Name: visualization, quantification, and mapping of immune cell populations in the tumor microenvironment
Uploaded: 2020-03-25T14:00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment at JoVE.com

Çalışma katılımcısı teşekkür ederiz. Biz Louise Rousseau, doku örnekleri ve ilgili tüm klinik bilgilerin kurtarma için HBP biyobank koordinatörü teşekkür ederiz. Mükemmel teknik yardım için CRCHUM'daki moleküler patoloji ve hücre görüntüleme çekirdek tesislerini ve Visiopharm'dan Michael Persch'i kabul ediyoruz. Finansman: Bu çalışma Kanada Karaciğer Vakfı, Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS) AIDS ve Bulaşıcı Hastalıklar Ağı (Réseau SIDA-MI) ve Hepatit C Kanada Ağı (CanHepC) tarafından desteklenmiştir. CanHepC, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) (NHC-142832) ve Kanada Halk Sağlığı Ajansı'nın ortak girişimi yle finanse edilmektedir. M.F.M., Université de Montréal, Bourse Gabriel Marquis ve FRQS'den burs aldı. T.F., CIHR ve CanHepC'ten doktora bursu aldı. S.T. hepatobiliary ve pankreas onkolojik cerrahi Roger-Des-Groseillers Başkanı tutar, Université de Montréal.
Yazar katkıları: M.F.M. tasarlanmış, deneyler yapmış ve verileri analiz edilmiştir. T.F. deneyler tasarladı. A.C-B. teknik rehberlik sağladı. G.S. çalışma konusunun tüm patolojik değerlendirmesini yapmış ve tüm patolojik yönleri hakkında bilgi verilmiştir. L.M. H&E boyama, optimize etme ve görüntü edinimi gerçekleştirdi. M.N.A. PSR lekesini uyguladı ve değerli teknik girdi sağladı. N.B. görüntü analizine katkıda bulundu. S.T. HBP biyobank'ın baş araştırmacısıdır ve biyobankın genel işleyişini denetlemekten sorumludur. Ayrıca projenin tüm yönleri ve klinik etkileri hakkında paha biçilmez bir girdi sağladı. M.F.M, T.F., ve N.H.S. çalışmayı kavramsallaştırdı ve tasarladı. N.H.S. işi denetledi ve fon elde etti. Taslağı M.F.M., T.F., A.C-B. ve N.H.S. yazdı. Tüm yazarlar el yazını gözden geçirdi ve onayladı.

<ol>
	<li>Greten, F. R., Grivennikov, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+Cancer:Triggers,+Mechanisms,+and+Consequences.">Inflammation and Cancer:Triggers, Mechanisms, and Consequences.</a> Immunity. 51 (1), 27-41 (2019).</li><li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+validation+of+the+consensus+Immunoscore+for+the+classification+of+colon+cancer:+a+prognostic+and+accuracy+study.">International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study.</a> Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).</li><li>Binnewies, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+tumor+immune+microenvironment+(TIME)+for+effective+therapy.">Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy.</a> Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).</li><li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+the+tumor+immune+microenvironment+for+staging+and+therapeutics.">Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics.</a> Modern Pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 31 (2), 214-234 (2018).</li><li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+dynamics+of+intratumoral+immune+cells+reveal+the+immune+landscape+in+human+cancer.">Spatiotemporal dynamics of intratumoral immune cells reveal the immune landscape in human cancer.</a> Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).</li><li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+introduction+of+the+'Immunoscore'+in+the+classification+of+malignant+tumours.">Towards the introduction of the 'Immunoscore' in the classification of malignant tumours.</a> The Journal of Pathology. 232 (2), 199-209 (2014).</li><li>Finotello, F., Eduati, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Omics+Profiling+of+the+Tumor+Microenvironment:+Paving+the+Way+to+Precision+Immuno-Oncology.">Multi-Omics Profiling of the Tumor Microenvironment: Paving the Way to Precision Immuno-Oncology.</a> Frontiers in Oncology. 8, 430 (2018).</li><li>Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histo-cytometry:+a+method+for+highly+multiplex+quantitative+tissue+imaging+analysis+applied+to+dendritic+cell+subset+microanatomy+in+lymph+nodes.">Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes.</a> Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).</li><li>Giesen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+imaging+of+tumor+tissues+with+subcellular+resolution+by+mass+cytometry.">Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry.</a> Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).</li><li>Porta Siegel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry+Imaging+and+Integration+with+Other+Imaging+Modalities+for+Greater+Molecular+Understanding+of+Biological+Tissues.">Mass Spectrometry Imaging and Integration with Other Imaging Modalities for Greater Molecular Understanding of Biological Tissues.</a> Molecular Imaging and Biology : MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 20 (6), 888-901 (2018).</li><li>Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry+Imaging:+A+Review+of+Emerging+Advancements+and+Future+Insights.">Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights.</a> Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).</li><li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype.">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).</li><li>Gendusa, R., Scalia, C. R., Buscone, S., Cattoretti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elution+of+High-affinity+(&gt;10-9+KD)+Antibodies+from+Tissue+Sections:+Clues+to+the+Molecular+Mechanism+and+Use+in+Sequential+Immunostaining.">Elution of High-affinity (&gt;10-9 KD) Antibodies from Tissue Sections: Clues to the Molecular Mechanism and Use in Sequential Immunostaining.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (7), 519-531 (2014).</li><li>van der Loos, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunoenzyme+staining:+methods+and+visualizations+for+the+observation+with+spectral+imaging.">Multiple immunoenzyme staining: methods and visualizations for the observation with spectral imaging.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 313-328 (2008).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labeling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labeling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).</li><li>Segnani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+Detection+of+Collagen+Fibers+by+Sirius+Red/Fast+Green+Is+More+Sensitive+than+van+Gieson+or+Sirius+Red+Alone+in+Normal+and+Inflamed+Rat+Colon.">Histochemical Detection of Collagen Fibers by Sirius Red/Fast Green Is More Sensitive than van Gieson or Sirius Red Alone in Normal and Inflamed Rat Colon.</a> PloS One. 10 (12), 0144630 (2015).</li><li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Staining+by+Sequential+Immunostaining+and+Antibody+Removal+on+Routine+Tissue+Sections.">Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması beyan etmezler.

