Name: visualization, quantification, and mapping of immune cell populations in the tumor microenvironment
Uploaded: 2020-03-25T14:00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment at JoVE.com

Vi tackar studiedeltagaren. Vi tackar Louise Rousseau, samordnare för HBP biobank för återvinning av vävnadsprover och alla tillhörande klinisk information. Vi erkänner de molekylära patologi och cell imaging kärnanläggningar på CRCHUM och Michael Persch från Visiopharm för utmärkt tekniskt stöd. Finansiering: Denna studie stöddes av bidrag från Canadian Liver Foundation, Fonds de recherche du Québec–Santé (FRQS) AIDS and Infectious Disease Network (Réseau SIDA-MI) och Canadian Network on Hepatit C (CanHepC). CanHepC finansieras genom ett gemensamt initiativ från Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (NHC-142832) och Public Health Agency of Canada. M.F.M. fick stipendier från Université de Montréal, Bourse Gabriel Marquis och FRQS. T.F. fick doktorandstipendium från CIHR och CanHepC. S.T. innehar Roger-Des-Groseillers ordförande i hepatobiliary och bukspottskörteln onkologiska kirurgi, Université de Montréal.
Författare bidrag: M.F.M. utformade, utförde experiment och analyserade data. T.F. designade experiment. A.C-B. teknisk vägledning. G.S. utförde all patologisk bedömning av försökspersonen och gav input på alla patologiska aspekter. L.M. utförde H&E-färgning, optimerade och utförde bildförvärv. M.N.A. utförde PSR-fläcken och gav värdefull teknisk ingång. N.B. bidrog till bildanalysen. S.T. är huvudforskare för HBP biobank och ansvarar för att övervaka den övergripande driften av biobanken. Han gav också ovärderlig input på alla aspekter av projektet och dess kliniska konsekvenser. M.F.M, T.F., och N.H.S. konceptualiserade och utformade studien. N.H.S. övervakade arbetet och erhöll finansiering. M.F.M., T.F., A.C-B och N.H.S. skrev manuskriptet. Alla författare granskade och godkände manuskriptet.

<ol>
	<li>Greten, F. R., Grivennikov, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+Cancer:Triggers,+Mechanisms,+and+Consequences.">Inflammation and Cancer:Triggers, Mechanisms, and Consequences.</a> Immunity. 51 (1), 27-41 (2019).</li><li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+validation+of+the+consensus+Immunoscore+for+the+classification+of+colon+cancer:+a+prognostic+and+accuracy+study.">International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study.</a> Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).</li><li>Binnewies, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+tumor+immune+microenvironment+(TIME)+for+effective+therapy.">Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy.</a> Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).</li><li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+the+tumor+immune+microenvironment+for+staging+and+therapeutics.">Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics.</a> Modern Pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 31 (2), 214-234 (2018).</li><li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+dynamics+of+intratumoral+immune+cells+reveal+the+immune+landscape+in+human+cancer.">Spatiotemporal dynamics of intratumoral immune cells reveal the immune landscape in human cancer.</a> Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).</li><li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+introduction+of+the+'Immunoscore'+in+the+classification+of+malignant+tumours.">Towards the introduction of the 'Immunoscore' in the classification of malignant tumours.</a> The Journal of Pathology. 232 (2), 199-209 (2014).</li><li>Finotello, F., Eduati, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Omics+Profiling+of+the+Tumor+Microenvironment:+Paving+the+Way+to+Precision+Immuno-Oncology.">Multi-Omics Profiling of the Tumor Microenvironment: Paving the Way to Precision Immuno-Oncology.</a> Frontiers in Oncology. 8, 430 (2018).</li><li>Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histo-cytometry:+a+method+for+highly+multiplex+quantitative+tissue+imaging+analysis+applied+to+dendritic+cell+subset+microanatomy+in+lymph+nodes.">Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes.</a> Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).</li><li>Giesen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+imaging+of+tumor+tissues+with+subcellular+resolution+by+mass+cytometry.">Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry.</a> Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).</li><li>Porta Siegel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry+Imaging+and+Integration+with+Other+Imaging+Modalities+for+Greater+Molecular+Understanding+of+Biological+Tissues.">Mass Spectrometry Imaging and Integration with Other Imaging Modalities for Greater Molecular Understanding of Biological Tissues.</a> Molecular Imaging and Biology : MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 20 (6), 888-901 (2018).</li><li>Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry+Imaging:+A+Review+of+Emerging+Advancements+and+Future+Insights.">Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights.</a> Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).</li><li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype.">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).</li><li>Gendusa, R., Scalia, C. R., Buscone, S., Cattoretti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elution+of+High-affinity+(&gt;10-9+KD)+Antibodies+from+Tissue+Sections:+Clues+to+the+Molecular+Mechanism+and+Use+in+Sequential+Immunostaining.">Elution of High-affinity (&gt;10-9 KD) Antibodies from Tissue Sections: Clues to the Molecular Mechanism and Use in Sequential Immunostaining.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (7), 519-531 (2014).</li><li>van der Loos, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunoenzyme+staining:+methods+and+visualizations+for+the+observation+with+spectral+imaging.">Multiple immunoenzyme staining: methods and visualizations for the observation with spectral imaging.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 313-328 (2008).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labeling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labeling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).</li><li>Segnani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+Detection+of+Collagen+Fibers+by+Sirius+Red/Fast+Green+Is+More+Sensitive+than+van+Gieson+or+Sirius+Red+Alone+in+Normal+and+Inflamed+Rat+Colon.">Histochemical Detection of Collagen Fibers by Sirius Red/Fast Green Is More Sensitive than van Gieson or Sirius Red Alone in Normal and Inflamed Rat Colon.</a> PloS One. 10 (12), 0144630 (2015).</li><li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Staining+by+Sequential+Immunostaining+and+Antibody+Removal+on+Routine+Tissue+Sections.">Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li></ol>

