Name: generation of mosaic mammary organoids by differential trypsinization
Uploaded: 2020-03-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization at JoVE.com

نشكر بن أبرامز على المساعدة التقنية والدعم الأساسي من معهد جامعة كاليفورنيا في سانتا كروز لبيولوجيا الخلايا الجذعية (IBSC). نشكر سوزان ستروم وبيل ساكستون لاستخدام Solamere الغزل القرص المجهر كونكورسي. تم دعم هذا العمل جزئيًا من خلال المنح المقدمة إلى UCSC من معهد هوارد هيوز الطبي من خلال زمالات جيمس جيليام للدراسة المتقدمة (S.R.) ، من المعاهد القومية للصحة (NIH GM058903) لمبادرة تحقيق أقصى قدر من تنمية الطلاب (H.M. ومن المؤسسة الوطنية للعلوم للحصول على زمالة أبحاث الدراسات العليا (O.C. DGE 1339067) ومنحة (A18-0370) من لجنة تنسيق أبحاث السرطان في جامعة كاليفورنيا (LH).

وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) التابعة لجامعة كاليفورنيا، سانتا كروز، على جميع الأساليب الموصوفة هنا.
1. اليوم 1: هضم الغدة الثديية
<ol><li>الاستعداد لحصاد MGs من الفئران الإناث ناضجة 10-14 أسبوعا من العمر.<ol>
<li>أداء الحصاد على مقعد مفتوح في ظل ظروف معقم...

<ol>
	<li>Macias, H., Hinck, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+gland+development.">Mammary gland development.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).</li><li>Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+life+span+of+normal+and+preneoplastic+mouse+mammary+glands:+a+serial+transplantation+study.">The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).</li><li>Ip, M. M., Asch, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , (2000).</li><li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell.">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li><li>Stingl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells.">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li><li>Lasfargues, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+behavior+in+vitro+of+the+normal+mammary+epithelium+of+the+adult+mouse.+II.+Observations+on+the+secretory+activity.">Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity.</a> Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Orkin, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+tumor+producing+a+matrix+of+basement+membrane.">A murine tumor producing a matrix of basement membrane.</a> Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).</li><li>Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+secreted+proteins+of+mouse+mammary+epithelial+cells+by+the+collagenous+substrata.">Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata.</a> Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).</li><li>Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+mouse+mammary+epithelial+cells+with+collagen+substrata:+regulation+of+casein+gene+expression+and+secretion.">Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).</li><li>Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+extracellular+matrix+on+gene+expression:+is+structure+the+message?.">The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message?.</a> Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).</li><li>Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li><li>Jarde, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+and+Neuregulin1/ErbB+signalling+extends+3D+culture+of+hormone+responsive+mammary+organoids.">Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids.</a> Nature Commununications. 7, 13207 (2016).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity.">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+functional+role+of+E-+and+P-cadherins+in+mouse+mammary+ductal+morphogenesis+and+growth.">Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth.</a> Developmental Biology. 169 (2), 511-519 (1995).</li><li>Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desmosomal+adhesion+regulates+epithelial+morphogenesis+and+cell+positioning.">Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning.</a> Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).</li><li>Chanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells.">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).</li><li>Honvo-Houeto, E., Truchet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+Immunofluorescence+on+Frozen+Sections+of+Mouse+Mammary+Gland.">Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53179 (2015).</li><li>Macias, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLIT/ROBO1+signaling+suppresses+mammary+branching+morphogenesis+by+limiting+basal+cell+number.">SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number.</a> Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).</li><li>Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+transduction+of+mammary+stem+cells+for+analysis+of+gene+function+during+development+and+cancer.">Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer.</a> Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).</li><li>Smith, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VANGL2+regulates+luminal+epithelial+organization+and+cell+turnover+in+the+mammary+gland.">VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7079 (2019).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6 (9), e25661 (2011).</li><li>Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+human+reduction+mammoplasty+and+mastectomy+tissues+for+cell+culture.">Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e50011 (2013).</li><li>Marlow, R., Dontu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+breast+cancer+bone+metastatic+niche+in+complex+three-dimensional+cocultures.">Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).</li><li>Koledova, Z., Lu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+Fibroblast-Epithelium+Co-culture+Model+for+Understanding+Microenvironmental+Role+in+Branching+Morphogenesis+of+the+Mammary+Gland.">A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland.</a> Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).</li></ol>

هنا ، يتم تقديم طريقة بالتفصيل كيف يمكن للباحثين توليد الثقافات الاعضاء 3D باستخدام خلايا MG الأولية. الفرق بين هذا والبروتوكولات الأخرى هو أننا بالتفصيل طريقة لفصل اثنين، متميزة مقصورات الخلية MG: MyoECs القاعدية الخارجية وLECs الداخلية. تستخدم طريقتنا تريبسين-EDTA من خطوتين (0.05%) العلاج الذي نسمي...