Basit, erişilebilir ve doku bölümlerinde bağışıklık hücrelerinin mekansal çözünürlüğü sağlayan çoklama teknikleri yürütmek kolay kanser ve diğer immünolojik bozukluklar bağışıklık manzara harita için gereklidir. Burada, görüntüleme tahlilleri12,13,,17,19çoklama yeteneği ve çok boyutlu değerlendirme genişletmek için yaygın olarak kullanılabilir etiketleme ve dijital analiz teknikleri entegre bir strateji açıklar. Farklı belirteçler için üç seri bölümün boyanması ve bölümlerin sıyırma ve reprobing teknikleri ile yeniden kullanılması, H&E ve PSR lekelerine ek olarak 11 parametreyi görselleştirmemizi sağladı. Bu bölümlerden altı görüntü doku hizalama modülü kullanılarak otomatik bir şekilde hizalandı. Hizalama, aynı bölümden gelen görüntüler için tek tek hücre düzeyinde hassas ve komşu bölümlerden kaynaklanan görüntüler için son derece uyumluydu. Sanal çoklama, bir bölümde görselleştirilen işaretçilerin bitişik başka bir bölümde görselleştirilen işaretçilerle mekansal olarak nasıl ilişkili olduğunu belirlememizi sağladı. Bazı lekeler COI etiketli iken, diğerleri bize farklı TCs COI ölçmek için izin TCs etiketli. COI'lerin otomatik olarak ölçülmesi için yazılım araçlarının kullanılması büyük ölçüde basitleştirilmiş ve görüntülerin işlenmesini hızlandırmış. Ayrıca, seçilen görüş alanları yerine tüm doku bölümlerine dijital analiz uygulanarak TME'nin tarafsız bir temsili elde edilmiştir. Ayrıca, COI doku koordinatları kayıtlı olduğundan, doku ısı haritaları oluşturmak mümkün oldu.
Bu protokolde sorun giderme gerekebileceği birkaç alan vardır. İlk olarak, kötü antijen alma mIF kalitesini etkileyebilir, bu nedenle antijen alma tampon ve süre türü kullanılan özel araştırma / biyomarker koşulları için optimize edilmelidir. İkinci olarak, kullanılan bloklama çözeltisinin türü primer ve sekonder antikordoku/antijen/türe uyarlanmalıdır. Elimizde, doku bloke Fc reseptörlerinden gelen türlerden% 10 toplam serum eklenmesi, ve böylece nonspesifik antikor bağlanması azaltılmış. Serumun %10'unun ikincil antikorların yetiştirildiği türlerden eklenmesi, sekonder antikorların doku bölümüne doğrudan nonspesifik olmayan bağlanmasını en aza indirir. Üçüncü olarak, uygun pozitif ve negatif kontroller kullanılarak primer ve sekonder antikorların özgüllüğünün doğrulanması esastır. Dördüncü olarak, bazı kanallarda artmış otofloresans ve primer antikor sıyırma üzerine DAPI difüzyonu da yaygındır. Gelişmiş otofloresansa değinmek için, spesifik sinyalin arka plandakinin en az 5 kat yoğunluk değerlerine sahip olduğu birincil/ikincil antikor çiftleri kullandık. Son olarak, bazı yüksek yakınlık antikorları düzenli sıyırma prosedürleri ile eluted olamaz. Bu durumda, etiketlemenin son turunda bu tür antikorların kullanılmasını öneririz. Kullanıcı ilgi antikorları için en uygun yapılandırmayı bulmak için farklı boyama dizileri denemek zorunda kalabilirsiniz. İkinci veya üçüncü kez etiketleme işlemine geçmeden önce sıyırma nın etkinliği teyit edilmelidir.
Bu stratejinin temel sınırlama ve sorun ilgi belirteçleri için primer ve ikincil floresan antikorların doğru kombinasyonları bulmaktır. Farklı türlerde veya aynı anda kullanılabilen farklı izotiplerle yetiştirilen birincil antikorların bulunması, ticari olarak mevcut olanlarla sınırlıdır. Tüm slayt tarayıcılarının çoğu, en fazla beş kanalgörüntülemeye izin veren lambalar ve filtrelerle donatılmıştır ve doğru türlerde ve sağ floroforlarda ikincil antikorlar her zaman mevcut değildir. Seri boyamalar ve sıralı etiketleme kullanarak bu sınırlamaları kısmen aştık. İlgi işaretleri için en iyi kombinasyona ulaşmak için çeşitli antikor kombinasyonlarının test edilmesi gerekebilir. Sıyırma ve reprobing her zaman çekirdek segmentasyon gerçekleştirmeye izin olmayabilir, çünkü başka bir sınırlama DAPI boyama kalitesidir.
Doku hizalama modülü en az eğitim ve kullanıcılardan hiçbir programlama becerileri gerektirir. Yazılım teorik olarak görüntülerin sınırsız sayıda hizalanmasına olanak sağlar. Ancak, kesin hizalama, daha histolojik olarak uyumlu olan yakın bölümlerin daha doğru bir şekilde hizalandığı bölümlerin ilgililiğine bağlıdır. APP'leri oluşturmak için VIS'in Yazar modüllerini kullandık. AAP'ler oluşturmak için temel görüntü analizi bilgisi gereklidir, ancak bu durum diğer görüntü analizi yazılımlarını kullanırken de aynı şekilde geçerlidir. VIS'in diğer görüntü analiz yazılımlarına kıyasla benzersiz avantajları arasında farklı yöntemlerkullanılarak hazırlanan bölümlerden görüntülerin otomatik olarak hizalanması yer almaktadır (örneğin, IF, histochemistry, IHC). Bu sanal çoklama kullanarak ilgi birden fazla belirteçleri colocalization çalışmaları sağlar. Ayrıca, APP'lerin esnek ve kullanıcı dostu tasarımı kullanıcıya özel özelleştirmeye olanak tanır. Otomatik niceleme ve haritalama ve tüm doku bölümleriişleme olasılığı, zaman kazandırır ve görsel muayene ile manuel sayma ile karşılaştırıldığında önyargı azaltır.
Bu strateji kanser ve otoimmünite bağlamında doku immünolojisi için çok yararlı bir araştırma aracıdır ancak klinik kullanım için doğrulanmamış kalır. Ek standardizasyon ve doğrulama ile, gelecekte birden fazla uygulama için kullanılabilir (örneğin, tahmin etmek ve immünoterapötik ajanlara yanıtı izlemek için kanser bağışıklık manzara harita). Patolojik değerlendirmeile prognostik biyobelirteçleri birleştirmek için farklı inflamatuar durumlara (örn. inflamatuar barsak hastalığı) da adapte edilebilir.
Bu protokoldeki temel kritik adımlar, etiketlemenin verimliliği/özgüllüğü ve amaçlanan kullanım veya biyomarker için tasarlanmış AA'ların sağlamlığıdır. Bu nedenle, görsel denetim tarafından düzenli doğrulama, özellikle yeni bir APP tasarımı üzerine, esastır. Aynı bölümde birden fazla sıyırma ve reprobing veya lekelerin farklı türde verimli kullanımı kritik bileşenleri ve doku veya bölüm özgü olabilir. Büyük toplu iş çözümlemesi ile devam etmeden önce bu tür süreçlerin verimliliğini doğrulamak çok önemlidir.
Özetle, değerli klinik doku örneklerinden elde edilebilen nicel ve mekansal bilgileri en üst düzeye çıkaran bir strateji sayılmaktayız. Bu metodolojiyi uygulamak için gereken kaynaklara, ekipmanlara ve bilgilere çok erişilebilir. Bu metodolojiyi, TME'deki bağışıklık hücre popülasyonlarını tanımlamayı, ölçmeyi ve haritalamayı amaçlayan tahlillerin planlanmasında yararlı bir kılavuz olarak öneriyoruz.