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Enkla, tillgängliga och lätta att utföra multiplextekniker som tillåter rumslig upplösning av immunceller i vävnadssektioner behövs för att kartlägga immunförsvaret i cancer och andra immunologiska sjukdomar. Här beskriver vi en strategi som integrerar allmänt tillgängliga märkning och digital analys tekniker för att utöka multiplexering kapacitet och flerdimensionell bedömning av bildframställning analyser12,13,17,19. Färgning av tre seriella sektioner för olika markörer, och återanvändning av sektioner genom strippning och reprobing tekniker, gjorde det möjligt för oss att visualisera 11 parametrar utöver H & E och PSR fläckar. Sex bilder från dessa avsnitt var i linje på ett automatiserat sätt med hjälp av vävnad justering modulen. Justeringen var exakt på den enskilda cellnivån för bilder som kommer från samma avsnitt och mycket samstämmiga för bilder som kommer från angränsande sektioner. Virtuell multiplexering gjorde det möjligt för oss att avgöra hur markörer som visualiseras i ett avsnitt relaterar rumsligt till markörer som visualiseras i ett annat sammanhängande avsnitt. Medan vissa av de färgningar märkta COI, andra märkt TCs, så att vi kan kvantifiera COI i de olika TCs. Användningen av programvaruverktyg för automatiserad kvantifiering av COI förenklas och påskyndas avsevärt bearbetningen av bilder. Dessutom tillämpades digital analys på hela vävnadssektioner i stället för utvalda synfält, vilket resulterade i en opartisk representation av TME. Eftersom vävnadskoordinaterna för COI registrerades var det dessutom möjligt att generera värmekartor för vävnad.
Det finns flera områden i det här protokollet där felsökning kan behövas. För det första kan dålig antigen hämtning påverka kvaliteten på mIF, därför bör typen av antigen hämtningsbuffert och varaktighet optimeras för de specifika tillstånd för analys/biomarkör som används. För det andra bör den typ av blockerande lösning som används anpassas till vävnader/antigen/arter av primära och sekundära antikroppar. I våra händer, tillägg av 10% totalt serum från de arter där vävnaden kommer från blockerade Fc receptorer, och därmed minskat ospecificerad antikropp bindande. Tillsats av 10% av serum från arten de sekundära antikropparna höjdes i skulle minimera direkt ospecifik fastsättning av sekundära antikroppar till vävnadssektionen. För det tredje är validering av specificiteten hos de primära och sekundära antikropparna med rätt positiva och negativa kontroller nödvändig. För det fjärde, ökad autofluorescens i vissa kanaler och spridning av DAPI på primära antikroppar strippning är också vanliga. För att ta itu med den förbättrade autofluorescensen använde vi primära/sekundära antikroppspar där den specifika signalen hade intensitetsvärden minst 5x i bakgrunden. Slutligen kan vissa antikroppar med hög affinitet inte elueras med regelbundna strippningsprocedurer. I detta fall rekommenderar vi att du använder sådana antikroppar i den sista rundan av märkning. Användaren kan behöva prova olika färgningssekvenser för att hitta den optimala konfigurationen för de antikroppar av intresse. Strippnings effektivitet bör bekräftas innan en andra eller tredje omgång märkning.
