden visualizar y analizar simultáneamente aumenta.
Aquí, proponemos una estrategia para el diseño racional de ensayos multiplex de tejidos utilizando reactivos disponibles comercialmente, equipos de microscopía asequibles y software fácil de usar(Figura 1). Esta metodología integra imágenes en serie, etiquetado multiplex secuencial, imágenes de tejido entero y alineación de tejidos para generar diapositivas virtuales multiparámetros que se pueden utilizar para la cuantificación automatizada y el mapeo de células inmunitarias en secciones de tejido. Usando esta estrategia, creamos una diapositiva virtual compuesta por 11 biomarcadores más dos manchas histológicas de uso frecuente: hematoxilina y eosina (H&E) y picrosirius rojo (PSR). Se identificaron, ubicaron y cuantificaron múltiples poblaciones de células inmunitarias en diferentes compartimentos tisulares y su distribución espacial se resolvió utilizando mapas de calor tisulares. Esta estrategia maximiza la información que se puede obtener de muestras clínicas limitadas y es aplicable a muestras de tejido archivado sin parafina (FFPE) fijadas en formalina, incluyendo tejido entero, biopsias de agujas de núcleo y microarrays de tejido. Proponemos esta metodología como guía útil para el diseño de ensayos personalizados para la identificación, cuantificación y mapeo de poblaciones de células inmunitarias en el TME.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1419px;" width="1418">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:649px;">Antigen Retrieval Solution: Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% v/v Tween 20, pH 6.0)</td>
			<td style="width:257px;"></td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blocking Solution: 1 % BSA, 10 % filtered human serum, 10 % filtered donkey serum, 0.1 % Tween 20, and 0.3% Triton in PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>800-095-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coplin jars (EASYDIP SLIDE STAINING SYSTEM)</td>
			<td>Newcomersupply</td>
			<td>5300KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545E 22*50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Direct Red 80</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td align="right">365548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol 100%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electric pressure cooker</td>
			<td>Salton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eosin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td align="right">3801600</td>
			<td>CAUTION, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td>CAUTION, harmful by inhalation, ingestion and skin absortion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FFPE section (4&#956;m) slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycine 0,1 M in PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hematoxylin Stain Solution, Gil 1. Formulation, Regular Strength</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3535-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Holder (EasyDip Staining Jar Holder)</td>
			<td>Newcomersupply</td>
			<td>5300RK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td align="right">22210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Humidity chamber</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z670138-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pap pen</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS-Tween 20 (0.1% v/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Permount Mounting Media</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Picric Acid 1.3 %</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6744</td>
			<td>CAUTION, skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Picro-Sirius Red/Fast Green solution: Fast Green 0.1 % w/v + Sirius Red 0.2 % w/v in 1,3 % picric acid solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-&#945;SMA</td>
			<td>Mouse IgG2a 1A4</td>
			<td>Sigma A2547</td>
			<td>Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD34</td>
			<td>Mouse IgG1 HPCA1/763</td>
			<td>Novus Biologicals NBP2-44568</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-Cytokeratin 8/18</td>
			<td>Rabbit EP17/EP30</td>
			<td>Agilent IR09461-2</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD68</td>
			<td>Mouse KP1</td>
			<td>Abcam ab955</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-Desmin</td>
			<td>Rabbit Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen PA5-16705</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD4</td>
			<td>Mouse N1UG0</td>
			<td>Affymetrix 14-2444</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-FoxP3</td>
			<td>Rabbit 1054C</td>
			<td>R &#38; D MAB8214</td>
			<td>Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-MPO</td>
			<td>Goat Polyclonal</td>
			<td>R &#38; D Systems AF3667</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD3</td>
			<td>Rabbit SP7</td>
			<td>Abcam ab16669</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD8</td>
			<td>Mouse C8/144B</td>
			<td>Invitrogen 14-0085-80</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-mouse A488</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-21202</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-Rabbit A488</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-21206</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-goat A568</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-11057</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-rabbit A647</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-31573</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Rat anti-mouse IgG1 A647</td>
			<td>RMG1-1</td>
			<td>Biolegend 406618</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Goat anti-mouse IgG2a CF568</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Sigma Aldrich SAB4600315</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-mouse DyLight 755</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen SA5-10171</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-rabbit DyLight 755</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen SA5-10043</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SDS</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SDS001,500</td>
			<td>CAUTION, oral skin and eye toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shandon multi-program robotic slide stainer</td>
			<td>LabX</td>
			<td align="right">11384903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shandon Xylene Substitute,</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CA89413-336</td>
			<td>CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shaking water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SlowFade Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td align="right">1545801</td>
			<td>CAUTION, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stripping Buffer: mix 20 ml 10% w/v SDS with 12.5 ml 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), and 67.5 ml ultra-pure water. Under a fume hood, add 800 uL of 2-mercapto ethanol (114,4 mM final concentration)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-HCl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VIS Software</td>
			<td>Visiopharm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Whole slide scanner Olympus BX61VS</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Microscope: Olympus Slide Scanner BX61VS, 5 slides scanner, motorized stage, autofocus. Camera: Lightsource: Xcite-120. Filters: BrightLine&#174; Sedat filter set (# LED-DA/FI/TR/Cy5-4X4M-B-000, Semrock)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736-4L</td>
			<td>CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylene : Ethanol solution (1:1 v/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>CAUTION, harmful by ingestion, inhalation, fatal if sking absortion. Eye irritation. Use fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization, quantification, and mapping of immune cell populations in the tumor microenvironment

