Name: generation of mosaic mammary organoids by differential trypsinization
Uploaded: 2020-03-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization at JoVE.com

우리는 캘리포니아 대학에서 기술 지원 및 핵심 지원을 벤 아브람스 감사합니다, 산타 크루즈 (UCSC) 줄기 세포의 생물학 연구소 (IBSC). 우리는 그들의 솔라미어 회전 디스크 공초점 현미경의 사용에 대한 수잔 스트롬과 빌 색스턴 감사합니다. 이 작품은 고등 연구 프로그램에 대한 제임스 H. 길리엄 펠로우십을 통해 하워드 휴즈 의학 연구소에서 UCSC에 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다 (S.R.), NIH에서 (NIH GM058903) 학생 개발을 극대화하기위한 이니셔티브에 대한 (H.M.) 대학원 연구 펠로우십 (O.C. DGE 1339067)과 UC-암 연구 조정위원회 (LH)의 보조금 (A18-0370)에 의해 국립 과학 재단.

여기에 설명된 모든 방법은 캘리포니아 대학 산타 크루즈의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1일차: 유선 소화
<ol><li>성숙한 암컷 마우스로부터 10-14주령의 MGs를 수확할 준비를 한다.<ol>
<li>무균 조건하에서 열린 벤치에서 수확을 수행하십시오.</li>
		<li>수술 전 20분 동안 70%의 알코올을 오토클레이브하고 담금으로써 모든 수술 용품, 코르크 보드 ...

<ol>
	<li>Macias, H., Hinck, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+gland+development.">Mammary gland development.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).</li><li>Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+life+span+of+normal+and+preneoplastic+mouse+mammary+glands:+a+serial+transplantation+study.">The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).</li><li>Ip, M. M., Asch, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , (2000).</li><li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell.">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li><li>Stingl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells.">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li><li>Lasfargues, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+behavior+in+vitro+of+the+normal+mammary+epithelium+of+the+adult+mouse.+II.+Observations+on+the+secretory+activity.">Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity.</a> Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Orkin, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+tumor+producing+a+matrix+of+basement+membrane.">A murine tumor producing a matrix of basement membrane.</a> Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).</li><li>Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+secreted+proteins+of+mouse+mammary+epithelial+cells+by+the+collagenous+substrata.">Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata.</a> Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).</li><li>Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li><li>Jarde, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+and+Neuregulin1/ErbB+signalling+extends+3D+culture+of+hormone+responsive+mammary+organoids.">Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids.</a> Nature Commununications. 7, 13207 (2016).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity.">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+functional+role+of+E-+and+P-cadherins+in+mouse+mammary+ductal+morphogenesis+and+growth.">Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth.</a> Developmental Biology. 169 (2), 511-519 (1995).</li><li>Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desmosomal+adhesion+regulates+epithelial+morphogenesis+and+cell+positioning.">Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning.</a> Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).</li><li>Chanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells.">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).</li><li>Honvo-Houeto, E., Truchet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+Immunofluorescence+on+Frozen+Sections+of+Mouse+Mammary+Gland.">Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53179 (2015).</li><li>Macias, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLIT/ROBO1+signaling+suppresses+mammary+branching+morphogenesis+by+limiting+basal+cell+number.">SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number.</a> Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).</li><li>Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+transduction+of+mammary+stem+cells+for+analysis+of+gene+function+during+development+and+cancer.">Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer.</a> Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).</li><li>Smith, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VANGL2+regulates+luminal+epithelial+organization+and+cell+turnover+in+the+mammary+gland.">VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7079 (2019).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6 (9), e25661 (2011).</li><li>Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+human+reduction+mammoplasty+and+mastectomy+tissues+for+cell+culture.">Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e50011 (2013).</li><li>Marlow, R., Dontu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+breast+cancer+bone+metastatic+niche+in+complex+three-dimensional+cocultures.">Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).</li><li>Koledova, Z., Lu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+Fibroblast-Epithelium+Co-culture+Model+for+Understanding+Microenvironmental+Role+in+Branching+Morphogenesis+of+the+Mammary+Gland.">A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland.</a> Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).</li></ol>