Den största begränsningen och utmaningen med denna strategi är att hitta rätt kombinationer av primära och sekundära fluorescerande antikroppar för markörer av intresse. Att hitta primära antikroppar som föds upp hos olika arter eller med olika isotyper som kan användas samtidigt begränsas av vad som är kommersiellt tillgängligt. De flesta hela diaskannrar är utrustade med lampor och filter som tillåter avbildning högst fem kanaler, och sekundära antikroppar i rätt art och rätt fluorofore är inte alltid tillgängliga. Vi övervann delvis dessa begränsningar med hjälp av seriella färgningar och sekventiell märkning. Flera antikroppskombinationer kan behöva testas för att komma fram till den bästa kombinationen för markörer av intresse. En annan begränsning är kvaliteten på DAPI färgning, eftersom strippning och reprobing kanske inte alltid tillåter utför kärnor segmentering.
Vävnadsmodulen kräver minimal utbildning och inga programmeringsfärdigheter från användarna. Programvaran tillåter teoretiskt anpassning av ett obegränsat antal bilder. Exakt anpassning beror dock på relateradhet i sektioner, där närmare sektioner som är mer histologiskt samstämmiga är mer exakt anpassade. Vi använde author-modulen i VIS för att generera APPs. Grundläggande kunskaper om bildanalys behövs för att skapa APPs, men detta är lika fallet när du använder någon annan bildanalys programvara. De unika fördelarna med VIS jämfört med andra bildanalysprogram inkluderar automatiserad anpassning av bilder från sektioner som utarbetats med olika metoder (t.ex. Detta möjliggör colocalization studier av flera markörer av intresse med hjälp av virtuella multiplexering. Dessutom möjliggör den flexibla och användarvänliga utformningen av AP:er användarspecifik anpassning. Automatiserad kvantifiering och kartläggning, och möjligheten att bearbeta hela vävnadssektioner, sparar tid och minskar bias jämfört med manuell räkning genom visuell inspektion.
Denna strategi är ett mycket användbart forskningsverktyg för vävnadsimmunologi i samband med cancer och autoimmunitet men är fortfarande inte förbrukat för klinisk användning. Med ytterligare standardisering och validering kan den användas i framtiden för flera tillämpningar (t.ex. för att kartlägga immunlandskapet i cancer för att förutsäga och övervaka svaret på immunoterapeutiska medel). Det kan också anpassas till olika inflammatoriska tillstånd (t.ex. inflammatorisk tarmsjukdom) för att kombinera patologisk utvärdering med prognostiska biomarkörer.
De viktigaste kritiska stegen i detta protokoll är effektiviteten/specificiteten hos märkningen och robustheten hos de utformade API:erna för avsedd användning eller biomarkör. Därför är regelbunden validering genom visuell inspektion, särskilt vid utformningen av en ny APP, viktigt. Effektiv användning av flera omgångar av strippning och reprobing eller olika typer av fläckar på samma avsnitt är kritiska komponenter och kan vara vävnad eller avsnitt specifika. Det är viktigt att verifiera effektiviteten i sådana processer innan du fortsätter med stor batchanalys.
Sammanfattningsvis tillhandahåller vi en strategi som maximerar den kvantitativa och rumsliga information som kan erhållas från värdefulla kliniska vävnadsprover. De resurser, den utrustning och den kunskap som krävs för att genomföra denna metod är allmänt tillgängliga. Vi föreslår denna metod som en användbar guide för planering analyser som syftar till att identifiera, kvantifiera och kartlägga immuncellpopulationer i TME.

