Name: generation of mosaic mammary organoids by differential trypsinization
Uploaded: 2020-03-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization at JoVE.com

カリフォルニア大学サンタクルス校(UCSC)幹細胞生物学研究所(IBSC)の技術支援とコアサポートに対して、ベン・エイブラムスに感謝します。私たちは、彼らのソラミアスピニングディスク共焦点顕微鏡の使用のためにスーザン・ストロームとビル・サクストンに感謝します。この研究は、ハワード・ヒューズ医学研究所からジェームズ・H・ギリアム・フェローシップ・フォー・アドバンスト・スタディ(S.R.)、NIH(NIH GM058903)から学生育成(H.M.)を最大化するためのイニシアチブの奨学金によって支えられた。大学院研究フェローシップ(O.C.DGE 1339067)とUCがん研究調整委員会(LH)からの助成金(A18-0370)による国立科学財団。

ここに記載されているすべての方法は、カリフォルニア大学サンタクルーズ校の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. 1日目:乳腺消化
<ol><li>成熟した雌マウスからMGを10〜14週齢で収穫する準備をする。<ol>
<li>無菌条件下で開いたベンチで収穫を行います。</li>
		<li>手術前に20分間70%アルコールをオートクレーブして浸漬して、すべての外科用?...

<ol>
	<li>Macias, H., Hinck, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+gland+development.">Mammary gland development.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).</li><li>Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+life+span+of+normal+and+preneoplastic+mouse+mammary+glands:+a+serial+transplantation+study.">The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).</li><li>Ip, M. M., Asch, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , (2000).</li><li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell.">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li><li>Stingl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells.">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li><li>Lasfargues, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+behavior+in+vitro+of+the+normal+mammary+epithelium+of+the+adult+mouse.+II.+Observations+on+the+secretory+activity.">Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity.</a> Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Orkin, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+tumor+producing+a+matrix+of+basement+membrane.">A murine tumor producing a matrix of basement membrane.</a> Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).</li><li>Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+secreted+proteins+of+mouse+mammary+epithelial+cells+by+the+collagenous+substrata.">Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata.</a> Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).</li><li>Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+mouse+mammary+epithelial+cells+with+collagen+substrata:+regulation+of+casein+gene+expression+and+secretion.">Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).</li><li>Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+extracellular+matrix+on+gene+expression:+is+structure+the+message?.">The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message?.</a> Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).</li><li>Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li><li>Jarde, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+and+Neuregulin1/ErbB+signalling+extends+3D+culture+of+hormone+responsive+mammary+organoids.">Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids.</a> Nature Commununications. 7, 13207 (2016).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity.">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+functional+role+of+E-+and+P-cadherins+in+mouse+mammary+ductal+morphogenesis+and+growth.">Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth.</a> Developmental Biology. 169 (2), 511-519 (1995).</li><li>Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desmosomal+adhesion+regulates+epithelial+morphogenesis+and+cell+positioning.">Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning.</a> Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).</li><li>Chanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells.">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).</li><li>Honvo-Houeto, E., Truchet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+Immunofluorescence+on+Frozen+Sections+of+Mouse+Mammary+Gland.">Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53179 (2015).</li><li>Macias, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLIT/ROBO1+signaling+suppresses+mammary+branching+morphogenesis+by+limiting+basal+cell+number.">SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number.</a> Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).</li><li>Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+transduction+of+mammary+stem+cells+for+analysis+of+gene+function+during+development+and+cancer.">Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer.</a> Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).</li><li>Smith, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VANGL2+regulates+luminal+epithelial+organization+and+cell+turnover+in+the+mammary+gland.">VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7079 (2019).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6 (9), e25661 (2011).</li><li>Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+human+reduction+mammoplasty+and+mastectomy+tissues+for+cell+culture.">Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e50011 (2013).</li><li>Marlow, R., Dontu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+breast+cancer+bone+metastatic+niche+in+complex+three-dimensional+cocultures.">Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).</li><li>Koledova, Z., Lu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+Fibroblast-Epithelium+Co-culture+Model+for+Understanding+Microenvironmental+Role+in+Branching+Morphogenesis+of+the+Mammary+Gland.">A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland.</a> Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).</li></ol>

ここでは、研究者が原発MG細胞を用いて3Dオルガノイド培養を生成する方法を詳述する方法を提示する。これと他のプロトコルの違いは、外側の基底筋筋と内側のLEDの2つの異なるMGセルコンパートメントを分離する方法を詳述していることです。当社の方法は、2段階のトリプシン-EDTA(0.05%)を採用しています我々は、微分トリプシン化19と呼ぶ治療.この手順により、研究者は?...

