Name: generation of mosaic mammary organoids by differential trypsinization
Uploaded: 2020-03-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization at JoVE.com

Wir danken Ben Abrams für die technische Unterstützung und Die Kernunterstützung des University of California, Santa Cruz (UCSC) Institute for the Biology of Stem Cells (IBSC). Wir danken Susan Strome und Bill Saxton für den Einsatz ihres Solamere Spinning Disk Confocal Microscope. Diese Arbeit wurde teilweise durch Stipendien an die UCSC vom Howard Hughes Medical Institute durch das James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study Program (S.R.), vom NIH (NIH GM058903) für die Initiative zur Maximierung der Studentenentwicklung (H.M.) und von der die National Science Foundation für ein Graduiertenforschungsstipendium (O.C. DGE 1339067) und durch ein Stipendium (A18-0370) des UC-Cancer Research Coordinating Committee (LH).

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of California, Santa Cruz, genehmigt.
1. Tag 1: Brustdrüsenverdauung
<ol><li>Bereiten Sie sich darauf vor, die MGs von reifen weiblichen Mäusen im Alter von 10-14 Wochen zu ernten.<ol>
<li>Führen Sie die Ernte auf einer offenen Bank unter aseptischen Bedingungen durch.</li>
		<li>Sterilisieren Sie alle chirurgischen Vorräte, Korkbretter und Stifte durch Autoklavieren und Einweic...

<ol>
	<li>Macias, H., Hinck, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+gland+development.">Mammary gland development.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).</li><li>Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+life+span+of+normal+and+preneoplastic+mouse+mammary+glands:+a+serial+transplantation+study.">The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).</li><li>Ip, M. M., Asch, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , (2000).</li><li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell.">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li><li>Stingl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells.">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li><li>Lasfargues, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+behavior+in+vitro+of+the+normal+mammary+epithelium+of+the+adult+mouse.+II.+Observations+on+the+secretory+activity.">Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity.</a> Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Orkin, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+tumor+producing+a+matrix+of+basement+membrane.">A murine tumor producing a matrix of basement membrane.</a> Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).</li><li>Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+secreted+proteins+of+mouse+mammary+epithelial+cells+by+the+collagenous+substrata.">Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata.</a> Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).</li><li>Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+mouse+mammary+epithelial+cells+with+collagen+substrata:+regulation+of+casein+gene+expression+and+secretion.">Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).</li><li>Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+extracellular+matrix+on+gene+expression:+is+structure+the+message?.">The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message?.</a> Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).</li><li>Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li><li>Jarde, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+and+Neuregulin1/ErbB+signalling+extends+3D+culture+of+hormone+responsive+mammary+organoids.">Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids.</a> Nature Commununications. 7, 13207 (2016).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity.">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+functional+role+of+E-+and+P-cadherins+in+mouse+mammary+ductal+morphogenesis+and+growth.">Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth.</a> Developmental Biology. 169 (2), 511-519 (1995).</li><li>Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desmosomal+adhesion+regulates+epithelial+morphogenesis+and+cell+positioning.">Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning.</a> Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).</li><li>Chanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells.">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).</li><li>Honvo-Houeto, E., Truchet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+Immunofluorescence+on+Frozen+Sections+of+Mouse+Mammary+Gland.">Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53179 (2015).</li><li>Macias, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLIT/ROBO1+signaling+suppresses+mammary+branching+morphogenesis+by+limiting+basal+cell+number.">SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number.</a> Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).</li><li>Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+transduction+of+mammary+stem+cells+for+analysis+of+gene+function+during+development+and+cancer.">Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer.</a> Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).</li><li>Smith, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VANGL2+regulates+luminal+epithelial+organization+and+cell+turnover+in+the+mammary+gland.">VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7079 (2019).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6 (9), e25661 (2011).</li><li>Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+human+reduction+mammoplasty+and+mastectomy+tissues+for+cell+culture.">Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e50011 (2013).</li><li>Marlow, R., Dontu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+breast+cancer+bone+metastatic+niche+in+complex+three-dimensional+cocultures.">Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).</li><li>Koledova, Z., Lu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+Fibroblast-Epithelium+Co-culture+Model+for+Understanding+Microenvironmental+Role+in+Branching+Morphogenesis+of+the+Mammary+Gland.">A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland.</a> Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).</li></ol>

Hier wird eine Methode vorgestellt, die detailliert darlegen, wie Forscher 3D-Organoidkulturen mit primären MG-Zellen erzeugen können. Der Unterschied zwischen diesem und anderen Protokollen besteht darin, dass wir eine Methode zur Trennung der beiden unterschiedlichen MG-Zellkompartimente detailliert beschreiben: die äußeren basalen MyoECs und die inneren LECs. Unsere Methode verwendet eine zweistufige Trypsin-EDTA (0,05%) Behandlung, die wir Differential-Trypsinisierung19nennen. Dieses Verfa...