Cancer utveckling är resultatet av en multistep process som innebär ömsesidiga interaktioner mellan maligna celler och TME. Andra än tumörceller, TME består av nonmalignant celler, stromal celler, immun cell populationer, och extracellulär matris (ECM)1. Den rumsliga organisationen av de olika cellulära och strukturella komponenterna i tumörvävnaden och det dynamiska utbytet mellan cancer och angränsande icke-cancerceller modulerar i slutändan tumörprogression och svar på terapi2,3,4. Det har visat sig att immunsvaret i cancer är spatiotemporally regleras5,6. Olika immuncellpopulationer som infiltrerar neoplastiska lesionen och den intilliggande vävnaden uppvisar distinkta rumsliga fördelningsmönster och varierande aktiverings- och differentieringstillstånd som är associerade med olika funktioner (t.ex. pro- kontra antitumor). Dessa olika immun populationer och deras parametrar coevolve övertid med tumör och stromal fack.
Framväxten av teknik som tillåter single cell multiomics profilering har exponentiellt ökat vår förståelse av de många cellulära och molekylära nätverk som reglerar carcinogenes och tumör progression. De flesta enskilda cellbaserade analysverktyg med hög genomströmning kräver dock vävnadsstörningar och isolering av en cell, vilket resulterar i förlust av information om den rumsliga organisationen av celler och cellcellinteraktioner7. Eftersom placeringen och arrangemanget av specifika immunceller i TME har diagnostiska och prognostiska värde, teknik som möjliggör rumslig upplösning är ett viktigt komplement till encelliga immun profilering tekniker.
Traditionellt har bildframställningstekniker som immunohistochemistry (IHC) och multipleximmunfluorescens (mIF) begränsats till ett litet antal biomarkörer som kan visualiseras samtidigt. Denna begränsning har hämmat studien av spatiotemporal dynamiken i tumör-infiltrera immunceller, som vanligtvis definieras av flera fenotypiska markörer. De senaste framstegen inom bildbehandling och analysverktyg har utökat möjligheterna till multiplexering. Nya antikroppsbaserade märkningstekniker som histo-cytometri och avbildningsmassacytometri har använts för att rumsligt separera upp till 12 respektive 32 biomarkörer,respektive 8,9. Masspektrometri imaging, en teknik som inte kräver märkning, har potential att avbilda tusentals biomarkörer samtidigt i en enda vävnad avsnitt10,11. Även om dessa tekniker har redan visat stor potential för att dissekera vävnaden immun landskapet i cancer, de använder mycket sofistikerad och dyr utrustning och programvara och är inte lätt tillgängliga för de flesta forskare.
Alternativt har multiplexeringskapaciteten hos traditionella IHC och mIF utökats med hjälp av seriell avbildning, sekventiella avikappningsrundor och spektralavbildning7,,12,13,14,15,16. Dessa tekniker genererar flera bilder från samma eller från seriella vävnadssektioner som kan konsolideras i virtuella multiparameterbilder med hjälp av bildanalysprogramvara. Därför ökar antalet markörer som kan visualiseras och analyseras samtidigt.
Här föreslår vi en strategi för rationell design av vävnad multiplex analyser med kommersiellt tillgängliga reagenser, prisvärd mikroskopi utrustning, och användarvänlig programvara(figur 1). Denna metod integrerar seriell avbildning, sekventiell multiplex märkning, hela vävnadsavbildning och vävnadsjustering för att generera virtuella multiparameter diabilder som kan användas för automatiserad kvantifiering och kartläggning av immunceller i vävnadssektioner. Med hjälp av denna strategi skapade vi en virtuell bild bestående av 11 biomarkörer plus två ofta använda histologiska fläckar: hematoxylin och eosin (H&E) och picrosirius red (PSR). Flera immun cell populationer identifierades, ligger och kvantifieras i olika vävnadsutrymmen och deras rumsliga fördelningen lösas med hjälp av vävnad heatmaps. Denna strategi maximerar den information som kan erhållas från begränsade kliniska prover och är tillämplig på formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) arkiverade vävnadsprover, inklusive hela vävnad, core nål tarmbiopsier och vävnad mikroarrayer. Vi föreslår denna metod som en användbar guide för att utforma anpassade analyser för identifiering, kvantifiering och kartläggning av immuncellpopulationer i TME.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1419px;" width="1418">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:649px;">Antigen Retrieval Solution: Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% v/v Tween 20, pH 6.0)</td>
			<td style="width:257px;"></td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blocking Solution: 1 % BSA, 10 % filtered human serum, 10 % filtered donkey serum, 0.1 % Tween 20, and 0.3% Triton in PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>800-095-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coplin jars (EASYDIP SLIDE STAINING SYSTEM)</td>
			<td>Newcomersupply</td>
			<td>5300KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545E 22*50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Direct Red 80</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td align="right">365548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol 100%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electric pressure cooker</td>
			<td>Salton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eosin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td align="right">3801600</td>