الغدة الثديية (MG) هي بنية ظهارية أنبوبية تشبه الشجرة وجزءاً لا يتجزأ من ستروما الغنية بالخلايا الشحمية. تتكون ظهارة القناة ثنائية الطبقات من طبقة خارجية وبازلية من الانقباض والخلايا العضلة المتوسطة (MyoECs) وطبقة داخلية من الخلايا الظهارية الظهارية الظهارية المضيئة (LECs) ، وتطويق تجويف مركزي1. أثناء الرضاعة عندما تعاقدت MyoECs الخارجية على ضغط الحليب من الليكل السنخيالداخلي ، يخضع MG للعديد من التغييرات التي تخضع لسيطرة عوامل النمو (مثل EGF و FGF) والهرمونات (مثل البروجسترون والأنسولين والبرولاكتين). هذه التغيرات تسبب التمايز من الهياكل المتخصصة، الحويصلات الهوائية، والتي توليف وإفراز الحليب أثناء الرضاعة1. يمكن التلاعب بظهارة الثدي بشكل تجريبي باستخدام التقنيات التي يتم فيها إما زرع شظايا الأنسجة الظهارية أو الخلايا أو حتى خلية القاعدية واحدة في منصات الدهون الثديية المضيفة ، وتطهيرها مسبقًا من parenchyma الثديية الذاتية ، والسماح لها بالنمو لإعادة تشكيل شجرة ظهارية وظيفية كاملة2،3،4،5. الزرع هو تقنية قوية، ولكن من الصعب أن تستغرق وقتا طويلا والمستحيل إذا طفرة النتائج في وقت مبكر من الفتك الجنينية (قبل E14) التي تمنع إنقاذ الانج الثديية القابلة للزرع. وعلاوة على ذلك، يرغب المحققون في كثير من الأحيان في البحث عن أدوار الجزأين المختلفين، المستمدين من خلايا السلف المقيدة بالنسب. في حين أن تكنولوجيا Cre-lox تسمح بالتلاعب الجيني التفاضلي لـ MyoECs و LECs ، فإن هذا أيضًا مهمة تستغرق وقتًا طويلاً ومكلفة. وهكذا ، منذ 1950s ، وقد استخدم المحققون في المختبر organoids الثديية كوسيلة سهلة نسبيا وفعالة لمعالجة المسائل المتعلقة بنية الأنسجة الثديية وظيفة6،7.
في البروتوكولات المبكرة التي تصف عزلة وثقافة الخلايا الظهارية الثديية الأولية ، وجد المحققون أن مصفوفة غشاء الطابق السفلي (BME) ، المكونة من جلطة بلازما واستخراج جنين الدجاج ، كانت مطلوبة لشظايا MG التي تزرع على طبق6. في العقود التالية ، تم تطوير المصفوفات خارج الخلية (ECMs ، الكولاجين ، ومصفوفة البروتين هلامي تفرزها خلايا ساركوما Murine Engelbreth-Holm-Swarm) لتسهيل الثقافة ثلاثية الأبعاد وتقليد أفضل في بيئة الجسم الحي7،8،9،10. الخلايا التهيئة في مصفوفات 3D كشفت عن معايير متعددة (مورفولوجيا، والتعبير الجيني، واستجابة الهرمونات) أن مثل هذه البيئة الدقيقة نماذج أفضل فيالعملياتالفسيولوجية الجسم 9،10،11،12. حددت الأبحاث باستخدام خلايا المورين الأولية عوامل النمو الرئيسية ومورفوجينات ضرورية للصيانة الموسعة والتمايز للorganoids13. وقد مهدت هذه الدراسات الطريق للبروتوكول المعروض هنا ، وثقافة خلايا الثدي البشرية وorganoids 3D ، والتي هي الآن أداة سريرية حديثة ، مما يسمح لاكتشاف المخدرات واختبار المخدرات على عينات المريض14. وعموما، يبرز الاستزراع اللواني العضوي قدرات التنظيم الذاتي للخلايا الأولية ومساهماتها في تكوين المورفوجينية والتمايز.
عرض هنا هو بروتوكول لثقافة الظهارة المورين التي يمكن تمييزها في acini المنتجة للحليب. يتم استخدام تقنية التربسة التفاضلية لعزل MyoECs و LECs التي تضم مقصورتي خلية MG متميزتين. ويمكن بعد ذلك أن يتم التلاعب بكسور الخلايا المنفصلة هذه وراثياً إلى وظيفة جينية مفرطة أو ضربة قاضية. لأن النسب الجوهرية، والتنظيم الذاتي هو خاصية فطرية من الخلايا الظهارية الثديية15،16،17، وإعادة دمج هذه الكسور الخلية يسمح للباحثين لتوليد ثنائي الطبقات، والأجهزة الفسيفسائية. نبدأ بهضم الأنسجة الدهنية بشكل أنزيمي ، ثم احتضان شظايا الثديية على طبق زراعة الأنسجة لمدة 24 ساعة(الشكل 1). تستقر شظايا الأنسجة على أطباق البوليسترين كأجزاء ثنائية الطبقات مع تنظيمها في الجسم الحي: طبقة عضلة العين الخارجية المحيطة بالطبقات المضيئة الداخلية. هذه المنظمة الخلوية يسمح لعزل MyoECs الخارجي عن طريق التربسين EDTA (0.05٪) العلاج لمدة 3-6 دقيقة تليها الجولة الثانية من التربسين-EDTA (0.05%). العلاج الذي يفصل LECs الداخلية المتبقية(الشكل 2). وهكذا، يتم عزل هذه الأنواع من الخلايا مع حساسية التربسين مختلفة ويمكن لاحقا أن تكون مختلطة ومطلي في ECM(الشكل 3). وتخضع الخلايا للتنظيم الذاتي لتشكيل مجالات ثنائية الطبقات، تتألف من طبقة خارجية من MyoECs المحيطة بمراكز التجارة المنخفضة الداخلية. تشكيل لومن يحدث كما تنمو الخلايا في وسط يحتوي على مزيج من عوامل النمو (انظر وصفات للنمو المتوسط)13. بعد 5 أيام ، يمكن تمييز الأورجادات الاعضاء في acini المنتجة للحليب عن طريق التحول إلى Alveologenesis Medium (انظر الوصفات والشكل 3F)واحتضانها لمدة 5 أيام أخرى. بدلا من ذلك، سوف تستمر الorganoids للتوسع وفرع في النمو المتوسطة لمدة 10 أيام على الأقل. يمكن تحليل الأرغن باستخدام الفلورة المناعية(الشكل 3D-F)أو تحريرها من ECM باستخدام محلول الاسترداد (انظر جدول المواد)وتحليلها عبر طرق أخرى (على سبيل المثال، المناعة، RT-qPCR).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well ultra-low attachment plate (Corning)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CLS3473-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M nylon cell strainer (Corning)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Pen/Strep also works</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement without vitamin A (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6 ACTb-EGFP mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>003291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin syringe 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class 2 Dispase (Roche)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class 3 Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Recovery solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>354253</td>
			<td>Follow the guidelines for use &#8211; Extraction of Three-Dimensional Structures 
			from Corning Matrigel Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CLS3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4902-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase (Deoxyribonuclease I)</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS002007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21447</td>
			<td>Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-606-150</td>
			<td>Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330-057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>Without Mg2+/Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AF-100-15-100ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068&#8211;085</td>
			<td>100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G (Southern Biotech)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Referred to as mounting media in text</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-WAP</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>SC-14832</td>
			<td>Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 &#181;g/mL, RRID:AB_677601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>AS-83218</td>
			<td>Use 1:2000, stock is 20mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I6634-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRT14&#8211;CreERtam</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>5107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40230C</td>
			<td>Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MillexGV Filter Unit 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td>These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SMA</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S671-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S468-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrg1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5898-NR-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovine Pituitary Prolactin</td>
			<td>National Hormone and Peptide Program</td>
			<td></td>
			<td>Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldahyde</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PX0055-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R26R-EYFP</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho inhibitor Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Filtered Donkey Serum</td>
			<td>Equitech-Bio Inc.</td>
			<td>SD30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Filtered Donkey Serum</td>
			<td>Equitech-Bio Inc.</td>
			<td>SD30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>x100-500ML</td>
			<td>Laboratory grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of mosaic mammary organoids by differential trypsinization

