Name: generation of mosaic mammary organoids by differential trypsinization
Uploaded: 2020-03-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization at JoVE.com

Vi takker Ben Abrams for teknisk bistand og kernestøtte fra University of California, Santa Cruz (UCSC) Institute for biologi stamceller (IBSC). Vi takker Susan Strome og Bill Saxton for brugen af deres Solamere Spinning Disk Konfokale mikroskop. Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud til UCSC fra Howard Hughes Medical Institute gennem James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study program (SR), fra NIH (NIH GM058903) for initiativet til at maksimere de studerendes udvikling (GM) og fra National Science Foundation for et akademisk forskningsstipendium (O.C. DGE 1339067) og ved et tilskud (A18-0370) fra UC-Cancer Research Coordinating Committee (LH).

Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra University of California, Santa Cruz.
1. Dag 1: Mælkekirtlen fordøjelse
<ol><li>Forbered dig på at høste MGs fra modne hunmus 10-14 uger.<ol>
<li>Udfør høsten på en åben bænk under aseptiske forhold.</li>
		<li>Steriliser alle kirurgiske forsyninger, kork brædder, og stifter ved autoklavering og iblødsætning i 70% alkohol i 20 min før operationen.</li>
		<li>Bedøve ...

<ol>
	<li>Macias, H., Hinck, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+gland+development.">Mammary gland development.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).</li><li>Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+life+span+of+normal+and+preneoplastic+mouse+mammary+glands:+a+serial+transplantation+study.">The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).</li><li>Ip, M. M., Asch, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , (2000).</li><li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell.">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li><li>Stingl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells.">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li><li>Lasfargues, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+behavior+in+vitro+of+the+normal+mammary+epithelium+of+the+adult+mouse.+II.+Observations+on+the+secretory+activity.">Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity.</a> Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Orkin, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+tumor+producing+a+matrix+of+basement+membrane.">A murine tumor producing a matrix of basement membrane.</a> Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).</li><li>Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+secreted+proteins+of+mouse+mammary+epithelial+cells+by+the+collagenous+substrata.">Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata.</a> Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).</li><li>Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+mouse+mammary+epithelial+cells+with+collagen+substrata:+regulation+of+casein+gene+expression+and+secretion.">Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).</li><li>Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+extracellular+matrix+on+gene+expression:+is+structure+the+message?.">The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message?.</a> Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).</li><li>Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li><li>Jarde, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+and+Neuregulin1/ErbB+signalling+extends+3D+culture+of+hormone+responsive+mammary+organoids.">Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids.</a> Nature Commununications. 7, 13207 (2016).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity.">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+functional+role+of+E-+and+P-cadherins+in+mouse+mammary+ductal+morphogenesis+and+growth.">Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth.</a> Developmental Biology. 169 (2), 511-519 (1995).</li><li>Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desmosomal+adhesion+regulates+epithelial+morphogenesis+and+cell+positioning.">Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning.</a> Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).</li><li>Chanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells.">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).</li><li>Honvo-Houeto, E., Truchet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+Immunofluorescence+on+Frozen+Sections+of+Mouse+Mammary+Gland.">Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53179 (2015).</li><li>Macias, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLIT/ROBO1+signaling+suppresses+mammary+branching+morphogenesis+by+limiting+basal+cell+number.">SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number.</a> Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).</li><li>Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+transduction+of+mammary+stem+cells+for+analysis+of+gene+function+during+development+and+cancer.">Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer.</a> Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).</li><li>Smith, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VANGL2+regulates+luminal+epithelial+organization+and+cell+turnover+in+the+mammary+gland.">VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7079 (2019).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6 (9), e25661 (2011).</li><li>Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+human+reduction+mammoplasty+and+mastectomy+tissues+for+cell+culture.">Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e50011 (2013).</li><li>Marlow, R., Dontu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+breast+cancer+bone+metastatic+niche+in+complex+three-dimensional+cocultures.">Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).</li><li>Koledova, Z., Lu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+Fibroblast-Epithelium+Co-culture+Model+for+Understanding+Microenvironmental+Role+in+Branching+Morphogenesis+of+the+Mammary+Gland.">A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland.</a> Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).</li></ol>

Her præsenteres en metode med detaljer om, hvordan forskere kan generere 3D organoidkulturer ved hjælp af primære MG-celler. Forskellen mellem dette og andre protokoller er, at vi detaljer en metode til at adskille de to, forskellige MG cellerum: den ydre basal MyoECs og indre LECs. Vores metode anvender en to-trins trypsin-EDTA (0,05%) behandling, som vi kalder differentialtrypsinisering19. Denne procedure gør det muligt for forskere at isolere MyoECs og LECs uden at bruge sofistikeret flow c...