Kanser gelişimi malign hücreler ve TME arasındaki karşılıklı etkileşimleri içeren çok aşamalı bir sürecin sonucudur. Tümör hücreleri dışında, TME nonmalign hücreler, stromal hücreler, bağışıklık hücre popülasyonları ve ekstrasellüler matriks (ECM)1oluşur. Tümör dokusunun farklı hücresel ve yapısal bileşenlerinin mekansal organizasyon ve kanser ve komşu kanser dışı hücreler arasındaki dinamik değişim sonuçta tümör ilerlemesi ve tedaviye yanıt modüle2,3,4. Bu kanserde bağışıklık yanıtı spatiotemporal düzenlenmiş olduğu gösterilmiştir5,6. Neoplastik lezyona ve komşu dokuya sızan farklı immün hücre popülasyonları, farklı fonksiyonlarla ilişkili farklı mekansal dağılım şekilleri ve farklı aktivasyon ve farklılaşma durumları sergilerler (örn. pro-karşı antitümör). Bu farklı immün popülasyonlar ve parametreleri tümör ve stromal kompartmanlar ile fazla mesai birlikte.
Tek hücreli multiomik profilleme sağlayan teknolojilerin ortaya çıkması, karsinogenezi ve tümör ilerlemesini düzenleyen çok sayıda hücresel ve moleküler ağ hakkındaki anlayışımızı katlanarak artırmıştır. Ancak, en tek hücre tabanlı yüksek iş gücü analitik araçlar doku bozulması ve tek hücre izolasyonu gerektirir, hücrelerin mekansal organizasyonu ve hücre hücre etkileşimleri hakkında bilgi kaybına neden7. TME'deki spesifik bağışıklık hücrelerinin yeri ve düzenlenmesi tanısal ve prognostik değere sahip olduğundan, mekansal çözünürlüğe olanak tanıyan teknolojiler tek hücre tabanlı immün profilleme tekniklerinin önemli bir tamamlayıcısıdır.
Geleneksel olarak, immünohistokimya (IHC) ve multipleks immünoresans (mIF) gibi görüntüleme teknikleri aynı anda görselleştirilebilen az sayıda biyobelirteçle sınırlandırılmıştır. Bu sınırlama genellikle birkaç henotik belirteçleri ile tanımlanan tümör-infiltrasyon bağışıklık hücrelerinin spatiotemporal dinamikleri çalışma engellemiştir. Görüntüleme ve analitik araçlardaki son gelişmeler çoklama olanaklarını genişletmiştir. Histo-sitometri ve görüntüleme kitle sitometrisi gibi yeni antikor bazlı etiketleme teknolojileri mekansal olarak 12 ve 32 biyobelirteçleri, sırasıyla8,9kadar ayırmak için kullanılmıştır. Kütle spektrometresi görüntüleme, etiketleme gerektirmeyen bir teknik, tek bir doku bölümünde aynı anda biyobelirteçleri binlerce görüntü potansiyeline sahiptir10,11. Bu teknikler zaten kanser doku bağışıklık manzara diseksiyon için büyük bir potansiyel göstermiştir rağmen, onlar son derece sofistike ve pahalı ekipman ve yazılım kullanmak ve kolayca araştırmacıların çoğunluğu için erişilebilir değildir.
Alternatif olarak, geleneksel IHC ve mIF çoklama yeteneği seri görüntüleme, etiketleme sıralı tur lar ve spektral görüntüleme7,12,13,14,,15,16kullanımı ile genişletilmiştir. Bu teknikler, görüntü analizi yazılımı kullanılarak sanal multiparametre slaytlar halinde birleştirilmiş olabilir aynı veya seri doku bölümlerinden birden fazla görüntü oluşturur. Sonuç olarak, aynı anda görselleştirilebilen ve analiz edilebilen işaretleyicilerin sayısı artar.
Burada, ticari olarak sunulan reaktifler, uygun fiyatlı mikroskopi ekipmanları ve kullanıcı dostu yazılımlar kullanarak doku çokkatlı tahlillerinin rasyonel tasarımı için bir strateji öneriyoruz(Şekil 1). Bu metodoloji seri görüntüleme, sıralı multipleks etiketleme, tüm doku görüntüleme ve doku hizalama otomatik kantitatifikasyon ve doku bölümlerinde bağışıklık hücrelerinin haritalanması için kullanılabilecek sanal multiparametre slaytlar oluşturmak için entegre. Bu stratejiyi kullanarak, 11 biyobelirteç ve iki sık kullanılan histolojik lekelerden oluşan bir sanal slayt oluşturduk: hematoksilin ve eozin (H&E) ve picrosirius kırmızısı (PSR). Farklı doku bölmelerinde birden fazla immün hücre popülasyonu tespit edildi, tespit edildi ve ölçüldü ve bunların mekansal dağılımı doku ısı haritaları kullanılarak çözüldü. Bu strateji, sınırlı klinik örneklerden elde edilebilen bilgileri en üst düzeye çıkarır ve tüm doku, çekirdek iğne biyopsileri ve doku mikrodizileri de dahil olmak üzere formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) arşivlenmiş doku örnekleri için geçerlidir. Bu metodolojiyi, TME'deki bağışıklık hücre popülasyonlarının tanımlanması, ölçülmesi ve haritalanması için özel tahliller tasarlamak için yararlı bir kılavuz olarak öneriyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1419px;" width="1418">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:649px;">Antigen Retrieval Solution: Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% v/v Tween 20, pH 6.0)</td>
			<td style="width:257px;"></td>
			<td style="width:256px;"></td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blocking Solution: 1 % BSA, 10 % filtered human serum, 10 % filtered donkey serum, 0.1 % Tween 20, and 0.3% Triton in PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>800-095-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coplin jars (EASYDIP SLIDE STAINING SYSTEM)</td>
			<td>Newcomersupply</td>
			<td>5300KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545E 22*50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Direct Red 80</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td align="right">365548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol 100%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electric pressure cooker</td>
			<td>Salton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eosin</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td align="right">3801600</td>