여기에서, 연구원은 1 차적인 MG 세포를 사용하여 3D organoid 문화를 생성할 수 있는 방법을 상세히 제시됩니다. 이 프로토콜과 다른 프로토콜의 차이점은 두 개의 별개의 MG 세포 구획인 외부 기저 MyoECs 및 내부 LEC를 분리하는 방법을 자세히 설명한다는 것입니다. 우리의 방법은 2 단계 트립신 EDTA (0.05 %)를 채택 우리가 차등 트립시니화 라고 하는 치료19. 이 절차는 연구원이 정교한 ?...

유방 선 (MG)는 지방세포가 풍부한 기질 안에 내장 된 나무 와 같은 관 상피 구조입니다. 이중층 덕트 상피는 수축성, 근상피세포(MyoECs) 및 중추세포의 내층, 분비상피세포(LEC)의 외부, 기저층을 포함하며, 중앙 루멘1을둘러싸고 있다. 외부 MyoECs 내부 폐포 LECs에서 우유를 짜내기 위해 계약 하는 동안 수 유 하는 동안, MG 성장 인자 (예를 들어, EGF 와 FGF) 그리고 호르몬 (예를 들어, 프로게스테론, 인슐린, 그리고 prolactin)의 통제 하에 수많은 변화를 겪는다. 이러한 변화는 수유 중 우유를 합성하고 분비하는 특수 구조인 폐포의 분화를 유발합니다1. 유방 상피계는 실험적으로 상피 조직 단편, 세포, 또는 단일 기저 세포가 숙주 유방 지방 패드로 이식되는 기술을 사용하여 조작될 수 있으며, 내인성 유방 parenchyma의 사전 제거, 전체, 기능상피트리2,,3,,4,,5를재구성하기 위해 성장하도록 허용된다. 이식은 강력한 기술이지만, 돌연변이가 초기 배아 치사(E14 이전)를 초래하여 이식 가능한 유방 조개 배의 구조를 방해하는 경우 시간이 많이 걸리고 불가능합니다. 게다가, 조사자는 수시로 계보 제한한 전구 세포에서 파생되는 2개의 다른 구획의 역할을 연구하고 싶습니다. Cre-lox 기술은 MyoECs및 LEC의 차등 유전자 조작을 허용하지만, 이것은 또한 시간과 비용이 많이 드는 사업입니다. 따라서, 1950년대 이후, 조사자들은 유선 조직 구조 및 기능에 관한 질문을 비교적 쉽고 효율적으로 해결하는 방법으로 시험관내 유방 유기체를사용해 왔으며6,7.
1차 유방 상피 세포의 분리 및 배양을 설명하는 초기 프로토콜에서, 연구자들은 플라즈마 혈전과 닭 배아 추출물로 구성된 지하 막 매트릭스(BME)가 접시에서 자란 MG 단편에 필요하다는 것을발견하였다 6. 다음 십년간에서, 세포외 매트릭스(Engelbreth-Holm-Swarm murine 육종 세포에 의해 분비된 EMS, 콜라겐 및 젤리같은 단백질 매트릭스)는 3D 배양을 촉진하고 생체 내 환경7,,8,,9,,10을더 잘 모방하기 위해 개발되었다. 3D 행렬에서 세포를 배양하는 것은 생체 내 생리학적과정9,,10,,11,,12에서이러한 미세환경이 더 나은 모델이라는 여러 기준(형태학, 유전자 발현 및 호르몬 반응성)에 의해 밝혀졌다. 1차 뮤린 세포를 이용한 연구는 오르가노이드의 확장된 유지 및 분화에 필요한 주요 성장 인자 및 모르포겐을확인하였다 13. 이러한 연구는 여기에 제시된 프로토콜에 대한 무대를 설정하고, 인간 유방 세포의 배양을 3D 오르가노이드로, 이는 현재 현대 임상 도구이며, 환자 샘플에 대한 약물 발견 및 약물 검사를 허용한다14. 전반적으로, 오르가노이드 배양은 1 차적인 세포의 자기 조직 수용량 및 형태 형성과 분화에 그들의 기여를 강조합니다.
여기서 제시된 것은 우유 생성 아시니로 분화될 수 있는 배양 뮤린 상피에 대한 프로토콜이다. 차동 트립시네화 기술은 2개의 별개의 MG 세포 구획을 구성하는 MyoECs 및 LECs를 격리하기 위하여 이용됩니다. 이 분리된 세포 분획은 그 때 유전자 기능을 과발현하거나 녹다운하기 위하여 유전으로 조작될 수 있습니다. 계보-내재성, 자기 조직은 유방 상피 세포의 타고난 속성이기 때문에15,,16,,17,이러한 세포 분획을 재조합하면 연구자들은 이중층, 모자이크 오르가노이드를 생성할 수 있다. 우리는 효소적으로 지방 조직을 소화하고 24 시간 동안 조직 배양 접시에 유방 조각을 배양하는 것으로 시작합니다(그림 1). 조직 단편은 생체 내 조직과 이중 층 조각으로 폴리스티렌 접시에 정착 : 내부 발광 층을 둘러싼 외부 근상피층 층. 이러한 세포 조직은 트립신-EDTA(0.05%)에 의한 외부 MyoECs의 격리를 허용합니다. 3-6분 동안 트립신-EDTA 2라운드(0.05%) 남은 내부 LES를 분리하는치료(그림 2). 따라서, 상이한 트립신 감도를 가진 이들 세포 유형은 단리되고 이후에 ECM에서 혼합 및 도금될 수있다(도 3). 세포는 내부 LEC를 둘러싼 MyoECs의 외부 층을 포함하는 이중 층구를 형성하기 위하여 자기 조직을 겪습니다. 루멘 형성은 세포가 성장 인자의 칵테일을 포함하는 배지에서 성장함에 따라 발생 (성장 매체에 대한 조리법 참조)13. 5일 후, 오르가노이드는 알베올로제네시스 배지(레시피 및 도 3F참조)로 전환하여 우유 생산 아시니로 분화하고 또 다른 5일 동안 배양할 수 있다. 대안적으로, 오르가노이드는 적어도 10일 동안 성장 배지에서 계속 확장및 분기될 것이다. 오르가노이드는 면역형광(도3D-F)을이용하여 분석하거나 회복용액을 사용하여 ECM으로부터 방출될 수 있다(물질표참조)하고 다른 방법들(예를 들어, 면역블롯, RT-qPCR)을 통해 분석될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well ultra-low attachment plate (Corning)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CLS3473-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M nylon cell strainer (Corning)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Pen/Strep also works</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement without vitamin A (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6 ACTb-EGFP mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>003291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin syringe 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class 2 Dispase (Roche)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class 3 Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Recovery solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>354253</td>