Die Brustdrüse (MG) ist eine baumartige, röhrenförmige Epithelstruktur, die in eine adipozytenreiche Stroma eingebettet ist. Das zweischichtige duktale Epithel besteht aus einer äußeren, basalen Schicht aus kontraktilen, myoepithelialen Zellen (MyoECs) und einer inneren Schicht aus luminalen, sekretorischen Epithelzellen (LECs), die ein zentrales Lumenumschließen 1. Während der Stillzeit, wenn sich die äußeren MyoECs zusammenschließen, um Milch aus den inneren alveolarLECs zu pressen, erfährt das MG zahlreiche Veränderungen, die unter der Kontrolle von Wachstumsfaktoren (z. B. EGF und FGF) und Hormonen (z. B. Progesteron, Insulin und Prolaktin) stehen. Diese Veränderungen verursachen die Differenzierung von spezialisierten Strukturen, Alveolen, die Milch während der Laktation1synthetisieren und absondern. Die Brustepithelie kann experimentell mit Techniken manipuliert werden, bei denen entweder Epithelgewebefragmente, Zellen oder sogar eine einzelne Basalzelle in Brustfettpolster transplantiert, von endogenem Brustparenchym vorgereinigt und auswachsen lassen, um einen ganzen, funktionellen Epithelbaum2,3,4,5zu rekonstruieren. Transplantation ist eine leistungsfähige Technik, aber es ist zeitaufwändig und unmöglich, wenn eine Mutation zu einer frühen embryonalen Letalität (vor E14) führt, die die Rettung von transplantierbaren Brustanlagen verhindert. Darüber hinaus möchten die Forscher häufig die Rollen der beiden verschiedenen Kompartimente erforschen, die aus linienbeschränkten Vorläuferzellen abgeleitet sind. Während die Cre-lox-Technologie die differenzielle genetische Manipulation von MyoECs und LECs ermöglicht, ist dies auch ein zeitaufwändiges und teures Unterfangen. So haben die Forscher seit den 1950er Jahren In-vitro-Mammariide als relativ einfache und effiziente Möglichkeit verwendet, Um Fragen zur Brustgewebestruktur und -funktion6,7zu beantworten.
In frühen Protokollen, die die Isolierung und Kultur der primären Epithelzellen der Brust beschreiben, fanden die Forscher heraus, dass eine Kellermembranmatrix (BME), bestehend aus einem Plasmagerinnsel und Einem Hühnerembryonalextrakt, für MG-Fragmente erforderlich war, die auf einer Schale6angebaut wurden. In den folgenden Jahrzehnten wurden extrazelluläre Matrizen (ECMs, Kollagen und geleeartige Proteinmatrix, die von Engelbreth-Holm-Swarm-Murine-Sarkomzellen sezerniert wurden) entwickelt, um die 3D-Kultur zu erleichtern und die in vivo-Umgebung7,8,9,10" besser nachzuahmen. Culturing Zellen in 3D-Matrizen durch mehrere Kriterien (Morphologie, Genexpression und Hormonreaktion) offenbart, dass eine solche Mikroumgebung besser Modelle in vivo physiologische Prozesse9,10,11,12. Die Forschung mit primären murinen Zellen identifizierte wichtige Wachstumsfaktoren und Morphogene, die für die erweiterte Erhaltung und Differenzierung von Organoiden notwendig sind13. Diese Studien haben die Voraussetzungen für das hier vorgestellte Protokoll und für die Kultur menschlicher Brustzellen als 3D-Organoide bereitet, die heute ein modernes klinisches Werkzeug ist, das die Entdeckung von Arzneimitteln und Arzneimitteltests an Patientenprobenermöglicht 14. Insgesamt hebt die organoide Kultivierung die Selbstorganisationskapazitäten von Primärzellen und ihre Beiträge zur Morphogenese und Differenzierung hervor.
Präsentiert hier ist ein Protokoll zu Kultur murin epithelia, die in Milch produzierenden Acini unterschieden werden kann. Eine differenzielle Trypsinisierungstechnik wird verwendet, um die MyoECs und LECs zu isolieren, aus denen die beiden unterschiedlichen MG-Zellkompartimente bestehen. Diese getrennten Zellfraktionen können dann genetisch manipuliert werden, um die Genfunktion zu überexpressen oder zu klopfen. Da die Linienintrinsinin, die Selbstorganisation eine angeborene Eigenschaft der Epithelzellen der Brust15,16,17ist, ermöglicht die Rekombination dieser Zellfraktionen den Forschern, bilayerierte Mosaik-Organoide zu erzeugen. Wir beginnen damit, das Fettgewebe enzymatisch zu verdauen und dann die Brustfragmente auf einer Gewebekulturschale für 24 h zu inkubieren (Abbildung 1). Die Gewebefragmente setzen sich auf Polystyrolschalen als zweischichtige Fragmente mit ihrer In-vivo-Organisation ab: äußere myoepitheliale Schicht, die innere Luminalschichten umgibt. Diese zelluläre Organisation ermöglicht die Isolierung der äußeren MyoECs durch Trypsin-EDTA (0,05%) Behandlung für 3-6 min gefolgt von einer zweiten Runde Trypsin-EDTA (0,05%) Behandlung, die die verbleibenden inneren LECs löst (Abbildung 2). Somit werden diese Zelltypen mit unterschiedlicher