			<td>CAUTION, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td>CAUTION, harmful by inhalation, ingestion and skin absortion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FFPE section (4&#956;m) slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycine 0,1 M in PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hematoxylin Stain Solution, Gil 1. Formulation, Regular Strength</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3535-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Holder (EasyDip Staining Jar Holder)</td>
			<td>Newcomersupply</td>
			<td>5300RK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Serum</td>
			<td>Gemini</td>
			<td align="right">22210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Humidity chamber</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z670138-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pap pen</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab2601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS-Tween 20 (0.1% v/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Permount Mounting Media</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Picric Acid 1.3 %</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6744</td>
			<td>CAUTION, skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Picro-Sirius Red/Fast Green solution: Fast Green 0.1 % w/v + Sirius Red 0.2 % w/v in 1,3 % picric acid solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-&#945;SMA</td>
			<td>Mouse IgG2a 1A4</td>
			<td>Sigma A2547</td>
			<td>Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD34</td>
			<td>Mouse IgG1 HPCA1/763</td>
			<td>Novus Biologicals NBP2-44568</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-Cytokeratin 8/18</td>
			<td>Rabbit EP17/EP30</td>
			<td>Agilent IR09461-2</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD68</td>
			<td>Mouse KP1</td>
			<td>Abcam ab955</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-Desmin</td>
			<td>Rabbit Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen PA5-16705</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD4</td>
			<td>Mouse N1UG0</td>
			<td>Affymetrix 14-2444</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-FoxP3</td>
			<td>Rabbit 1054C</td>
			<td>R &#38; D MAB8214</td>
			<td>Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-MPO</td>
			<td>Goat Polyclonal</td>
			<td>R &#38; D Systems AF3667</td>
			<td>Dilution 1/250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD3</td>
			<td>Rabbit SP7</td>
			<td>Abcam ab16669</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Anti-CD8</td>
			<td>Mouse C8/144B</td>
			<td>Invitrogen 14-0085-80</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-mouse A488</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-21202</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-Rabbit A488</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-21206</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-goat A568</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-11057</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-rabbit A647</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen A-31573</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Rat anti-mouse IgG1 A647</td>
			<td>RMG1-1</td>
			<td>Biolegend 406618</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Goat anti-mouse IgG2a CF568</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Sigma Aldrich SAB4600315</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-mouse DyLight 755</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen SA5-10171</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Donkey anti-rabbit DyLight 755</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Invitrogen SA5-10043</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SDS</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SDS001,500</td>
			<td>CAUTION, oral skin and eye toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shandon multi-program robotic slide stainer</td>
			<td>LabX</td>
			<td align="right">11384903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shandon Xylene Substitute,</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CA89413-336</td>
			<td>CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shaking water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SlowFade Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td align="right">1545801</td>
			<td>CAUTION, eye irritation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stripping Buffer: mix 20 ml 10% w/v SDS with 12.5 ml 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), and 67.5 ml ultra-pure water. Under a fume hood, add 800 uL of 2-mercapto ethanol (114,4 mM final concentration)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-HCl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VIS Software</td>
			<td>Visiopharm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Whole slide scanner Olympus BX61VS</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Microscope: Olympus Slide Scanner BX61VS, 5 slides scanner, motorized stage, autofocus. Camera: Lightsource: Xcite-120. Filters: BrightLine&#174; Sedat filter set (# LED-DA/FI/TR/Cy5-4X4M-B-000, Semrock)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>214736-4L</td>
			<td>CAUTION, Flammable, skin and eye irritation, Harmful when inhaled</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylene : Ethanol solution (1:1 v/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td>CAUTION, harmful by ingestion, inhalation, fatal if sking absortion. Eye irritation. Use fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization, quantification, and mapping of immune cell populations in the tumor microenvironment