Mælkekirtlen (MG) er en træ-lignende, rørformede epitelstruktur indlejret i en adipocyte rig stroma. Det tolagede ductal epitel består af et ydre, basalt lag af kontraktile, myoepitheliale celler (MyoECs) og et indre lag af luminale, sekretoriske epitelceller (LECs), der omkranser en central lumen1. Under amning, når de ydre MyoECs kontrakt at presse mælk fra den indre alveolær LECs, MG gennemgår talrige ændringer, der er under kontrol af vækstfaktorer (f.eks EGF og FGF) og hormoner (f.eks progesteron, insulin, og prolaktin). Disse ændringer forårsager differentiering af specialiserede strukturer, alveoler, som syntetisere og udskiller mælk under amning1. Den mamma epithelia kan eksperimentelt manipuleres ved hjælp af teknikker, hvor enten epitelvæv fragmenter, celler, eller endda en enkelt basal celle transplanteres i værten mælkefedt puder, præryddet af endogene mammary parenkym, og lov til at vokse ud for at rekonstituere en hel, funktionel epiteltræ2,3,4,5. Transplantation er en kraftfuld teknik, men det er tidskrævende og umuligt, hvis en mutation resulterer i tidlig embryonal dødelighed (før E14), der forhindrer redning af transplanterbar mamma anlage. Desuden ønsker efterforskere ofte at undersøge rollerne for de to forskellige rum, som er afledt af afstamningsbegrænsede sogenitorceller. Mens Cre-lox-teknologien muliggør differentieret genetisk manipulation af MyoECs og LECs, er dette også en tidskrævende og dyr virksomhed. Således har efterforskere siden 1950'erne brugt in vitro mamma organoids som en forholdsvis nem og effektiv måde at behandle spørgsmål vedrørende brystvævstruktur og funktion6,7.
I tidlige protokoller, der beskriver isolering og kultur af primære mælkeepitelceller, fandt efterforskerne, at en kældermembranmatrix (BME), der bestod af en plasmablodprop og kyllingeembryoekstrakt, var påkrævet for MG-fragmenter dyrket på en skål6. I de følgende årtier, ekstracellulære matricer (Ecm'er, kollagen, og jellylike protein matrix udskilles af Engelbreth-Holm-Swarm murine sarkom celler) blev udviklet for at lette 3D-kultur og bedre efterligne in vivo miljø7,8,9,10. Dyrkning af celler i 3D-matricer afsløret af flere kriterier (morfologi, genekspression, og hormon reaktionsevne), at et sådant mikromiljø bedre modeller in vivo fysiologiske processer9,10,11,12. Forskning ved hjælp af primære murineceller identificerede de vigtigste vækstfaktorer og morfogener, der er nødvendige for den udvidede vedligeholdelse og differentiering af organoider13. Disse undersøgelser har sat scenen for protokollen præsenteres her, og for kulturen af menneskelige brystceller som 3D organoider, som nu er et moderne klinisk værktøj, der giver mulighed for lægemiddelopdagelse og lægemiddeltest på patientprøver14. Samlet set, organoid dyrkning fremhæver selv-organisation kapacitet af primære celler og deres bidrag til morfogenese og differentiering.
Præsenteret her er en protokol til kultur murine epithelia, der kan differentieres i mælkeproducerende acini. En differentialtrypsiniseringsteknik bruges til at isolere MyoECs og LECs, der omfatter de to forskellige MG-cellerum. Disse adskilte cellefraktioner kan derefter genetisk manipuleres til overexpress eller knockdown genfunktion. Fordi afstamning-iboende, selv-organisation er en medfødt egenskab af mælkeepitelceller15,16,17, rekombinere disse cellefraktioner giver forskerne mulighed for at generere tolagede, mosaik organoider. Vi begynder med enzymatisk fordøje fedtvæv, og derefter inkubere mælkefragmenter på en vævskultur parabol for 24 h (Figur 1). Vævsfragmenterne sætter sig på polystyrenretter som tolagede fragmenter med deres in vivo organisation: ydre myoepithelial lag omkring indre luminale lag. Denne cellulære organisation giver mulighed for isolering af de ydre MyoECs ved trypsin-EDTA (0,05%) behandling i 3-6 min efterfulgt af en anden runde af trypsin-EDTA (0,05%) behandling, der løsner de resterende indre LECs (Figur 2). Således er disse celletyper med forskellig trypsin følsomhed isoleret og kan efterfølgende blandes og belagt i ECM (Figur 3). Cellerne gennemgår selvorganisering til at danne tolagede kugler, der omfatter et ydre lag af MyoECs omkring indre LECs. Lumen dannelse opstår som cellerne vokser i et medium, der indeholder en cocktail af vækstfaktorer (se opskrifter på Vækst Medium)13. Efter 5 dage kan organoider differentieres til mælkeproducerende acini ved at skifte til Alveologenesis Medium (se opskrifter og figur 3F)og inkuberes i yderligere 5 dage. Alternativt vil organoider fortsætte med at udvide og filial i Vækst Medium i mindst 10 dage. Organoider kan analyseres ved hjælp af immunfluorescens (figur 3D-F) eller frigives fra ECM ved hjælp af en genvindingsopløsning (se Materialetabel)og analyseres ved hjælp af andre metoder (f.eks. immunblot, RT-qPCR).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well ultra-low attachment plate (Corning)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CLS3473-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M nylon cell strainer (Corning)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Pen/Strep also works</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement without vitamin A (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6 ACTb-EGFP mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>003291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin syringe 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class 2 Dispase (Roche)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class 3 Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Recovery solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>354253</td>
			<td>Follow the guidelines for use &#8211; Extraction of Three-Dimensional Structures 
			from Corning Matrigel Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CLS3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4902-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase (Deoxyribonuclease I)</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS002007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21447</td>
			<td>Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-606-150</td>
			<td>Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330-057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>Without Mg2+/Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AF-100-15-100ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068&#8211;085</td>
			<td>100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G (Southern Biotech)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Referred to as mounting media in text</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-WAP</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>SC-14832</td>
			<td>Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 &#181;g/mL, RRID:AB_677601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>AS-83218</td>
			<td>Use 1:2000, stock is 20mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I6634-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRT14&#8211;CreERtam</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>5107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40230C</td>
			<td>Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MillexGV Filter Unit 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td>These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SMA</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S671-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S468-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrg1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5898-NR-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovine Pituitary Prolactin</td>
			<td>National Hormone and Peptide Program</td>
			<td></td>
			<td>Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldahyde</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PX0055-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R26R-EYFP</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho inhibitor Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Filtered Donkey Serum</td>
			<td>Equitech-Bio Inc.</td>
			<td>SD30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Filtered Donkey Serum</td>
			<td>Equitech-Bio Inc.</td>
			<td>SD30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>x100-500ML</td>
			<td>Laboratory grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of mosaic mammary organoids by differential trypsinization