			<td>Follow the guidelines for use &#8211; Extraction of Three-Dimensional Structures 
			from Corning Matrigel Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CLS3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4902-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase (Deoxyribonuclease I)</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS002007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21447</td>
			<td>Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-606-150</td>
			<td>Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330-057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>Without Mg2+/Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AF-100-15-100ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068&#8211;085</td>
			<td>100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G (Southern Biotech)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Referred to as mounting media in text</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-WAP</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>SC-14832</td>
			<td>Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 &#181;g/mL, RRID:AB_677601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>AS-83218</td>
			<td>Use 1:2000, stock is 20mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I6634-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRT14&#8211;CreERtam</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>5107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40230C</td>
			<td>Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MillexGV Filter Unit 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td>These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SMA</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S671-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S468-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrg1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5898-NR-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovine Pituitary Prolactin</td>
			<td>National Hormone and Peptide Program</td>
			<td></td>
			<td>Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldahyde</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PX0055-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R26R-EYFP</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho inhibitor Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Filtered Donkey Serum</td>
			<td>Equitech-Bio Inc.</td>
			<td>SD30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Filtered Donkey Serum</td>
			<td>Equitech-Bio Inc.</td>
			<td>SD30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>x100-500ML</td>
			<td>Laboratory grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of mosaic mammary organoids by differential trypsinization