El paisaje inmune del microambiente tumoral (TME) es un factor determinante en la progresión del cáncer y la respuesta a la terapia. Específicamente, la densidad y la ubicación de las células inmunitarias en el TME tienen valores diagnósticos y pronósticoimportantes. El perfil multiómico del TME ha aumentado exponencialmente nuestra comprensión de las numerosas redes celulares y moleculares que regulan la iniciación y progresión tumoral. Sin embargo, estas técnicas no proporcionan información sobre la organización espacial de las celdas o las interacciones de celdas. Se necesitan técnicas de multiplexación asequibles, accesibles y fáciles de ejecutar que permitan la resolución espacial de las células inmunitarias en las secciones de tejido para complementar las tecnologías de alto rendimiento basadas en células únicas. Aquí, describimos una estrategia que integra imágenes en serie, etiquetado secuencial y alineación de imágenes para generar diapositivas virtuales multiparámetros de secciones de tejido entero. Las diapositivas virtuales se analizan posteriormente de forma automatizada utilizando protocolos definidos por el usuario que permiten la identificación, cuantificación y mapeo de poblaciones de células de interés. El análisis de imágenes se realiza, en este caso utilizando los módulos de análisis Tissuealign, Author y HISTOmap. Presentamos un ejemplo en el que aplicamos esta estrategia con éxito a una muestra clínica, maximizando la información que se puede obtener de muestras de tejido limitadas y proporcionando una visión imparcial del TME en toda la sección de tejido.

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Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment

Aquí, describimos una estrategia simple y accesible para visualizar, cuantificar y mapear células inmunitarias en secciones de tejido tumoral incrustado en parafina fija de formalina. Esta metodología combina las técnicas existentes de análisis de imágenes y digitales con el propósito de ampliar la capacidad de multiplexación y el análisis multiparámetro de ensayos de imágenes.

Visualización, cuantificación y mapeo de poblaciones de células inmunes en el microambiente tumoral

The immune landscape of the tumor microenvironment (TME) is a determining factor in cancer progression and response to therapy. Specifically, the density ...