Organoids tilbyder selvorganiserende, tre-dimensionelle vævstrukturer, der opsummerer fysiologiske processer i bekvemmeligheden af en skål. Murine mælkekirtlen består af to forskellige epitelcellerum, der tjener forskellige funktioner: det ydre, kontraktile myoepitelrum og det indre, sekretoriske luminale rum. Her beskriver vi en metode, hvorved de celler, der omfatter disse rum, isoleres og derefter kombineres for at undersøge deres individuelle afstamningsbidrag til brystkirtel morfogenese og differentiering. Metoden er enkel og effektiv og kræver ikke avancerede separationsteknologier såsom fluorescensaktiveret cellesortering. I stedet høster og enzymatisk fordøje vævet, frø epitel på klæbende væv kultur retter, og derefter bruge differentiale trypsinization at adskille myoepithelial fra luminale celler med ~ 90% renhed. Cellerne er derefter belagt i en ekstracellulær matrix, hvor de organiserer sig i tolagede, tre-dimensionelle (3D) organoids, der kan differentieres til at producere mælk efter 10 dage i kultur. For at teste virkningerne af genetiske mutationer, celler kan høstes fra vilde type eller genetisk manipuleret musemodeller, eller de kan være genetisk manipuleret før 3D-kultur. Denne teknik kan bruges til at generere mosaik organoids, der tillader undersøgelse af genfunktionen specifikt i luminal eller myoepitelrummet.

Protokollen præsenteres her beskriver en metode til at undersøge specifikke afstamning bidrag af mælkeepitelceller ved at gøre brug af mosaik organoider. For at opnå primære murinceller til organoider skal mælkekirtlens epitel først isoleres fra den omgivende adipocyte rige stroma (Figur 1). Denne proces beskrives kort her og beskrives også i en tidligere offentliggjort undersøgelse18. For at opnå nok celler anbefales det, a...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization at JoVE.com

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Mælkekirtlen er en tolaget struktur, bestående af ydre myoepithelial og indre luminale epitelceller. Præsenteret er en protokol til at forberede organoids ved hjælp af differentiale trypsinization. Denne effektive metode gør det muligt for forskere at separat manipulere disse to celletyper til at udforske spørgsmål vedrørende deres roller i mælkekirtlen form og funktion.