Tümör mikroçevresinin (TME) immün ortamı kanserin ilerlemesi ve tedaviye yanıtın belirleyici bir faktördür. Özellikle, TME bağışıklık hücrelerinin yoğunluğu ve konumu önemli tanısal ve prognostik değerlere sahiptir. TME'nin multiomik profilinin çıkarılması, tümörün başlatılmasını ve ilerlemesini düzenleyen çok sayıda hücresel ve moleküler ağ hakkındaki anlayışımızı katlanarak artırmıştır. Ancak, bu teknikler hücrelerin veya hücre-hücre etkileşimlerinin uzamsal organizasyonu hakkında bilgi sağlamaz. Tek hücre tabanlı yüksek iş çıkışlı teknolojileri tamamlamak için doku bölümlerinde ki bağışıklık hücrelerinin mekansal çözünürlüğünü sağlayan uygun fiyatlı, erişilebilir ve kolay çokluk lama teknikleri ne zaman kullanılır. Burada, tüm doku bölümlerinin sanal multiparametre slaytları oluşturmak için seri görüntüleme, sıralı etiketleme ve görüntü hizalama entegre bir strateji açıklar. Sanal slaytlar daha sonra, şüpheli hücre popülasyonlarının tanımlanmasını, ölçülmesini ve eşleştirilmesini sağlayan kullanıcı tanımlı protokoller kullanılarak otomatik olarak analiz edilir. Görüntü analizi, bu durumda analiz modülleri Tissuealign, Author ve HISTOmap kullanılarak yapılır. Bu stratejiyi tek bir klinik örneğe başarıyla uyguladığımız, sınırlı doku örneklerinden elde edilebilen bilgileri en üst düzeye çıkararak tüm doku bölümünde TME'nin tarafsız bir görünümünü sağladığımız bir örnek sayılmaktayız.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment at JoVE.com

Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment

Burada, formalin-sabit parafin gömülü tümör doku bölümlerinde bağışıklık hücrelerini görselleştirmek, ölçmek ve haritalamak için basit ve erişilebilir bir strateji tanımlıyoruz. Bu metodoloji, mevcut görüntüleme ve dijital analiz tekniklerini görüntüleme testlerinin çoklama yeteneğini ve multiparametre analizini genişletmek amacıyla birleştirir.

Tümör Mikroortamında Bağışıklık Hücre Popülasyonlarının Görselleştirilmesi, Ölçülmesi ve Haritalanması

The immune landscape of the tumor microenvironment (TME) is a determining factor in cancer progression and response to therapy. Specifically, the density ...

Tümör mikroortamında bağışıklık hücrelerinin mekansal organizasyonu klinik değeri vardır. Bu strateji kolayca tümör dokusu içinde bağışıklık hücrelerinin görselleştirilmesi, niceleme ve haritalama için kullanılabilir. İmmünoterapi kanser tedavisinde devrim yarattı.Ancak, tüm hastalar iyi yanıt. Bu strateji iyi bir anti-tümör yanıtı tahmin edebilirsiniz doku-bağışıklık imzaları tanımlamak için hizmet edebilir. Bir deney yapmadan önce, kontrol dokularında antikor kombinasyonlarını ve sıyırma tekniklerini test edin ve AAP'lerin ilgi çekici işaretleri tespit etmede doğru olduğunu doğrulayın.Görüntü analizi yöntemlerinin yazılı açıklamaları gelişmiş teknik dil kullandığından, metnin videoyla birleştirilmesi metodolojinin daha iyi anlaşılmasını ve çoğaltılmasını kolaylaştırır. Formalin-sabit antijen alımı için, parafin gömülü tümör doku bölümleri, antijen alma çözeltisi coplin kavanozuna dewaxed doku örneği batırın ve musluk suyu içeren bir elektrik düdüklü tencere içine kavanoz yerleştirin. Su, antijen alma çözeltisi ile karışmaması için kavanozun yüksekliğinin yarısını geçmemelidir.Tencerenin kapağını ve basınç vanasını kapatın ve slaytları 10 dakika yüksek basınçla tedavi edin. Tedavinin sonunda, ocağın fişini çekin, basıncı bırakın ve kapağı açın. Slaytlar ocakta 30 dakika soğuduktan sonra, örnekleri yeni bir Coplin kavanozunda yıkama başına beş dakika boyunca iki kez yıkayın, ardından her doku bölümünün etrafına bir bariyer çizmek için hidrofobik bir kalem kullanın.Daha sonra, slaytları PBS'de gösterildiği gibi iki kez durulamadan önce oda sıcaklığında 15 dakika PBS'de 0,1 molar glisin ebatırın. İkinci yıkamadan sonra, bir nem odasına slaytlar aktarın ve engelleme çözeltisi ile her doku bölümü kapağı. Oda sıcaklığında 30 dakika sonra, yıkama başına taze PBS-Tween beş dakika boyunca bölümleri iki kez durulayın sonra, her slayt, ışıktan korunan engelleme çözeltisi seyreltilmiş ilgi birincil antikorlar ekleyin.Kuluçka sonunda, taze PBS-Tween'de slaytları yıkama başına beş dakika boyunca üç kez durulayın, ardından bölümleri oda sıcaklığında bir saat boyunca uygun ikincil antikorlarla etiketleyin. Kuluçka sonunda, taze PBS-Tween üç kez yıkama başına beş dakika slaytlar durulayın. Çift distile suda tek bir durulama ile izleyin.Her slayttan fazla su çıkarın ve DAPI ve bir kapak slayt ile takviye orta montaj ile dokuları monte. Aşırı montaj ortamını sıktınktan sonra, slaytların tüm slayt tarayıcısı kullanarak tüm kanallar için görüntü elde etmeden önce ışıktan korunan oda sıcaklığında 20 dakika kurumasını bekleyin. Taramadan sonra, görüntü analizi yazılımındaki görüntüleri açın ve Tissuealign sekmesine tıklayın.Slayt tepsisine hizalanacak görüntüleri almak için veritabanından hizalanacak ilk görüntüyü seçin. Tüm görüntüler yüklendiğinde, görüntüleri bağlamak için İş Akışı adımlarında İleri'yi tıklatın ve ilk görüntüye hizalanacak tüm görüntüleri sürükleyip bırakın. Tüm görüntüler uygun şekilde bağlandığında, bağlantılı görüntülerdeki homolog doku özelliklerini gösteren görüntü başına en az üç iğne kullanın.Elde edilen hizalamanın kalitesini kontrol etmek için ilk görüntüyü izlemek için bir pin kullanın. Tatmin edici bir hizalama elde edildiyse, görüntü katmanlarını görüntülemek ve bileşik görüntüyü veritabanına kaydetmek için İleri'yi tıklatın. Kullanıcı tanımlı protokol APP 1'i kullanarak doku algılaması gerçekleştirmek için Görüntü Analizi sekmesini açın ve görüntü analizi modülündeki bileşik görüntüyü açın.APP'i Aç simgesine tıklayın ve uygun UYGULAMAYı seçin. UYGULAMAnın çalıştığını doğrulamak için seçili bir doku konumuna gidin ve Önizleme'yi tıklatın. Sonuçlar tatmin ediciyse, seçili UYGULAMAYı kullanarak görüntüyü işlemek için tıklatın.