			<td>CAUTION, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td>CAUTION, harmful by inhalation, ingestion and skin absortion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FFPE section (4&#956;m) slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycine 0,1 M in PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hematoxylin Stain Solution, Gil 1. Formulation, Regular Strength</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3535-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Holder (EasyDip Staining Jar Holder)</td>
			<td>Newcomersupply</td>
			<td>5300RK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td align="right">22210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Humidity chamber</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z670138-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pap pen</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS-Tween 20 (0.1% v/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Permount Mounting Media</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Picric Acid 1.3 %</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6744</td>
			<td>CAUTION, skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Picro-Sirius Red/Fast Green solution: Fast Green 0.1 % w/v + Sirius Red 0.2 % w/v in 1,3 % picric acid solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-&#945;SMA</td>
			<td>Mouse IgG2a 1A4</td>
			<td>Sigma A2547</td>
			<td>Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD34</td>
			<td>Mouse IgG1 HPCA1/763</td>
			<td>Novus Biologicals NBP2-44568</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-Cytokeratin 8/18</td>
			<td>Rabbit EP17/EP30</td>
			<td>Agilent IR09461-2</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD68</td>
			<td>Mouse KP1</td>
			<td>Abcam ab955</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-Desmin</td>
			<td>Rabbit Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen PA5-16705</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD4</td>
			<td>Mouse N1UG0</td>
			<td>Affymetrix 14-2444</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-FoxP3</td>
			<td>Rabbit 1054C</td>
			<td>R &#38; D MAB8214</td>
			<td>Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-MPO</td>
			<td>Goat Polyclonal</td>
			<td>R &#38; D Systems AF3667</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD3</td>
			<td>Rabbit SP7</td>
			<td>Abcam ab16669</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD8</td>
			<td>Mouse C8/144B</td>
			<td>Invitrogen 14-0085-80</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-mouse A488</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-21202</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-Rabbit A488</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-21206</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-goat A568</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-11057</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-rabbit A647</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-31573</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Rat anti-mouse IgG1 A647</td>
			<td>RMG1-1</td>
			<td>Biolegend 406618</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Goat anti-mouse IgG2a CF568</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Sigma Aldrich SAB4600315</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-mouse DyLight 755</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen SA5-10171</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-rabbit DyLight 755</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen SA5-10043</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SDS</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SDS001,500</td>
			<td>CAUTION, oral skin and eye toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shandon multi-program robotic slide stainer</td>
			<td>LabX</td>
			<td align="right">11384903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shandon Xylene Substitute,</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CA89413-336</td>
			<td>CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shaking water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SlowFade Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td align="right">1545801</td>
			<td>CAUTION, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stripping Buffer: mix 20 ml 10% w/v SDS with 12.5 ml 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), and 67.5 ml ultra-pure water. Under a fume hood, add 800 uL of 2-mercapto ethanol (114,4 mM final concentration)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-HCl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VIS Software</td>
			<td>Visiopharm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Whole slide scanner Olympus BX61VS</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Microscope: Olympus Slide Scanner BX61VS, 5 slides scanner, motorized stage, autofocus. Camera: Lightsource: Xcite-120. Filters: BrightLine&#174; Sedat filter set (# LED-DA/FI/TR/Cy5-4X4M-B-000, Semrock)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736-4L</td>
			<td>CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylene : Ethanol solution (1:1 v/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>CAUTION, harmful by ingestion, inhalation, fatal if sking absortion. Eye irritation. Use fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization, quantification, and mapping of immune cell populations in the tumor microenvironment