乳腺(MG)は、腺細胞の豊富なストロマの中に埋め込まれた木状の管状の上皮構造である。二層状管上皮は、収縮性の外部、基底層、筋上皮細胞(MyoIC)および内層のルミナル、分泌上皮細胞(LECs)を含み、中央内腔1を囲む。外側の筋膜が内側の肺胞のLECsからミルクを絞るために収縮する授乳中に、MGは成長因子(例えば、EGFおよびFGF)およびホルモン(例えばプロゲステロン、インスリンおよびプロラクチン)の制御下にある多数の変化を受ける。これらの変化は、授乳中にミルクを合成し、分泌する特殊な構造、Alveoliの分化を引き起こす1.乳腺上皮は、上皮組織断片、細胞、あるいは単一の基底細胞を宿主乳腺脂肪パッドに移植し、内因性乳腺核間腫を事前に取り除き、全体の機能的上皮樹を,3,4再構成するために成長させる技術を使用して実験的に操作,することができる。移植は強力な技術ですが、突然変異が移植可能な乳腺の救助を妨げる初期の胚致死性(E14以前)をもたらす場合、それは時間がかかり、不可能です。さらに、研究者はしばしば、系統制限付き前駆細胞に由来する2つの異なるコンパートメントの役割を研究したいと考えています。Cre-lox技術はMyoICとレクチの遺伝子操作を可能にしますが、これは時間と費用のかかる事業でもあります。したがって、1950年代以降、研究者は乳腺組織の構造と機能6に関する質問に比較的簡単かつ効率的な方法としてインビトロ乳腺オルガノイドを使用してきました6,7.
原発性乳腺上皮細胞の単離および培養を記述する初期のプロトコルにおいて、研究者は、血漿血栓と鶏胚抽出物で構成される基膜マトリックス(BME)が、皿6で成長したMG断片に必要であることを発見した。次の数十年の間に、細胞外マトリックス(ECM、コラーゲン、およびエンゲルブレス・ホルム-群れのマウス肉腫細胞によって分泌されるゼリー様タンパク質マトリックス)が開発され、生体内環境,7、8、9、108を模倣する3D培養を容易にした。9,107生体内の生理学的プロセスにおいてこのような微小環境により良いモデルが,,9、10、11、1210であることを複数の基準(形態、遺伝子発現、およびホルモン応答性)によって明らかにされた3Dマトリックスの細胞を培養する。1112一次マウス細胞を用いた研究では、オルガノイド13の拡張維持と分化に必要な主要な成長因子およびモルフォゲンを同定した。これらの研究は、ここで提示されるプロトコルの段階を設定し、ヒト乳房細胞の培養については、現在では現代の臨床ツールである3Dオルガノイドとして、患者サンプル14の創薬および薬物検査を可能にする。全体として、オルガノイド培養は、原発細胞の自己組織化能力と形態形成および分化への貢献を強調している。
ここで提示されるのが、乳を産生するアチーニに分化することができるマウス上皮を培養するためのプロトコルである。微分トリプシン法は、2つの異なるMGセルコンパートメントを構成するMyoICとLECを分離するために使用されます。これらの分離された細胞分画は、遺伝子操作して過剰発現またはノックダウン遺伝子機能を可能にする。系統固有の自己組織化は乳腺上皮細胞15、16、1716,の自然な15性質であるため、これらの細胞画分を組み換えて、研究者は二重層のモザイクオルガノイドを生成することができます。17脂肪組織を酵素的に消化し、その後、24時間組織培養皿上の乳腺断片をインキュベートすることから始めます(図1)。組織断片は、インビボ組織を有する二重層断片としてポリスチレン皿に沈着する:内層の明るさ層を取り巻く外筋上皮層。この細胞組織はトリプシンEDTA(0.05%)によって外側のMyoICの分離を可能にする3-6分の治療に続いてトリプシン-EDTAの第2ラウンド(0.05%)残りの内側のLEDを取り外す処理(図2)。したがって、異なるトリプシン感受性を有するこれらの細胞タイプは分離され、その後ECMで混合およびめっきすることができる(図3)。細胞は自己組織化を経て二重層球を形成し、内側のLEDを取り巻くMyoICの外層を含む。ルーメン形成は、細胞が成長因子のカクテルを含む培地で成長するにつれて起こる(成長培地のレシピを参照)13.5日後、オルボロジェネシス培地(レシピおよび図3Fを参照)に切り替えて、オルガノイドを乳産生アチーニに分化し、さらに5日間インキュベートすることができます。あるいは、オルガノイドは少なくとも10日間、成長培地で拡大し、分岐し続ける。オルガノイドは、免疫蛍光(図3D-F)を用いて分析するか、または回復溶液(材料表を参照)を用いてECMから放出し、他の方法(例えば、イムノブロット、RT-qPCR)を介して分析することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well ultra-low attachment plate (Corning)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CLS3473-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M nylon cell strainer (Corning)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Pen/Strep also works</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement without vitamin A (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6 ACTb-EGFP mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>003291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin syringe 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class 2 Dispase (Roche)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class 3 Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Recovery solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>354253</td>
			<td>Follow the guidelines for use &#8211; Extraction of Three-Dimensional Structures 
			from Corning Matrigel Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CLS3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4902-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase (Deoxyribonuclease I)</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS002007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21447</td>
			<td>Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-606-150</td>
			<td>Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330-057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>Without Mg2+/Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AF-100-15-100ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068&#8211;085</td>
			<td>100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G (Southern Biotech)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Referred to as mounting media in text</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-WAP</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>SC-14832</td>
			<td>Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 &#181;g/mL, RRID:AB_677601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>AS-83218</td>
			<td>Use 1:2000, stock is 20mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I6634-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRT14&#8211;CreERtam</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>5107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40230C</td>
			<td>Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MillexGV Filter Unit 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td>These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SMA</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S671-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S468-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrg1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5898-NR-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovine Pituitary Prolactin</td>
			<td>National Hormone and Peptide Program</td>
			<td></td>
			<td>Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldahyde</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PX0055-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R26R-EYFP</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho inhibitor Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Filtered Donkey Serum</td>
			<td>Equitech-Bio Inc.</td>
			<td>SD30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Filtered Donkey Serum</td>
			<td>Equitech-Bio Inc.</td>
			<td>SD30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>x100-500ML</td>
			<td>Laboratory grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of mosaic mammary organoids by differential trypsinization