تقدم الأرغن ذاتية التنظيم وهياكل الأنسجة ثلاثية الأبعاد التي تلخص العمليات الفسيولوجية في راحة الطبق. تتكون الغدة الثديية المورين من غرفتين منفصلتين للخلايا الظهارية متميزة ، تخدم وظائف مختلفة: المقصورة الخارجية ، الانحلال myoepithelial والمقصورة المضيئة الداخلية الإفرازية. هنا ، نصف طريقة يتم من خلالها عزل الخلايا التي تتألف من هذه الأجزاء ثم دمجها للتحقيق في مساهماتها الفردية في تكوين الغدة الثديية والتمايز. الطريقة بسيطة وفعالة ولا تتطلب تقنيات فصل متطورة مثل فرز الخلايا المنشطة الفلورية. بدلا من ذلك، نحن الحصاد وهضم الأنسجة أنزيمي، بذور ظهارة على أطباق زراعة الأنسجة المنضمة، ومن ثم استخدام التربسال التفاضلية لفصل myoepithelial من الخلايا المضيئة مع ~ 90٪ نقاء. ثم يتم طلاء الخلايا في مصفوفة خارج الخلية حيث تنظم في عضويات ثنائية الأبعاد (3D) يمكن تمييزها لإنتاج الحليب بعد 10 أيام في الثقافة. لاختبار آثار الطفرات الوراثية، يمكن حصاد الخلايا من النوع البري أو نماذج الماوس المعدلة وراثيا، أو يمكن التلاعب بها وراثيا قبل الثقافة ثلاثية الأبعاد. ويمكن استخدام هذه التقنية لتوليد الأورجادات الفسيفساء التي تسمح بالتحقيق في وظيفة الجينات على وجه التحديد في المقصورة المضيئة أو الميوبيلية.