Generation af Mosaic Mammary Organoids af Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Vores metode er betydelig, fordi det giver forskerne mulighed for at isolere og manipulere forskellige celletyper til undersøgelse af deres individuelle afstamning bidrag til væv form og funktion. Denne teknik er en skånsom og effektiv metode til adskillelse af celletyper, og som følge heraf bevares cellernes integritet til 3D-kultur. Denne teknik kan også anvendes på andre systemer til at isolere celler, der ikke har vel karakteriseret biomarkører.At høste nummer to, tre, fire og fem mælkekirtler fra en 10 til 14 uger gammel kvindelig mus, først gøre en en centimeter snit på midterlinjen mellem de to bagben. Udvid snittet op til halsen og lav små laterale snit fra midterlinjen indsnit mod lemmerne. Derefter strække huden lært, før du sikrer det med en pin på hver side af dyret.Ved hjælp af scener, indsamle lymfeknuder fra nummer fire kirtler. For at fjerne mælkekirtlerne, bruge skarpe saks til at skære under hver region af væv, placere væv i 50 milliliter af fire grader Celsius DMEM-F12 suppleret med 5% FBS og antibiotika-antimykotisk, som de er høstet. Når alle væv er blevet indsamlet, hak kirtlerne, indtil stykkerne kan passe let gennem en milliliter pipette spids roterende pladen efter behov, således at alle væv hakkes jævnt.Derefter overføres fragmenterne i tre milliliter fordøjelsesmedium til en enkelt brønd af en seks-godt lav vedhæftning skål i 14 timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Den næste morgen, forsigtigt pipette væv 10 gange med en en milliliter mikropipette og overføre væv fragmenter i en 15 milliliter rør. Vævet opsamls ved centrifugering, og pelleten skal opbruges i fem milliliter frisk DPBS.Suspensionen filtreres gennem en fortæt 70 mikrometer nyloncellestudse, og røret skylles fire gange med 10 milliliter celsius celsius DMEM-F12 pr. vask. For at frigøre vævsfragmenterne skal du holde sifanen med behandskede fingre og vende sien over en 60 millimeter vævskulturskål. Pass fire en milliliter aliquots af vedligeholdelse medium gennem bunden af sern og hurtigt undersøge skålen for enkelte celler, fedtdråber, og forurenende væv under en omvendt mikroskop.Placer derefter pladen i cellekulturskuvøsen i 24 timer for at lade vævsfragmenterne holde sig til skålen og generere tovtænte fragmenter. For at adskille myoepithelialceller fra de luminale epitelceller, skyl skålen med en milliliter DPBS, før du tilføjer en milliliter frisk 0,5% trypsin-EDTA til cellerne. Overvåg forsigtigt fordøjelsen under et omvendt mikroskop.Det ydre lag af myoepithelial celler vil begynde at løsne inden for tre til seks minutter. Når myoepithelialcellerne er afmonteret, overføres supernatanten til et 15 milliliterrør indeholdende to milliliter 10% FBS i DPBS. Uden at forstyrre de luminale epitelceller skylles skålen forsigtigt med to milliliter DPBS, før der tilsættes en frisk milliliter trypsin-EDTA til de resterende celler.Efter syv til 15 minutter slukkes den enzymatiske reaktion med to milliliter 10% FBS i PBS, og cellerne overføres til et nyt 15 milliliterrør. Det er afgørende at overvåge cellerne nøje under differentiale trypsinization og ikke over fordøje cellerne. Når begge fraktioner er indsamlet, centrifuge cellerne til at fjerne eventuelle resterende dissociation reagens og resuspend pellets i 250 mikroliter af vedligeholdelse medium pr rør.Efter optælling fortyndes hver cellepopulation til en 1,2 gange 10 til de fire celler pr. brøndkoncentration i frisk vedligeholdelsesmedium. Tilføj 90 mikroliter af 50% ekstracellulære matrix i DMEM-F12 uden phenol rød til hver brønd af en otte-brønd kammer dias. Når alle brøndene er blevet belagt, størkne baselaget i cellekultur inkubatoren i 30 minutter.Under denne polymerisering indsamles cellefraktionerne ved centrifugering og resuspenderede hver population i 100 mikroliter på 10% ekstracellulær matrix i 90% vækstmedium pr. brønd. Dernæst tilsættes 100 mikroliter af hver celle suspension til hver brønd og lad co-kulturer til at nøjes med 20 minutter i cellen kultur kuvøse. I slutningen af inkubationen, forsigtigt tilføje 100 mikroliter af vækstmedium ned på siden af hvert kammer væg og returnere dias til cellekultur inkubator.Billede cellerne hver 24 timer til at spore deres vækst