Trypsinempfindlichkeit isoliert und können anschließend in ECM gemischt und plattiert werden (Abbildung 3). Die Zellen durchlaufen eine Selbstorganisation, um zweischichtige Kugeln zu bilden, die eine äußere Schicht von MyoECs umgeben, die innere LECs umgeben. Lumenbildung tritt auf, wenn die Zellen in einem Medium wachsen, das einen Cocktail von Wachstumsfaktoren enthält (siehe Rezepte für Growth Medium)13. Nach 5 Tagen können Organoide durch Umschalten auf Alveologenese Medium (siehe Rezepte und Abbildung 3F)in milchproduzierende Acini differenziert und für weitere 5 Tage inkubiert werden. Alternativ werden Organoide für mindestens 10 Tage weiter expandieren und in Growth Medium verzweigen. Organoide können mit Immunfluoreszenz (Abbildung 3D-F) analysiert oder aus dem ECM mit einer Wiederherstellungslösung freigesetzt werden (siehe Materialtabelle) und mit anderen Methoden (z. B. Immunoblot, RT-qPCR) analysiert werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well ultra-low attachment plate (Corning)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CLS3473-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M nylon cell strainer (Corning)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Pen/Strep also works</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement without vitamin A (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6 ACTb-EGFP mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>003291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin syringe 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class 2 Dispase (Roche)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class 3 Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Recovery solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>354253</td>
			<td>Follow the guidelines for use &#8211; Extraction of Three-Dimensional Structures 
			from Corning Matrigel Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CLS3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4902-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase (Deoxyribonuclease I)</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS002007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21447</td>
			<td>Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-606-150</td>
			<td>Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330-057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>Without Mg2+/Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AF-100-15-100ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068&#8211;085</td>
			<td>100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G (Southern Biotech)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Referred to as mounting media in text</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-WAP</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>SC-14832</td>
			<td>Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 &#181;g/mL, RRID:AB_677601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>AS-83218</td>
			<td>Use 1:2000, stock is 20mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I6634-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRT14&#8211;CreERtam</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>5107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40230C</td>
			<td>Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MillexGV Filter Unit 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td>These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SMA</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S671-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S468-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrg1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5898-NR-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovine Pituitary Prolactin</td>
			<td>National Hormone and Peptide Program</td>
			<td></td>
			<td>Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldahyde</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PX0055-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R26R-EYFP</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho inhibitor Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Filtered Donkey Serum</td>
			<td>Equitech-Bio Inc.</td>
			<td>SD30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Filtered Donkey Serum</td>
			<td>Equitech-Bio Inc.</td>
			<td>SD30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>x100-500ML</td>
			<td>Laboratory grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of mosaic mammary organoids by differential trypsinization