يصف البروتوكول المعروض هنا طريقة للتحقيق في مساهمات نسب محددة للخلايا الظهارية الثديية من خلال الاستفادة من الأجهزة الفسيفسائية. للحصول على خلايا المورين الأولية للorganoids ، يجب أولاً عزل ظهارة الغدة الثديية عن ستروما الغنية الدهنية المحيطة(الشكل 1). هذه ا...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization at JoVE.com

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

الغدة الثديية هي بنية ثنائية الطبقات ، تتألف من الخلايا الظهارية الداخلية والداخلية. قدم هو بروتوكول لإعداد organoids باستخدام التربسينات التفاضلية. تسمح هذه الطريقة الفعالة للباحثين بالتلاعب بشكل منفصل مع هذين النوعين من الخلايا لاستكشاف الأسئلة المتعلقة بأدوارهم في شكل الغدة الثديية ووظيفتها.

جيل من الأرغن مامري الفسيفساء عن طريق التربسينات التفاضلية

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

طريقتنا هامة لأنها تسمح للباحثين بعزل ومعالجة أنواع الخلايا المختلفة للتحقيق في مساهماتهم الفردية في شكل الأنسجة ووظيفتها. هذه التقنية هي طريقة لطيفة وفعالة لفصل أنواع الخلايا ونتيجة لذلك ، يتم الحفاظ على سلامة الخلايا لثقافة 3D. ويمكن أيضا تطبيق هذه التقنية على أنظمة أخرى لعزل الخلايا التي ليس لديها علامات حيوية جيدة.لحصاد عدد اثنين وثلاثة وأربعة وخمس غدد مامارية من فأر أنثى يبلغ من العمر 10 إلى 14 أسبوعًا ، قم أولاً بعمل شق سنتيمتر واحد عند خط الوسط بين الغدد الخلفية. مدّ القطع إلى الرقبة وإجراء قطع جانبية صغيرة من شق خط الوسط نحو الأطراف. ثم تمتد الجلد تدرس قبل تأمينه مع دبوس على كل جانب من الحيوان.باستخدام ملقط، وجمع العقد الليمفاوية من عدد الغدد الأربعة. لإزالة الغدد الثديية، واستخدام مقص حاد لقطع تحت كل منطقة من الأنسجة، ووضع الأنسجة في 50 ملليلتر من أربع درجات مئوية DMEM-F12 تكملها 5٪ FBS والمضادات الحيوية المضادة للالميكوtic كما يتم حصادها. عندما تم جمع جميع الأنسجة، فرم الغدد حتى يمكن أن تناسب القطع بسهولة من خلال طرف ماصة ملليلتر واحد تدوير لوحة حسب الضرورة بحيث يتم مفرومة جميع الأنسجة بالتساوي.ثم نقل الشظايا في ثلاثة ملليلتر من وسط الهضم إلى بئر واحد من طبق التصاق منخفض من ستة بئر لمدة 14 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في صباح اليوم التالي، الماصات بلطف الأنسجة 10 مرات مع ميكروبيبت ملليلتر واحد ونقل شظايا الأنسجة إلى أنبوب 15 ملليلتر. جمع الأنسجة عن طريق الطرد المركزي وإعادة تثبيت بيليه في خمسة ملليلتر من DPBS الطازجة.تصفية التعليق من خلال مصفاة خلية النايلون قبل الرطب 70 ميكرومتر، شطف الأنبوب في المصفاة أربع مرات مع 10 ملليلتر من 37 درجة مئوية DMEM-F12 لكل غسل. لإطلاق شظايا الأنسجة، عقد علامة التبويب مصفاة مع أصابع قفاز وعكس مصفاة على طبق ثقافة الأنسجة 60 ملليمتر. تمرير أربعة ملليلتر واحد aliquots من وسط الصيانة من خلال الجزء السفلي من المصفاة وتفحص بسرعة الطبق للخلايا الفردية، قطرات الدهون، وتلويث الأنسجة تحت مجهر مقلوب.ثم ضع الطبق في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 24 ساعة للسماح لشظايا الأنسجة بالتمسك بالطبق وتوليد شظايا ثنائية الطبقات. لفصل الخلايا الظهارية من الخلايا الظهارية الإنارة، شطف الطبق مع ملليلتر واحد من DPBS قبل إضافة ملليلتر واحد من 0.5٪ 10٪التربسين-EDTA إلى الخلايا. مراقبة الهضم بعناية تحت المجهر المقلوب.سوف تبدأ الطبقة الخارجية من الخلايا الميوفية في الانفصال في غضون ثلاث إلى ست دقائق. عندما تكون خلايا ثنائية في اخلايا منفصلة، نقل عظمى إلى أنبوب 15 ملليلتر تحتوي على مليلترين من 10٪ FBS في DPBS. دون إزعاج الخلايا الظهارية اللمعانية ، شطف الطبق بلطف مع ملليلترين من DPBS قبل إضافة ملليلتر جديد من التربسين -EDTA إلى الخلايا المتبقية.بعد سبع إلى 15 دقيقة، يطفئ التفاعل الأنزيمي مع ملليلترين من 10٪ FBS في PBS ونقل الخلايا إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر. من المهم مراقبة الخلايا عن كثب أثناء التبسينية التفاضلية وعدم هضم الخلايا. عندما تم جمع كل من الكسور، الطرد المركزي الخلايا لإزالة أي مبيد تفكك المتبقية و ريسيد الكريات في 250 ميكرولترات من الصيانة المتوسطة لكل أنبوب.