오르가노이드는 접시의 편리함으로 생리적 과정을 재연하는 자가 조직, 3차원 조직 구조를 제공합니다. 뮤린 유방 동맥은 두 개의 별개의 상피 세포 구획으로 구성되어 있으며, 외부, 수축성 근상피 구획 및 내부, 분비 발광 구획과 같은 서로 다른 기능을 제공합니다. 여기에서, 우리는 이 구획을 포함하는 세포가 유방 선 형태 형성 및 분화에 그들의 개별 적인 혈통 기여를 조사하기 위하여 단리되고 그 때 결합되는 방법을 기술합니다. 이 방법은 간단하고 효율적이며 형광 활성화 세포 선별과 같은 정교한 분리 기술이 필요하지 않습니다. 대신, 우리는 조직을 수확하고 효소적으로 소화하고, 부착 조직 배양 접시에 상피를 씨를 뿌린 다음 차동 트립시니화를 사용하여 ~ 90 % 순도의 발광 세포에서 근상추신을 분리합니다. 세포는 그 때 배양에 있는 10 일 후에 우유를 생성하기 위하여 분화될 수 있는 이중층, 3차원 (3D) organoids로 조직되는 세포외 매트릭스에서 그 때 도금됩니다. 유전 돌연변이의 효력을 시험하기 위하여는, 세포는 야생 모형 또는 유전으로 조작한 마우스 모형에서 수확될 수 있습니다, 또는 3D 문화 전에 유전으로 조작될 수 있습니다. 이 기술은 발광 또는 근상피 구획에서 특히 유전자 기능의 조사를 허용하는 모자이크 오르가노이드를 생성하는 데 사용될 수 있습니다.

여기에 제시된 프로토콜은 모자이크 오르가노이드를 이용하여 유방 상피 세포의 특정 혈통 기여를 조사하는 방법을 설명합니다. 오르가노이드에 대한 1 차적인 뮤린 세포를 얻으려면 유방 선 상피가 먼저 주변 지방세포 풍부 기질로부터 분리되어야합니다(그림 1). 이 과정은 여기에 간략하게 설명되며 또한 이전에 발표된 연구18에?...

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Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

유방 동맥은 외부 근상피 및 내부 발광 상피 세포를 포함하는 이중 층 구조입니다. 제시된 것은 차동 트립시니화를 이용하여 오르가노이드를 준비하는 프로토콜이다. 이 효율적인 방법은 연구원이 별도로 유선 양식 및 기능에 있는 그들의 역할에 관하여 질문을 탐구하기 위하여 이 2개의 세포 모형을 조작하는 것을 허용합니다.