Immunlandskapet i tumörmikromiljön (TME) är en avgörande faktor för cancerprogression och svar på terapi. Specifikt har densiteten och placeringen av immunceller i TME viktiga diagnostiska och prognostiska värden. Multiomic profilering av TME har exponentiellt ökat vår förståelse av de många cellulära och molekylära nätverk som reglerar tumör initiering och progression. Dessa tekniker ger dock inte information om den rumsliga organisationen av celler eller cellcellinteraktioner. Prisvärd, tillgänglig och lätt att utföra multiplexeringstekniker som tillåter rumslig upplösning av immunceller i vävnadssektioner behövs för att komplettera encellbaserade teknik med hög genomströmning. Här beskriver vi en strategi som integrerar seriell avbildning, sekventiell märkning och bildjustering för att generera virtuella multiparameterbilder av hela vävnadssektioner. Virtuella bilder analyseras därefter på ett automatiserat sätt med hjälp av användardefinierade protokoll som möjliggör identifiering, kvantifiering och mappning av cellpopulationer av intresse. Bildanalysen görs, i detta fall med hjälp av analysmodulerna Tissuealign, Author och HISTOmap. Vi presenterar ett exempel där vi tillämpat denna strategi framgångsrikt på ett kliniskt prov, maximera den information som kan erhållas från begränsade vävnadsprover och ge en opartisk bild av TME i hela vävnaden avsnitt.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment at JoVE.com

Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment

Här beskriver vi en enkel och tillgänglig strategi för visualisering, kvantifiering och kartläggning av immunceller i formalin-fast paraffin-inbäddade tumör vävnad sektioner. Denna metod kombinerar befintliga bild- och digitalanalystekniker i syfte att utöka multiplexeringskapaciteten och multiparameteranalysen av bildanalyser.

Visualisering, kvantifiering och kartläggning av immuncellpopulationer i tumörmikromiljön

The immune landscape of the tumor microenvironment (TME) is a determining factor in cancer progression and response to therapy. Specifically, the density ...

Den rumsliga organisationen av immuncellerna i tumörmikromiljö har kliniskt värde. Denna strategi kan lätt användas för visualisering, kvantifiera, och kartläggning immunceller inom tumörvävnad. Immunterapi har revolutionerat cancerbehandling.Alla patienter svarar dock inte bra. Denna strategi kan tjäna till att definiera vävnad-immun signaturer som kan förutsäga en bra anti-tumör svar. Innan du utför ett experiment, testa antikroppskombinationer och strippning tekniker på kontroll vävnader och kontrollera att APPs är korrekta i deras upptäckt av markörer av intresse.Som skriftliga beskrivningar av bildanalysmetoder använder sofistikerade tekniska språk, kombinera text med video underlättar en bättre förståelse och replikering av metodiken. För antigen hämtning av formalin-fast, paraffin-inbäddade tumörvävnad sektioner, fördjupa dewaxed vävnadsprovet i en Coplin burk av antigen hämtning lösning och placera burken i en elektrisk tryckkokare som innehåller kranvatten. Vattennivån bör inte överstiga hälften av höjden på burken så att vattnet inte blandas med antigenhämtningslösningen.Stäng locket och tryckventilen på spisen och behandla objektglasen med högt tryck i 10 minuter. I slutet av behandlingen, dra ur stickproppen, släpp trycket, och öppna locket. När bilderna har svalnat i spisen i 30 minuter, tvätta proverna två gånger i fem minuter i färska PBS per tvätt i en ny Coplin burk, sedan använda en hydrofoba penna för att dra en barriär runt varje vävnad avsnitt.Sänk därefter ned bilderna i 0,1-molar glycin i PBS i 15 minuter i rumstemperatur innan du sköljer av objektglasen två gånger i PBS som visats. Efter den andra tvätten överför du objektglasen till en fuktighetskammare och täcker varje vävnadssektion med blockerande lösning. Efter 30 minuter vid rumstemperatur, skölj sektionerna två gånger i fem minuter i färsk PBS-Tween per tvätt sedan lägga till de primära antikroppar av intresse, utspädd i blockerande lösning, till varje objektglas, skyddas från ljus.Vid slutet av inkubationen sköljer du objektglasen tre gånger i färsk PBS-Tween i fem minuter per tvätt, och märk sedan sektionerna med lämpliga sekundära antikroppar under en timme i rumstemperatur. Vid slutet av inkubationen sköljer du objektglasen tre gånger i färsk PBS-Tween i fem minuter per tvätt. Följ upp med en enda sköljning i dubbeldestillerat vatten.Ta bort överskottet av vatten från varje glid och montera vävnaderna med monteringsmedium kompletterat med DAPI och en täcksglas. Efter att ha klämt ut överskottet monteringsmediet, låt bilderna torka i 20 minuter i rumstemperatur, skyddad från ljus, innan du skaffar bilder för alla kanaler med hjälp av en hel-slide scanner. Efter skanning, öppna bilderna i bildanalysprogramvaran och klicka på fliken Tissuealign.Om du vill importera bilderna som ska justeras till bildfältet väljer du den första bilden som ska justeras från databasen. När alla bilderna har lästs in klickar du på Nästa i stegen Arbetsflöde för att länka bilderna och dra och släppa alla bilder som ska justeras till den första bilden. När alla bilderna har länkats på lämpligt sätt, använd minst tre stift per bild som anger homologa vävnadsfunktioner i de länkade bilderna.Använd en pin för att spåra den första bilden för att kontrollera kvaliteten på den resulterande justeringen. Om en tillfredsställande justering har erhållits klickar du på Nästa för att visa bildlagren och spara den sammansatta bilden i databasen. Om du vill utföra en vävnadsdetektering med det användardefinierade protokollet APP 1 öppnar du fliken Bildanalys och öppnar den sammansatta bilden i bildanalysmodulen.Klicka på ikonen Öppna APP och markera lämplig APP. Bekräfta att APP fungerar genom att navigera till en vald vävnadsplats och klicka på Förhandsgranska. Om resultaten är tillfredsställande klickar du på för att bearbeta bilden med hjälp av den valda APPEN.Under bearbetningen APP kommer att avgöra om pixel är associerad med vävnaden för att möjliggöra omvandling av alla vävnad-associerade pixlar till en region av intresse. Den nyskapade intresseregionen kan sedan överföras till någon av de justerade bilderna. I slutet av analysen klickar du på Arkiv och Spara för att spara den ändrade bilden med den nyskapade intresseregionen.För segmentering av vävnaden till stroma och parenkyma öppnar du fliken Bildanalys och väljer de filer som är av intresse från databasen. Öppna APP 2, APP 2 använder den PSR-färgade bilden för vävnadssegmentering. Förhandsgranska APP 2 genom att bearbeta bilden i ett valt synfält.Om resultaten är tillfredsställande klickar du på Kör för att bearbeta APP 2 på den fullständiga bilden. Regionen