og forsigtigt forny vækstmediet hver to til tre dage. For at fastsætte organoider til immunstaining, på det relevante eksperimentelle tidspunkt, omhyggeligt aspirere mediet fra hvert dias, der skal afbildes og skyl hver brønd med 200 mikroliter DPBS per brønd. Fix organoiderne med 200 mikroliter på fire grader Celsius paraformaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur, før organoiderne behandles med 200 mikroliter på 0,2 % glycin i DPBS pr. brønd i 30 minutter ved stuetemperatur.Ved inkubationens afslutning permeabiliseres organoiderne med 0,25 % triton X-100 i DPBS i 10 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af blokering af uspecifikke bindinger med 5 % æselserum eller det relevante serum, der matcher arten af det sekundære antistof i DPBS i en time med rokling. Derefter mærke cellerne med 125 til 200 mikroliter af de relevante primære antistoffer af interesse i 1% æsel serum i DPBS natten over ved fire grader Celsius med vuggende. Den næste morgen, vask hver brønd to gange med 200 mikroliter DPBS plus triton X-100 før mærkning af organoider med passende fluorescens konjugeret sekundære antistoffer i 45 minutter ved stuetemperatur med rokkende beskyttet mod lys.Derefter vaskes hver brønd to gange med frisk DPBS plus triton X-100 som påvist og billede organoiderne ved fluorescensmikroskopi i henhold til standardprotokoller. Efter 24 timers inkubation, renset epitel fragmenter klæbet til bunden af kulturen parabol danner flade pandekage-lignende strukturer med et ydre lag af myoepithelial celler omkranser et indre lag af luminal epitelceller. Trypsin behandling differentieret løsner cellerne med myoepithelial celler løsne først og optræder som lyse afrundede celler, der omkranser kernen af de resterende cuboidal luminal epitelceller.Den samlede renhed af de to cellerum er omkring 90% som vurderet af keratin-14 og E-cadherin udtryk inden for de to populationer. Efter 10 dages kultur i 10% ekstracellulær matrix på en 50% ekstracellulær matrix base som påvist, dannede de myoepithelale luminal epitelcelleorganoider store forgrenede strukturer med veludviklede lumen. Differentiering på dag fem med tilføjelsen til alveologenesis medium inducerer dannelsen af større, mere forgrenede mælkeholdige organoider.Det er vigtigt at huske at vaske sieren omhyggeligt, når du opsamler epitel for at sikre, at der ikke er stromale forurenende stoffer. For at forespørge på ændringerne i genekspressionen kan forskerne indsamle RNA fra organoiderne ved at frigive dem fra den ekstracellulære matrix ved hjælp af en genoprettelsesløsning. Paraformaldehyd betragtes som farligt, og forskere bør bruge personlige værnemidler og arbejde inde i en røghætte, når du bruger dette reagens.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Mosaic zebrafisk Transgenese for Funktionel Genomisk analyse af kandidatlandenes Cooperative gener i Tumor Patogenese

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Generation af Parabiotic zebrafisk embryoner ved Kirurgisk Fusion af Udvikling Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Generation af iPSC-afledte menneskelige hjerne organoider til Model Tidlig forstyrrelser i nervesystemets

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

Overførsel af mammakirteldannende evne mellem mammale basale epithelceller og mammale luminale celler via ekstracellulære vesikler / eksosomer

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

En ny mammedisk fedtpudstransplantationsteknik til visualisering af fartøjsgenerering af vaskulære endotelceller

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation af standardiserede og reproducerbare forhjernen-type Cerebral Organoids fra menneskelige induceret pluripotente stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Generation af Organoids fra mus ekstrahepatisk galdeveje

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Generation af flercellede humane primære Endometriale Organoider

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Ekstra Cellulær Matrix-baseret og ekstra cellulær matrix-fri generation af Murine testikel organoider

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

Generation og kultur af lingualorganoider afledt af voksne musesmag stamceller

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...