차동 시도에 의한 모자이크 유방 오르가노이드 생성

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

우리의 방법은 연구원이 조직 형태 및 기능에 그들의 개별 혈통 기여의 조사를 위해 다른 세포 모형을 격리하고 조작하는 것을 허용하기 때문에 중요합니다. 이 기술은 세포 유형을 분리하기위한 부드럽고 효율적인 방법이며, 그 결과 세포의 무결성은 3D 배양을 위해 보존됩니다. 이 기술은 또한 잘 특징적인 바이오 마커가 없는 세포를 격리하기 위하여 그밖 시스템에 적용될 수 있습니다.10주에서 14주 된 암컷 마우스에서 2번, 3번, 4번, 5마리의 유방땀샘을 수확하기 위해 먼저 두 뒷다리 사이의 중간선에서 1센티미터 절개를 합니다. 잘라낸 것을 목까지 확장하고 중간선 절개에서 팔다리쪽으로 작은 측면 컷을 만듭니다. 그런 다음 동물의 양쪽에 핀으로 고정하기 전에 가르친 피부를 스트레칭합니다.집게를 사용하여 4번 땀샘에서 림프절을 수집합니다. 유방 땀샘을 제거하려면 날카로운 가위를 사용하여 조직의 각 영역 하에서 절단하여 50 밀리리터의 DMEM-F12를 수확할 때 5%의 FBS와 항생제 항mycotic으로 보충합니다. 모든 조직이 수집되면, 조각이 모든 조직이 균등하게 다진 되도록 필요에 따라 접시를 회전 1 밀리리터 파이펫 팁을 통해 쉽게 맞을 수 있을 때까지 땀샘을 잘라.그런 다음 3 밀리리터의 소화 매체에 조각을 섭씨 37도및 이산화탄소 5%에서 14시간 동안 6웰 저접착 접시의 단일 웰로 옮킨다. 다음 아침, 조직을 1밀리리터 마이크로파이프로 10번 부드럽게 피펫하고 조직 조각을 15밀리리터 튜브로 옮킨다. 원심분리에 의해 조직을 수집하고 신선한 DPBS의 5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단.미리 젖은 70 마이크로미터 나일론 셀 스트레이너를 통해 서스펜션을 걸러내고, 세척당 섭씨 37도의 10 밀리리터로 스트레이너에 튜브를 4번 헹구십시오. 조직 조각을 풀어, 장갑 손가락으로 여조 탭을 잡고 60 밀리미터 조직 문화 접시를 통해 여과기를 반전. 스트레이너의 바닥을 통해 유지 보수 매체의 4 밀리리터 알리쿼트를 전달하고 신속하게 단일 세포에 대한 접시를 검사, 지방 방울, 그리고 반전 현미경에서 조직을 오염.그런 다음 조직 파편이 접시를 부착하고 이중 층 조각을 생성 할 수 있도록 24 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 배치합니다. 발광 상피 세포에서 심근 세포를 분리하려면, 세포에 신선한 0.5 %의 트립신-EDTA의 1 밀리리터를 추가하기 전에 DPBS의 1 밀리리터로 접시를 헹구십시오. 반전된 현미경으로 소화를 주의 깊게 모니터링합니다.근피성 세포의 외부 층은 3~6분 이내에 분리되기 시작합니다. 근피성 세포가 분리되면, 상체세포를 DPBS에서 10%의 FBS 2밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브로 상수체를 옮기. 발광 상피 세포를 방해하지 않고, 나머지 세포에 트립신-EDTA의 신선한 밀리리터를 추가하기 전에 DPBS의 두 밀리리터로 접시를 부드럽게 헹구십시오.7-15 분 후, PBS에서 10 %의 FBS의 두 밀리리터와 효소 반응을 담금질하고 새로운 15 밀리리터 튜브로 세포를 전송합니다. 차동 트립시화 중에 세포를 면밀히 모니터링하고 세포를 과도하게 소화하지 않는 것이 중요합니다. 두 분획이 모두 수집되면, 세포를 원심분리하여 잔류 해리약을 제거하고 튜브당 유지 보수 배지의 250 마이크로리터에서 펠릿을 재중단한다.계산 후, 각 세포 집단을 신선한 유지 보수 배지에서 웰 농도당 4개의 세포로 1.2배 10배 희석한다. 8웰 챔버 슬라이드의 각 웰에 페놀 레드없이 DMEM-F12에 50 % 세포 외 매트릭스의 90 마이크로 리터를 추가합니다. 모든 우물이 코팅되면 세포 배양 인큐베이터의 기본 층을 30 분 동안 고화시하십시오.이 중합화 동안, 원심분리에 의해 세포 분획을 수집하고 잘 당 90% 성장 배지에서 10%의 세포외 매트릭스의 100 마이크로리터에서 각 인구를 재중단한다. 