オルガノイドは、料理の利便性の中で生理学的プロセスを再現する自己組織化された3次元組織構造を提供します。マウス乳腺は、外側、収縮性筋上皮コンパートメントおよび内側の分泌状の発光コンパートメントの異なる機能を提供する2つの異なる上皮細胞コンパートメントで構成されています。ここでは、これらの区画を含む細胞を単離し、結合して乳腺形態形成および分化に対する個々の系統の寄与を調べる方法を説明する。この方法は、シンプルで効率的であり、蛍光活性化細胞選別などの高度な分離技術を必要としません。代わりに、組織を収穫して酵素的に消化し、接着組織培養皿に上皮を播種し、次に微分トリプシン化を使用して、ミノエピテリアルと高精液を約90%の純度で結び付けます。その後、細胞は細胞外マトリックスにめっきされ、培養で10日後に牛乳を生産するために分化できる二重層三次元(3D)オルガノイドに組織化されます。遺伝子変異の影響をテストするために、細胞は野生型または遺伝子操作されたマウスモデルから採取することができ、または3D培養の前に遺伝子操作することができる。この技術は、特に、ルミナルまたはミオエピテリアルコンパートメントにおける遺伝子機能の調査を可能にするモザイクオルガノイドを生成するために使用することができる。

ここで提示されるプロトコルは、モザイクオルガノイドを利用して乳腺上皮細胞の特定の系統の寄与を調査するための方法を説明する。オルガノイドの原発性マウス細胞を得るには、乳腺上皮をまず周囲の豊富なジポサイトから分離する必要があります(図1)。このプロセスは、ここで簡単に説明し、また、以前に発表された研究18</...