بعد العد، وتمييع كل مجموعة خلايا إلى 1.2 مرة 10 إلى الخلايا الأربع لكل تركيز جيد في وسط الصيانة الطازجة. إضافة 90 ميكرولترات من 50٪ مصفوفة خارج الخلية في DMEM-F12 دون الفينول الأحمر إلى كل بئر من شريحة غرفة ثمانية جيدا. عندما تكون جميع الآبار مغلفة، ترسيخ الطبقة الأساسية في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 30 دقيقة.خلال هذا البلمرة، وجمع كسور الخلية عن طريق الطرد المركزي و resuspend كل مجموعة في 100 ميكرولترات من 10٪ مصفوفة خارج الخلية في 90٪ متوسطة النمو في البئر. بعد ذلك، إضافة 100 ميكرولترات من كل تعليق الخلية إلى كل بئر والسماح للثقافات المشتركة لتسوية لمدة 20 دقيقة في حاضنة ثقافة الخلية. في نهاية الحضانة، بعناية إضافة 100 ميكرولترات من متوسطة النمو أسفل الجانب من كل جدار الغرفة والعودة إلى الشريحة الحاضنة ثقافة الخلية.صورة الخلايا كل 24 ساعة لتتبع نموها وتجديد بلطف متوسطة النمو كل يومين إلى ثلاثة أيام. لإصلاح organoids للمناعة، في الوقت المناسب التجريبية، pirate بعناية المتوسطة من كل شريحة ليتم تصويرها وشطف كل جيدا مع 200 ميكرولترات من DPBS في البئر. إصلاح organoids مع 200 ميكرولترات من أربع درجات مئوية paraformaldehyde لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل علاج organoids مع 200 ميكرولترات من 0.2 ٪ في DPBS في البئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.في نهاية الحضانة، permeabilizes organoids مع 0.25٪ triton X-100 في DPBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة تليها عرقلة الربط غير محدد مع مصل 5٪ حمار أو المصل المناسب الذي يطابق أنواع الأجسام المضادة الثانوية في DPBS لمدة ساعة واحدة مع هزاز. ثم تسمية الخلايا مع 125 إلى 200 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية المناسبة من الفائدة في مصل 1٪ حمار في DPBS بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية مع هزاز. في صباح اليوم التالي، غسل كل جيدا مرتين مع 200 ميكرولترات من DPBS بالإضافة إلى تريتون X-100 قبل وضع علامة على organoids مع الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المناسبة مزدوجة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز محمية من الضوء.ثم غسل كل جيدا مرتين مع DPBS الطازجة بالإضافة إلى تريتون X-100 كما أظهرت وصورة organoids بواسطة المجهر الفلوريسنس وفقا للبروتوكولات القياسية. بعد 24 ساعة من الحضانة ، التزمت الشظايا الظهارية المنقية بالجزء السفلي من طبق الثقافة لتشكيل هياكل مسطحة تشبه الفطائر مع طبقة خارجية من الخلايا المنوية التي تحيط بطبقة داخلية من الخلايا الظهارية الإنارةية. علاج التربسين يفصل بشكل تفاضلي الخلايا مع الخلايا ميوفي فيليليال فصل الأولى والظهير كخلايا مستديرة مشرق التي تطوق جوهر الخلايا الظهارية اللمعانية الكُبُل المتبقية.النقاء العام للحجرتين الخلية حوالي 90٪ كما تم تقييمها من قبل تعبير الكيراتين-14 و E-cadherin داخل المجموعتين السكانيتين. بعد 10 أيام من الثقافة في 10٪ مصفوفة خارج الخلية على 50٪ قاعدة مصفوفة خارج الخلية كما هو موضح، شكلت خصية الخلايا الظهارية ميوفية ظهارية كبيرة هياكل متفرعة مع التجويف متطورة. التمايز في اليوم الخامس مع إضافة إلى alveologenesis المتوسطة يحفز تشكيل أكبر, أكثر تشعبا تحتوي على الحليب organoids.من المهم أن نتذكر لغسل المصفاة بعناية عند جمع الظهارة لضمان عدم وجود ملوثات السترومال. للاستعلام عن التغيرات في التعبير الجيني، يمكن للباحثين جمع الحمض النووي الريبي من الغدد التناسلية عن طريق إطلاقها من المصفوفة خارج الخلية باستخدام محلول استرداد. ويعتبر Paraformaldehyde الخطرة وينبغي على الباحثين استخدام معدات الحماية الشخصية والعمل داخل غطاء الدخان عند استخدام هذا الكاشف.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