İşlem sırasında APP, pikselin dokuyla ilişkili olup olmadığını belirleyerek dokuyla ilişkili piksellerin tümünün ilgi çekici bir bölgeye dönüştürülmesine izin verir. Yeni oluşturulan ilgi alanı daha sonra hizalanmış görüntülerden herhangi biri aktarılabilir. Çözümlemenin sonunda, değiştirilmiş görüntüyü yeni oluşturulan ilgi alanıyla kaydetmek için Dosya ve Kaydet'i tıklatın.Dokuların stroma ve parankim içine segmentasyonu için Görüntü Analizi sekmesini açın ve veritabanından ilgi çekici dosyaları seçin. AP 2'yi açın, APP 2 doku segmentasyonu için PSR lekeli görüntüyü kullanır. Görüntüyü seçili bir görüş alanında işleyerek APP 2'yi önizleyin.Sonuçlar tatmin ediciyse, app 2'yi tam görüntü üzerinde işlemek için Çalıştır'ı tıklatın. Dokunun ilgi bölgesi stroma ve parankim olarak bölümlere ayrılır ve ilgili bölgeler belirlenir. Stroma ve parankim için yeni oluşturulan bölgeler hizalanmış görüntülere aktarılabilir, daha sonra değiştirilmiş görüntüyü gösterildiği gibi dışa aktarAbilir ve kaydedebilir.İlgi alan hücre popülasyonlarını belirlemek ve ölçmek için, ilginin segmentli görüntüsünü görüntü çözümleme modülüne aktarın. Rengi ayarladıktan sonra APP 3'u açın. APP 3 ilgi hücre popülasyonları tespit edecek ve parankim ve stroma içinde bunları ölçmek.Sonuçlar tatmin ediciyse, APP 3'ün tam görüntüüzerinde çalıştırın. Tüm ilgi hücreleri etiketlenecek, doku koordinatları depolanacak ve stroma ve parankimal bölgelerdeki ilgi hücrelerinin yoğunlukları belirlenecektir. Değiştirilen görüntü gösterildiği gibi kaydedilebilir.İlgi alanı etiketli nesnelerin doku ısı eşlenemesini gerçekleştirmek için, APP seçim penceresinde uygun kullanıcı tanımlı protokolü açın ve ısı haritasıoluşturmak için antikor etiketli nesnelerin koordinatlarını kullanması için APP'i çalıştırmak'ı tıklatın. Kırmızı ile vurgulanan sıcak nokta alanları, en yüksek yoğunlukta hücre nüfusunun ilgi alanını içerirken, koyu mavi alanlar en düşük alana sahiptir. Belirli bir hücre popülasyonunun ısı haritası, bu hücrelerin tümör mikroortamında nasıl organize edildiği hakkında ek bilgi sağlamak için hizalanmış görüntülerin üzerine eklenebilir.Sonra ihracat ve doku ısı haritası kaydedin. Etiketlemenin özgüllüğünü, tasarlanan APP'lerin doğruluğunu ve aynı bölümdeki farklı lekelerin sıyırma ve reprobing verimliliğini doğrulamak çok önemlidir. Seri görüntüleme, sıralı etiketleme ve doku hizalama entegre edilerek, aynı anda daha fazla belirteç görselleştirilebilir ve sınırlı klinik örneklerden daha fazla bilgi elde edilebilir.Rezeke tümör doku kesitlerinin H&E boyanması doku mimarisinin, hücre morfolojisinin ve malignite nin tipi, tümör derecesi ve genel immün infiltrasyon gibi klinik olarak ilgili parametrelerin değerlendirilmesine olanak sağlar. CD34 boyama endotel hücrelerinin saptanmasına olanak sağlar. Sitokalatin 8/18 boyama epitel hücrelerinin varlığını ortaya çıkarır, ve anti-alfa düz kas aktin boyama fibrojenik belirlenmesini sağlar, aktive, hepatik stellat hücreleri.CD68 ve Desmin'e karşı antikorlarla reprobing sırasıyla makrofajlar ve miyofibroblastların saptanması sağlar. Daha iyi tümör-immün infiltrasyon karakterize etmek için, T-hücre belirteçleri ve miyeloperoksidaz için boyama yapılabilir. Picro Sirius Kırmızı boyama da fibriller kollajen görselleştirmek ve stroma ve parankim segmentasyon kolaylaştırmak için yapılabilir.Lekeli bölümler deki doku ilişkili pikseller, belirli bir ilgi alanı içindeki farklı bölmelerin segmentasyonuna izin verecek şekilde tanımlanabilir. Daha sonra her bölgede ilgi çeken hücre popülasyonları, belirli bir hücre popülasyonu için yüksek yoğunluklu bölgelerin sıcak noktalar olarak gösterildiği ve nispeten düşük yoğunluklu bölgelerin soğuk noktalar olarak göründüğü doku haritalarının üretilmesine olanak sağlar. Doku örneklerindeki bağışıklık hücrelerinin tanımlanması, ölçülmesi ve haritalanması için yapılan bu metodoloji, belirli bir araştırma sorusu ve ilgi çekici belirteç için uyarlanabilir ve doğrulanabilir.Bu strateji, yüksek iş analizi için doku mikro dizilerine uygulanabilir. Aynı zamanda yerinde protein ve gen ekspresyonunu aynı anda incelemek için in situ hibridizasyon ile kombine edilebilir. Bu stratejiyi, il-17A üreten hücreleri hastaların fibrotik karaciğer dokusunda yerinde belirlemek ve haritalamak için kullandık.Protokolde belirtildiği gibi, birkaç reaktif kimyasal olarak tehlikelidir ve ilgili prosedürler uygun kişisel koruyucu donanım ve önlemler kullanılarak kimyasal bir başlık içinde yapılmalıdır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Hücreler stellat Yedi Adımda