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Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

乳腺は二重構造であり、外筋上皮および内皮上皮細胞を含む。提示は、微分トリプシン法を用いてオルガノイドを調製するためのプロトコルである。この効率的な方法により、研究者はこれら2つの細胞タイプを別々に操作して、乳腺の形態と機能における彼らの役割に関する質問を探求することができます。

微小トリプシン法によるモザイク乳腺オルガノイドの生成

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

私たちの方法は、研究者が組織の形態と機能に対する個々の系統の寄与を調査するために異なる細胞型を分離し、操作することを可能にするので、重要である。この手法は、細胞タイプを分離するための穏やかで効率的な方法であり、その結果、細胞の完全性が3D培養のために保存されます。この技術は、十分に特徴付けられているバイオマーカーを持たない細胞を分離するために他のシステムにも適用できます。.生後10~14週齢の雌マウスから2、3、4、5個の乳腺を収穫するには、まず2つの後肢の間の正中線で1センチメートルの切開を行う。首まで切り傷を伸ばし、中線の切開部から手足に向かって小さな横切りを行います。その後、動物の両側にピンでそれを固定する前に教えられた皮膚を伸ばします。鉗子を使用して、数4腺からリンパ節を収集する。乳腺を取り除くために、鋭いはさみを使用して組織の各領域の下で切断し、5%FBSと抗生物質抗抗薬を加えた4度の50ミリリットルのDMEM-F12に組織を収穫する。すべての組織が収集されたら、必要に応じてプレートを回転させる1ミリリットルのピペットチップを通して、すべての組織が均等にミンチされるように、部分が簡単に収まるまで腺を刻みます。その後、3ミリリットルの消化培地の断片を、摂氏37度と5%の二酸化炭素で14時間、6ウェル低接着皿の単一の井戸に移します。翌朝、1ミリリットルのマイクロピペットで組織を10回軽くピペットし、組織断片を15ミリリットルのチューブに移す。遠心分離によって組織を収集し、新鮮なDPBSの5ミリリットルでペレットを再中断します。プレウェット70マイクロメートルナイロンセルストレーナーを通してサスペンションをフィルタリングし、洗浄ごとに37°CのDMEM-F12の10ミリリットルでストレーナーでチューブを4回洗い流します。組織断片を解放するには、手袋をした指でストレーナータブを保持し、60ミリメートルの組織培養皿の上にストレーナーを反転させます。ストレーナーの底を通して維持媒体の4つの1ミリリットルのアリコートを渡し、逆顕微鏡の下で単一細胞、脂肪滴、および汚染組織の皿を素早く調べる。その後、細胞培養インキュベーターにプレートを24時間置き、組織断片が皿に付着し、二重層状の断片を生成するようにします。筋上皮細胞を発光上皮細胞から分離するには、新鮮な0.5%トリプシン-EDTAを1ミリリットルの新鮮な0.5%トリプシン-EDTAを細胞に加える前に、1ミリリットルのDPBSで皿を洗いす。逆顕微鏡で消化を注意深く監視します。筋上皮細胞の外層は3〜6分以内に剥離し始める。筋上皮細胞が剥離したら、上清をDPBSで10%FBSの2ミリリットルを含む15ミリリットルのチューブに移します。明るい上皮細胞を乱すことなく、残りの細胞に新鮮なミリリットルのトリプシンEDTAを加える前に、DPBSの2ミリリットルで皿をそっと洗いす。7~15分後、PBSで10%FBSの2ミリリットルで酵素反応を焼き付け、細胞を新しい15ミリリットルチューブに移します。微分トリプシン化中に細胞を注意深く監視し、細胞を過剰に消化しないことが重要です。両方の分画が採取された場合、遠心分離して細胞に残留解離試薬を除去し、1管当たり250マイクロリットルの維持培地でペレットを再懸濁する。計数後、各細胞集団を、新鮮な維持培地中のウェル濃度当たり4細胞に1.2倍10倍に希釈する。8ウェルチャンバースライドの各ウェルにフェノールレッドなしでDMEM-F12に50%細胞外マトリックスの90マイクロリットルを加えます。すべてのウェルがコーティングされたら、細胞培養インキュベーター内の基層を30分間固化する。この重合の間、遠心分離によって細胞画分を収集し、ウェル当たり90%の増殖培地で10%細胞外マトリックスの100マイクロリットルの各集団を再懸濁する。次に、各細胞懸濁液を100マイクロリットルずつ各ウェルに加え、共培養液を細胞培養インキュベーターで20分間沈着させます。インキュベーションの終了時に、各チャンバー壁の側面に100マイクロリットルの成長培地を慎重に加え、スライドを細胞培養インキュベーターに戻します。