Organoide bieten selbstorganisierende, dreidimensionale Gewebestrukturen, die physiologische Prozesse in der Bequemlichkeit einer Schale rekapitulieren. Die murine Brustdrüse besteht aus zwei unterschiedlichen Epithelzellfächern, die verschiedene Funktionen erfüllen: das äußere, kontraktile myoepitheliale Fach und das innere, sekretorische Luminalfach. Hier beschreiben wir eine Methode, mit der die Zellen, die diese Kompartimente bilden, isoliert und dann kombiniert werden, um ihre individuellen Abstammungsbeiträge zur Brustdrüsenmorphogenese und Differenzierung zu untersuchen. Die Methode ist einfach und effizient und erfordert keine ausgeklügelten Trenntechnologien wie die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung. Stattdessen ernten und verdauen wir das Gewebe enzymatisch, säen das Epithel auf anhaftenden Gewebekulturgerichten und verwenden dann die Differential-Trypsinisierung, um Myoepithel von Leuchtzellen mit einer Reinheit von 90 % zu trennen. Die Zellen werden dann in einer extrazellulären Matrix plattiert, wo sie sich in zweischichtige, dreidimensionale (3D) Organoide organisieren, die differenziert werden können, um Milch nach 10 Tagen in der Kultur zu produzieren. Um die Auswirkungen genetischer Mutationen zu testen, können Zellen aus Wildtyp- oder gentechnisch veränderten Mausmodellen geerntet oder vor der 3D-Kultur genetisch manipuliert werden. Diese Technik kann verwendet werden, um Mosaik-Organoide zu erzeugen, die die Untersuchung der Genfunktion speziell im Luminal- oder Myoepithelfach ermöglichen.