La organización espacial de las células inmunitarias en el microambiente tumoral tiene valor clínico. Esta estrategia se puede utilizar fácilmente para visualizar, cuantificar y mapear las células inmunitarias dentro del tejido tumoral. La inmunoterapia ha revolucionado el tratamiento oncológico.Sin embargo, no todos los pacientes responden bien. Esta estrategia puede servir para definir las firmas inmunes a los tejidos que pueden predecir una buena respuesta antitumo tumoral. Antes de realizar un experimento, pruebe las combinaciones de anticuerpos y las técnicas de desprendimiento en los tejidos de control y verifique que las aplicaciones sean precisas en su detección de marcadores de interés.Como las descripciones escritas de los métodos de análisis de imágenes utilizan un lenguaje técnico sofisticado, la combinación de texto con vídeo facilita una mejor comprensión y replicación de la metodología. Para la recuperación de antígenos de secciones de tejido tumoral fijadas en formalina, incrustadas en parafina, sumerja la muestra de tejido desparasito en un frasco de Coplin de solución de recuperación de antígenos y coloque el frasco en una olla de presión eléctrica que contenga agua del grifo. El nivel del agua no debe exceder la mitad de la altura del frasco para que el agua no se mezcle con la solución de recuperación de antígenos.Cierre la tapa y la válvula de presión de la olla y trate los portaobjetos a alta presión durante 10 minutos. Al final del tratamiento, desenchufe la olla, suelte la presión y abra la tapa. Después de que los portaobjetos se hayan enfriado en la olla durante 30 minutos, lave las muestras dos veces durante cinco minutos en PBS fresco por lavado en un nuevo frasco de Coplin, luego use una pluma hidrófoba para dibujar una barrera alrededor de cada sección de tejido.A continuación, sumerja los portaobjetos en 0,1-glicina molar en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de enjuagar los portaobjetos dos veces en PBS como se ha demostrado. Después del segundo lavado, transfiera los portaobjetos a una cámara de humedad y cubra cada sección del tejido con una solución de bloqueo. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, enjuague las secciones dos veces durante cinco minutos en PBS-Tween fresco por lavado y luego agregue los anticuerpos primarios de interés, diluidos en solución de bloqueo, a cada diapositiva, protegidos de la luz.Al final de la incubación, enjuague los portaobjetos tres veces en PBS-Tween fresco durante cinco minutos por lavado y, a continuación, etiquete las secciones con los anticuerpos secundarios adecuados durante una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación, enjuague los portaobjetos tres veces en PBS-Tween fresco durante cinco minutos por lavado. Siga con un solo enjuague en agua doble destilada.Retire el exceso de agua de cada corredera y monte los tejidos con un medio de montaje complementado con DAPI y un portaobjetos de cubierta. Después de apretar el exceso de medio de montaje, deje que los portaobjetos se sequen durante 20 minutos a temperatura ambiente, protegidos de la luz, antes de adquirir imágenes para todos los canales utilizando un escáner de deslizamiento completo. Después de escanear, abra las imágenes en el software de análisis de imágenes y haga clic en la pestaña Tissuealign.Para importar las imágenes que se van a alinear en la bandeja de diapositivas, seleccione la primera imagen que desea alinear desde la base de datos. Cuando se hayan cargado todas las imágenes, haga clic en Siguiente en los pasos del flujo de trabajo para vincular las imágenes y arrastrar y soltar todas las imágenes que se alinearán en la primera imagen. Cuando todas las imágenes se hayan vinculado según corresponda, utilice un mínimo de tres pines por imagen que indiquen las entidades de tejido homólogo en las imágenes enlazadas.Utilice un pasador para trazar la primera imagen para comprobar la calidad de la alineación resultante. Si se ha obtenido una alineación satisfactoria, haga clic en Siguiente para ver las capas de imagen y guardar la imagen compuesta en la base de datos. Para realizar una detección de tejido mediante el protocolo definido por el usuario APP 1, abra la pestaña Análisis de imagen y abra la imagen compuesta en el módulo de análisis de imágenes.Haga clic en el icono Abrir APP y seleccione la APP adecuada. Para confirmar que la aplicación funciona, vaya a una ubicación de tejido seleccionada y haga clic en Vista previa. Si los resultados son satisfactorios, haga clic para procesar la imagen utilizando la APLICACIÓN seleccionada.Durante el procesamiento, la APP determinará si el píxel está asociado o no con el tejido para permitir la conversión de todos los píxeles asociados al tejido en una región de interés. La región de interés recién creada se puede transferir a cualquiera de las imágenes alineadas. Al final del análisis, haga clic en Archivo y Guardar para guardar la imagen modificada con la región de interés recién creada.Para la segmentación del tejido en estroma y parénquima, abra la pestaña Análisis de imagen y seleccione los archivos de interés de la base de datos. Open APP 2, APP 2 utiliza la imagen teñida de PSR para la segmentación de tejidos. Previsualice APP 2 procesando la imagen en un campo de visión seleccionado.Si los resultados son satisfactorios, haga clic en Ejecutar para procesar APP 2 en la imagen completa. La región de interés del tejido se segmentará en estroma y parénquima y se determinarán sus respectivas áreas. Las regiones recién creadas de interés para el estroma y el parénquima se pueden transferir