細胞を24時間ごとに画像化して成長を追跡し、2~3日ごとに成長培地を静かに更新します。免疫染色用のオルガノイドを固定するために、適当な実験時に、各スライドから培地を慎重に吸引し、各スライドを画像化し、各ウェルあたり200マイクロリットルのDPBSで十分にリンスする。オルガノイドを4度のパラホルムアルデヒド200マイクロリットルを室温で10分間固定してから、室温で30分間、DPBSあたり200マイクロリットルの0.2%グリシンでオルガノイドを治療します。インキュベーションの終了時に、DPBSで0.25%トリトンX-100でオルガノイドを室温で10分間透過させ、続いて5%ロバ血清またはDPBS中の二次抗体の種と一致する適切な血清による非特異的結合の遮断を揺らしながら1時間行う。次に、DPBSで1%ロバ血清に関心のある適切な一次抗体の125〜200マイクロリットルをロッキングで摂氏4度で一晩で標識します。翌朝、200マイクロリットルのDPBSとトリトンX-100でそれぞれ2回洗浄し、オルガノイドに適切な蛍光コンジュゲート二次抗体を室温で45分間標識し、光から保護されたロッキングを使用します。次に、新鮮なDPBSとトリトンX-100を使用してそれぞれを2回洗浄し、標準的なプロトコルに従って蛍光顕微鏡でオルガノイドを画像化します。24時間のインキュベーションの後、精製された上皮断片は、ミオエピテリアル細胞の外層を有する平らなパンケーキ様構造を形成する培養皿の底に付着し、ルミナル上皮細胞の内層を囲む。トリプシン治療は、ミオエピテリアル細胞を最初に剥離し、残りの立方体の明るい上皮細胞のコアを囲む明るい丸みを帯びた細胞として現れる細胞を差し出す。2つの細胞区画の全体の純度は、ケラチン-14および2つの集団内のEカドヘリン発現によって評価される約90%である。10%細胞外マトリックスで10日間培養した後、50%細胞外マトリックス塩基上で実証されたように、筋上皮細胞オルガノイドは、よく発達した内腔を有する大きな分岐構造を形成した。5日目の分化は、アルボロ産生培地に添加して、より大きく、より分岐した乳含有オルガノイドの形成を誘導する。上皮を採取する際には、ストロマ質の汚染物質がないことを確認するために、慎重にストレーナーを洗浄することを忘れないでください。遺伝子発現の変化を問い合わせるために、研究者は回収溶液を使用して細胞外マトリックスからRNAを放出することによって、オルガノイドからRNAを収集することができます。パラホルムアルデヒドは危険であると考えられ、研究者は個人的な保護具を使用し、この試薬を使用する際にヒュームフードの内部で作業する必要があります。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

腫瘍の病因に候補協同遺伝子の機能ゲノム解析のためのモザイクゼブラフィッシュ遺伝子導入

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

胞胚の開発の外科的融合による並体結合ゼブラフィッシュ胚の生成

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

初期の神経発達障害をモデル化するためのiPSC由来のヒト脳オルガノイドの生成

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

細胞外小胞/エキソソームを介した乳腺上皮細胞と乳房管腔細胞との間の乳腺形成能の伝達

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

血管内皮幹細胞の血管形成を視覚化するための新規乳腺脂肪移植技術

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

標準化され、再現性のある前脳型人間から脳オルガノイドの生成誘導多能性幹細胞

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

マウス肝外胆管からオルガノイドの生成

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

多細胞ヒト初等子宮内膜オルガノイドの生成

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

細胞外マトリックスベースおよび細胞外マトリックスフリーのマウス精巣オルガノイドの生成

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

成人マウス味幹細胞由来の舌下オルガノイドの生成と培養

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...