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine Methode zur Untersuchung spezifischer Abstammungsbeiträge von Brustepithelzellen durch die Verwendung von Mosaikorganoiden. Um primäre murine Zellen für Organoide zu erhalten, muss das Brustdrüsenepithel zuerst aus dem umgebenden Adipozyten-reichen Stroma isoliert werden (Abbildung 1). Dieser Prozess wird hier kurz beschrieben und auch in einer zuvor veröffentlichten Studie18beschrie...

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Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Die Brustdrüse ist eine zweischichtige Struktur, die äußere myoepitheliale und innere luminale Epithelzellen umfasst. Präsentiert ist ein Protokoll zur Vorbereitung von Organoiden mit Differential-Trypsinisierung. Diese effiziente Methode ermöglicht es Forschern, diese beiden Zelltypen getrennt zu manipulieren, um Fragen über ihre Rolle in der Form und Funktion der Brustdrüse zu untersuchen.

Generierung von Mosaik-Mammary-Organoiden durch Differential-Trypsinisierung

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Unsere Methode ist von Bedeutung, weil sie es Forschern ermöglicht, verschiedene Zelltypen zu isolieren und zu manipulieren, um ihre individuellen Abstammungsbeiträge zur Gewebeform und -funktion zu untersuchen. Diese Technik ist eine sanfte und effiziente Methode zum Trennen von Zelltypen, sodass die Integrität der Zellen für die 3D-Kultur erhalten bleibt. Diese Technik kann auch auf andere Systeme angewendet werden, um Zellen zu isolieren, die keine gut charakterisierten Biomarker haben.Um die Nummer zwei, drei, vier und fünf Brustdrüsen von einer 10 bis 14 Wochen alten weiblichen Maus zu ernten, machen Sie zuerst einen einen Zentimeter Schnitt an der Mittellinie zwischen den beiden Hinterbeinen. Verlängern Sie den Schnitt bis zum Hals und machen Sie kleine seitliche Schnitte vom Mittellinienschnitt in Richtung der Gliedmaßen. Dann dehnen Sie die Haut gelehrt, bevor Sie es mit einem Stift auf jeder Seite des Tieres zu sichern.Mit Zangen, sammeln Sie die Lymphknoten aus der Zahl vier Drüsen. Um die Brustdrüsen zu entfernen, verwenden Sie scharfe Schere, um unter jede Region des Gewebes zu schneiden, die Platzierung der Gewebe in 50 Milliliter von vier Grad Celsius DMEM-F12 mit 5%FBS und Antimykotik bei der Ernte ergänzt. Wenn alle Gewebe gesammelt sind, hacken Sie die Drüsen, bis die Stücke leicht durch eine Ein-Milliliter-Pipette-Spitze passen können, die die Platte nach Bedarf dreht, so dass alle Gewebe gleichmäßig gehackt werden.Dann übertragen Sie die Fragmente in drei Milliliter Verdauungsmedium in einen einzigen Brunnen einer sechs-Well-niedrigen Haftschale für 14 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Am nächsten Morgen, sanft Pipette das Gewebe 10 Mal mit einem Milliliter Mikropipette und übertragen die Gewebefragmente in eine 15 Milliliter Rohr. Sammeln Sie das Gewebe durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in fünf Millilitern frischen DPBS.Filtern Sie die Suspension durch ein vornasses 70 Mikrometer Nylon-Zellsieb, spülen Sie das Rohr im Sieb viermal mit 10 Millilitern 37 Grad Celsius DMEM-F12 pro Waschgang. Um die Gewebefragmente freizugeben, halten Sie die Sieblasche mit den Handschuhen und kehren Sie das Sieb über eine 60-Millimeter-Gewebekulturschale um. Geben Sie vier Milliliter-Aliquots wartungsmittel durch den Boden des Siebs und untersuchen Sie schnell die Schale auf einzelne Zellen, Fetttröpfchen und kontaminierendes Gewebe unter einem invertierten Mikroskop.Legen Sie dann die Platte für 24 Stunden in den Zellkultur-Inkubator, damit die Gewebefragmente an der Schale haften und zweischichtige Fragmente erzeugen können. Um die Myoepithelzellen von den luminalen Epithelzellen zu trennen, spülen Sie die Schale mit einem Milliliter DPBS ab, bevor Sie den Zellen einen Milliliter frische0,5%trypsin-EDTA hinzufügen. Überwachen Sie die Verdauung sorgfältig unter einem invertierten Mikroskop.Die äußere Schicht der Myoepithelzellen beginnt sich innerhalb von drei bis sechs Minuten zu lösen. Wenn sich die Myoepithelzellen gelöst haben, übertragen Sie den Überstand in ein 15-Milliliter-Rohr, das zwei Milliliter 10%FBS in DPBS enthält. Ohne die luminalen Epithelzellen zu stören, spülen Sie die Schale vorsichtig mit zwei Millilitern DPBS ab, bevor Sie den verbleibenden Zellen einen frischen Milliliter Trypsin-EDTA hinzufügen.Nach sieben bis 15 Minuten die enzymatische Reaktion mit zwei Millilitern 10%FBS in PBS ablöschen und die Zellen in ein neues 15-Milliliter-Rohr übertragen. Es ist wichtig, die Zellen während der Differentialtrypsinisierung genau zu überwachen und die Zellen nicht zu verdauen. Wenn beide Fraktionen gesammelt wurden, zentrifugieren Sie die Zellen, um alle Restdissoziationsreagenz zu entfernen und die Pellets in 250 Mikroliter Wartungsmedium pro Tube wieder aufzusetzen.Nach dem Zählen jede Zellpopulation auf 1,2 mal 10 auf die vier Zellen pro Brunnenkonzentration in frischem Pflegemedium verdünnen. Fügen Sie 90 Mikroliter 50% extrazelluläre Matrix in DMEM-F12 ohne Phenolrot zu jedem Brunnen eines Acht-Well-Kammerschlittens hinzu. Wenn alle Brunnen beschichtet sind, verfestigen Sie die Basisschicht im Zellkultur-Inkubator für 30 Minuten.Während dieser Polymerisation sammeln Sie die Zellfraktionen durch Zentrifugation und setzen jede Population in 100 Mikrolitern von 10% extrazellulärer Matrix in 90% Wachstumsmedium pro Brunnen wieder aus. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter jeder Zellsuspension zu jedem Brunnen hinzu und lassen Sie die Kokulturen für 20 Minuten im Zellkultur-Inkubator sich nieder. Am Ende der Inkubation, sorgfältig 100 Mikroliter Wachstumsmedium an der Seite jeder Kammerwand hinzufügen und die Rutsche zum Zellkultur-Inkubator zurückgeben.Bildn ison die Zellen alle 24 Stunden, um ihr Wachstum zu verfolgen und sanft erneuern das Wachstumsmedium alle zwei bis drei Tage. Um die Organoide für die Immunfärbung zu fixieren, zum entsprechenden experimentellen Zeitpunkt, saugen Sie sorgfältig das Medium von jedem Dia abundundes und spülen Sie jeden Brunnen mit 200 Mikroliter DPBS pro Brunnen. Fixieren Sie die Organoide mit 200 Mikrolitern von vier Grad Celsius Paraformaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur, bevor Sie die Organoide mit 200 Mikrolitern 0,2% Glycin in DPBS pro Brunnen für 30 Minuten bei Raumtemperatur behandeln.Am Ende der Inkubation permeabilisieren Sie die Organoide mit 0,25%triton X-100 in DPBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von der Blockierung der unspezifischen Bindung mit 5%Eselserum oder dem entsprechenden Serum, das eine Stunde lang mit Schaukeln zu den Arten des sekundären Antikörpers in DPBS passt. Dann beschriften Sie die Zellen mit 125 bis 200 Mikrolitern der entsprechenden primären Antikörper von Interesse in 1%Eselserum in DPBS über Nacht bei vier Grad Celsius mit Schaukeln. Am nächsten Morgen mindestens zwei Mal mit 200 MikroliterDs plus Triton X-100 gut waschen, bevor die Organoide mit den entsprechenden fluoreszenzkonjugierten Sekundärantikörpern 45 Minuten lang bei Raumtemperatur mit lichtgeschütztem Schaukeln markiert werden.Dann waschen Sie dann jeden Brunnen zweimal mit frischem DPBS plus Triton X-100, wie gezeigt, und bilden Sie die Organoide durch Fluoreszenzmikroskopie nach Standardprotokollen ab. Nach 24 Stunden Inkubation haften gereinigte Epithelfragmente am Boden der Kulturschale und bilden flache Pfannkuchen-ähnliche Strukturen mit einer äußeren Schicht von Myoepithelzellen, die eine innere Schicht von luminalen Epithelzellen umschließen. Die Trypsin-Behandlung löst die Zellen differenziell, wobei sich die Myoepithelzellen zuerst lösen und als helle abgerundete Zellen erscheinen, die den Kern der verbleibenden quaderförmigen Luminalepithelzellen umschließen.Die Gesamtreinheit der beiden Zellkompartimente beträgt etwa 90%, gemessen an der Keratin-14- und E-Cadherin-Expression innerhalb der beiden Populationen. Nach 10 Tagen Kultur in 10% extrazellulärer Matrix auf einer 50%extrazellulären Matrixbasis, wie gezeigt, bildeten die myoepithelialen Luminalzellorganoide große verzweigte Strukturen mit gut entwickelten Lumen. Die Differenzierung am fünften Tag mit der Zugabe zu alveologenese Medium induziert die Bildung größerer, verzweigter milchhaltiger Organoide.Es ist wichtig, das Sieb beim Sammeln des Epithels sorgfältig zu waschen, um sicherzustellen, dass es keine stromalen Verunreinigungen gibt. Um die Veränderungen in der Genexpression abzufragen, können Forscher RNA aus den Organoiden sammeln, indem sie sie mithilfe einer Wiederherstellungslösung aus der extrazellulären Matrix freisetzen. Paraformaldehyd gilt als gefährlich und Forscher sollten persönliche Schutzausrüstung verwenden und in einer Dunstabzugshaube arbeiten, wenn sie dieses Reagenz verwenden.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Mosaic Zebrafisch Transgenese für Funktionelle Genomanalyse Candidate Cooperative Gene in Tumor Pathogenese

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Die Erzeugung von Parabiotic Zebrabärbling Embryonen, die durch chirurgische Fusion der Entwicklung Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Die Erzeugung von iPS-derived Human Brain Organoide auf Modell Frühe Störungen der neurologischen Entwicklung

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

Übertragung der Mamma-Drüsen-bildenden Fähigkeit zwischen Mamma-Basal-Epithelzellen und Mamma-Luminalzellen über extrazelluläre Vesikel / Exosomen

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Eine neuartige Mamma-Fat-Pad-Transplantationstechnik zur Visualisierung der Gefäßerzeugung von vaskulären endothelialen Stammzellen

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation von standardisierten und reproduzierbaren Vorderhirn-Typ zerebralen Organellen aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Generation von Organellen von Maus extrahepatische Gallenwege

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Generierung von mehrzelligen humanen primären Endometrium-Organoiden

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Extra Cellular Matrix-Based und Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Hodenorganoide

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

Erzeugung und Kultur von lingualen Organoiden aus adulten Mausgeschmacksstammzellen

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...