a las imágenes alineadas y, a continuación, exportar y guardar la imagen modificada como se muestra.Para identificar y cuantificar las poblaciones celulares de interés, importe la imagen segmentada de interés en el módulo de análisis de imágenes. Después de ajustar el color, abra APP 3. APP 3 detectará las poblaciones celulares de interés y las cuantificará dentro del parénquima y el estroma.Si los resultados son satisfactorios, ejecute APP 3 en la imagen completa. Se etiquetarán todas las células individuales de interés, se almacenarán sus coordenadas tisulares y se determinarán las densidades de las células de interés en las regiones estroma y parénquimal. La imagen modificada se puede guardar como se muestra.Para realizar el mapeo térmico de tejido de los objetos etiquetados de celda de interés, abra el protocolo definido por el usuario adecuado en la ventana de selección de APP y haga clic en Ejecutar para solicitar a la APLICACIÓN que utilice las coordenadas de los objetos etiquetados con anticuerpos para generar el mapa de calor. Las áreas de puntos calientes, resaltadas en rojo, contienen la mayor densidad de la población celular de interés, mientras que las áreas de color azul oscuro tienen la más baja. El mapa de calor de una población celular específica se puede superponer a las imágenes alineadas para proporcionar información adicional sobre cómo se organizan estas células dentro del microambiente tumoral.A continuación, exporte y guarde el mapa de calor del tejido. Es fundamental verificar la especificidad del etiquetado, la precisión de las aplicaciones diseñadas y la eficiencia de desmontaje y reprobado de las diferentes manchas en la misma sección. Mediante la integración de imágenes en serie, etiquetado secuencial y alineación de tejidos, se pueden visualizar más marcadores simultáneamente y se puede extraer más información de muestras clínicas limitadas.La tinción H&E de secciones de tejido tumoral resectadas permite evaluar la arquitectura tisular, la morfología celular y parámetros clínicamente relevantes, como el tipo de neoplasia maligna, el grado tumoral y la infiltración inmune general. La tinción CD34 permite la detección de células endoteliales. La tinción de citoqueratina 8/18 revela la presencia de células epiteliales, y la tinción de actina muscular lisa anti alfa permite la identificación de células estelares fibrogénicas, activadas y hepáticas.El reprobado con anticuerpos contra CD68 y Desmin permite la detección de macrófagos y miofibroblastos respectivamente. Para caracterizar mejor el infiltrado inmune al tumor, se puede realizar manchas para marcadores de células T y mieloperoxidasa. La tinción Picro Sirius Red también se puede realizar para visualizar el colágeno fibrilar y facilitar la segmentación del estroma y el parénquima.Los píxeles asociados al tejido dentro de las secciones teñidas se pueden identificar para permitir la segmentación de diferentes compartimentos dentro de una región específica de interés. Las poblaciones celulares de interés se pueden identificar dentro de cada región, lo que permite la generación de mapas de tejidos para los que las regiones de alta densidad para una población celular determinada se muestran como puntos calientes y regiones con una densidad relativamente baja aparecen como puntos fríos. Esta metodología para identificar, cuantificar y mapear células inmunitarias en muestras de tejido se puede adaptar y validar para una investigación específica preguntas y marcador de interés.Esta estrategia se puede aplicar a micro arreglos de discos de tejido para un análisis de alto rendimiento. También se puede combinar con hibridación in situ para examinar simultáneamente la proteína in situ y la expresión génica. Hemos utilizado esta estrategia para identificar y mapear células productoras de IL-17A in situ en tejido hepático fibroso de pacientes.Como se indica en el protocolo, varios reactivos son químicamente peligrosos y los procedimientos pertinentes deben realizarse en una campana química utilizando el equipo de protección personal adecuado y las precauciones.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Siete pasos para células estrelladas

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Investigación

Inmunología e Infección

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Imagen intravital del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Cuantificación de la respuesta estallido respiratorio como un indicador de la salud inmune innata en el pez cebra

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

Un ensayo basado en CFSE para estudiar la migración de la piel murina de células dendríticas en los nodos linfáticos de drenaje durante la infección con<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacilo de Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Difusión molecular en el plasma membranas de linfocitos primarios medidos por espectroscopia de correlación de fluorescencia

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Muestreo no invasivo de revestimiento mucoso líquido para la cuantificación In Vivo de la vía aérea superior mediador inmune niveles

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

Un estudio de Immunohistopathologic a perfil el folato del Receptor Beta macrófago y microambiente inmunológico Vascular en Arteritis de células gigantes

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Análisis citométrico de flujo de infiltración de linfocitos en el sistema nervioso central durante la encefalomielitis autoinmune experimental

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...