av intresse av vävnaden kommer att segmenteras i stroma och parenkym och deras respektive områden bestäms. De nyskapade områden av intresse för stroma och parenkym kan överföras till de justerade bilderna, sedan exportera och spara den ändrade bilden som visas.Om du vill identifiera och kvantifiera cellpopulationer av intresse importerar du den segmenterade bilden av intresse till modulen för bildanalys. Efter justering av färgen, öppna APP 3. APP 3 kommer att upptäcka cellpopulationer av intresse och kvantifiera dem inom parenkymet och stroma.Om resultaten är tillfredsställande, kör APP 3 på den fullständiga bilden. Alla enskilda celler av intresse kommer att märkas, deras vävnadskoordinater lagras, och tätheterna av cellerna av intresse i stroma och parenkymala regioner bestäms. Den ändrade bilden kan sedan sparas på det sätt som visas.Om du vill utföra mjukpappersuppvärmning av de objekt med beteckningen cell-of-interest öppnar du lämpligt användardefinierat protokoll i APP-markeringsfönstret och klickar på Kör för att uppmana APP att använda koordinaterna för de antikroppsmärkta objekten för att generera värmekartan. Hot spot-områden, markerade med rött, innehåller den högsta tätheten av cellpopulationen av intresse medan de mörkblå områdena har den lägsta. Värmekartan över en specifik cellpopulation kan läggas ovanpå de justerade bilderna för att ge ytterligare information om hur dessa celler är organiserade inom tumörmikroomkroppen.Sedan exportera och spara vävnad värme kartan. Det är viktigt att kontrollera märkningens specificitet, riktigheten hos de utformade APP:erna och den avskalade och reprobing effektiviteten hos de olika fläckarna på samma avsnitt. Genom att integrera seriell avbildning, sekventiell märkning och vävnadsjustering kan fler markörer visualiseras samtidigt och mer information kan extraheras från begränsade kliniska exemplar.H&E färgning av resected tumör vävnad sektioner möjliggör utvärdering av vävnadsarkitektur, cell morfologi och kliniskt relevanta parametrar såsom typ av malignitet, tumör grade och övergripande immun infiltration. CD34 färgning gör det möjligt att upptäcka endotelceller. Cytokeratin 8/18 färgning avslöjar förekomsten av epitelceller, och anti-alfa glatta muskel aktin färgning gör det möjligt att identifiera fibrogenic, aktiveras, lever stellate celler.Reprobing med antikroppar mot CD68 och Desmin möjliggör detektering av makrofager respektive myofibroblasts. För att bättre karakterisera tumör-immun infiltrate, kan färgning för T-cell markörer och myeloperoxidas utföras. Picro Sirius Red färgning kan också utföras för att visualisera fibrillar kollagen och för att underlätta stroma och parenchyma segmentering.Vävnad-associerade pixlar inom de färgade sektionerna kan identifieras för att möjliggöra segmentering av olika fack inom en specifik region av intresse. Cellpopulationerna av intresse kan sedan identifieras inom varje region, vilket gör det möjligt att skapa vävnadskartor för vilka regioner med hög densitet för en viss cellpopulation visas som hotspots och regioner med relativt låg densitet visas som kalla fläckar. Denna metod för att identifiera, kvantifiera och kartlägga immunceller i vävnadsprover kan anpassas till och valideras för en specifik forskningsfrågor och markör för intresse.Denna strategi kan tillämpas på vävnadsmikromatriser för analys med högt genomflöde. Det kan också kombineras med in situ hybridisering att samtidigt undersöka in situ protein och genuttryck. Vi har använt denna strategi för att identifiera och kartlägga IL-17A-producerande celler in situ i fibrotisk levervävnad från patienter.Som anges i protokollet är flera reagenser kemiskt farliga och de relevanta förfarandena bör utföras i en kemisk huva med hjälp av lämplig personlig skyddsutrustning och lämpliga försiktighetsåtgärder.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Sju steg till stellate celler

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging av Mouse Thymus med 2-Photon Mikroskopi

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Kvantifiering av Respirator Burst Response som en indikator för Innate Immune Health i Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

En CFSE-baserad analys för att studera migration av dendritiska Murin hudceller i dränerande lymfkörtlar under infektion med<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacille Calmette-Guerin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Molekylär diffusion i plasmamembran primära lymfocyter Mätt genom fluorescenskorrelationsspektroskopi

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Icke-invasiv provtagning av slemhinna slemhinnan vätska för kvantifiering av In Vivo övre luftvägarna immun-medlare nivåer

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Kvantifiering av Efferocytosis av Single-cell fluorescensmikroskopi

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

En Immunohistopathologic studie att profilera den folat Receptor Beta makrofag och vaskulär immun närmiljön i jätte Cell arterit

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Flöde Cytometric Analys av lymfocyt infiltration i centrala nervsystemet under experimentell autoimmun encefalomyelit

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...