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

2-Foton Mikroskopi kullanarak Fare Thymus intravital Görüntüleme

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Zebra balığı Doğuştan Bağışıklık Sağlık Bir Göstergesi Olarak Solunum Burst Tepki Kantitasyonu

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-GuÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â©rin

ile Enfeksiyon sırasında boşaltılması Lenf düğümleri içine Fare Cilt Dendritik Hücre Göç Eğitim Bir KAKE tabanlı Testi<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Basil Calmette-Guerin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi Ölçülen İlköğretim Lenfositler Plazma Membranlarda moleküler difüzyon

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Mukozal astar sıvı noninvaziv örnekleme için In Vivo üst solunum yolu bağışıklık arabulucu düzeyleri miktar

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

An Immunohistopathologic Study to Profile the Folate Receptor Beta Macrophage and Vascular Immune Microenvironment in Giant Cell Arteritis

Folat reseptör Beta makrofaj ve dev hücreli arterit vasküler bağışıklık Microenvironment profil için bir Immunohistopathologic çalışma

Giant cell arteritis (GCA) is a chronic immune-mediated disease of medium-to-large sized arteries that affects older adults. GCA manifests with arthritis ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Sırasında Merkezi Sinir Sisteminde Lenfosit Infiltrasyonunun Akış Sitometrik Analizi

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...