فسيفساء اسماك الزرد Transgenesis لتحليل الجينوم الوظيفي للجينات التعاونية المرشح لورم إمراض

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

جيل من التعايش الالتصاقي الزرد الأجنة التي كتبها فيوجن الجراحي لتطوير الأريمات

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

جيل المستمدة IPSC-Organoids الدماغ البشري لنموذج اضطرابات النمو العصبي في وقت مبكر

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

نقل الغدة الثديية تشكيل القدرة بين الخلايا الظهارية الثديية القاعدية والخلايا اللمعية الثديية عن طريق الحويصلات خارج الخلية / إكسوسوميس

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

تقنية زرع الثدي الثديية الرواية جديدة لتصور الجيل سفينة من الخلايا الجذعية البطانية الأوعية الدموية

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

جيل أورجانويدس الدماغي موحدة واستنساخه من نوع فوريبرين من الإنسان فعل الخلايا الجذعية Pluripotent

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

جيل أورجانويدس من القنوات الصفراوية اكستراهيباتيك الماوس

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

توليد العضوية متعددة الخلايا الإنسان الاساسيه بطانة الرحم

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

إضافية الخلوية مصفوفة المستندة إلى و اضافية الخلية مصفوفة خالية جيل من الخصية مورين

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

جيل وثقافة Organoids اللغوية المستمدة من الخلايا الجذعية طعم الماوس الكبار

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...