다음으로, 각 셀 현탁액의 100 마이크로리터를 각 우물에 추가하고 공동 배양이 세포 배양 인큐베이터에서 20 분 동안 정착 할 수 있도록합니다. 인큐베이션의 끝에서, 각 챔버 벽의 측면 아래로 성장 배지의 100 마이크로 리터를 신중하게 추가하고 세포 배양 인큐베이터로 슬라이드를 반환합니다.24시간마다 세포를 이미지하여 성장을 추적하고 2~3일마다 성장 배지를 부드럽게 갱신합니다. 면역 스테인링을 위한 오르가노이드를 고치려면 적절한 실험 시점에서 각 슬라이드에서 매질을 조심스럽게 흡면하여 각 슬라이드에서 매질을 이미지화하고 잘 200 마이크로리터의 DPBS로 잘 헹구십시오. 실온에서 10분간 섭씨 4도의 200마이크로리터로 오르가노이드를 고정한 후 실온에서 30분 동안 DPBS당 0.2%의 글리신 200마이크로리터로 오가노이드를 치료합니다.인큐베이션의 끝에서, 실온에서 10분 동안 DPBS에서 0.25%트리톤 X-100으로 오르가노이드를 투약한 다음, 5%당나귀 혈청또는 DPBS의 이차 항체종과 일치하는 적절한 혈청을 5%로 차단한다. 그런 다음 DPBS에서 하룻밤 사이에 1%당나귀 혈청에 관심 있는 125-200 마이크로리터로 세포를 4°C에서 흔들기로 라벨을 붙입니다. 다음 날 아침, DPBS 플러스 트리톤 X-100의 200 마이크로리터와 함께 각각 두 번 씻은 후, 오르가노이드를 적절한 형광으로 표시하기 전에 실온에서 45분 동안 이차 항체를 빛으로부터 보호합니다.그런 다음 신선한 DPBS 플러스 트리톤 X-100으로 각각 두 번 씻고 표준 프로토콜에 따라 형광 현미경으로 오르가노이드를 이미지화합니다. 24시간 의 배양 후, 정제된 상피 파편은 발광 상피 세포의 내부 층을 둘러싸고 있는 심근세포의 외부 층으로 평평한 팬케이크와 같은 구조를 형성하는 배양 접시의 바닥에 부착되었다. 트립신 치료는 근상체 세포가 먼저 분리되고 남아있는 입체 발광 상피 세포의 코어를 둘러싸고 밝은 둥근 세포로 나타나는 세포를 분화시합니다.두 세포 구획의 전반적인 순도는 두 집단 내에서 케라틴-14 및 E-cadherin 발현에 의해 평가된 약 90%이다. 입증된 바와 같이 50% 세포외 매트릭스 베이스에서 10%의 세포외 매트릭스에서 10일간의 배양 후, 근피피발상피 세포 오르가노이드는 잘 발달된 루멘을 가진 큰 분기 구조를 형성하였다. 폐포 발생 배지에 첨가된 5일째에 분화하면 더 크고 분지된 우유 함유 오르가노이드의 형성을 유도한다.기질 오염 물질이 없는지 확인하기 위해 상피를 수집할 때 스트레이너를 조심스럽게 씻는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 유전자 발현의 변화를 쿼리하기 위해 연구자들은 복구 용액을 사용하여 세포외 매트릭스에서 RNA를 방출하여 유기체로부터 RNA를 수집할 수 있습니다. Paraformaldehyde는 위험한 것으로 간주되며 연구원은 개인 보호 장비를 사용하고이 시약을 사용할 때 연기 후드 내부에서 작동해야합니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

종양의 병인에 후보 협동 유전자의 기능 게놈 분석을위한 모자이크 Zebrafish의 Transgenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

연구

발생학

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Blastulae 개발의 외과 융합에 의해 Parabiotic 제브라 피쉬 배아의 생성

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

IPSC 파생 된 인간의 두뇌 Organoids의 세대는 초기 신경 발달 장애를 모델링하기

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

extracellular vesicles / exosomes를 통한 유방 기초 상피 세포와 유방 Luminal 세포 사이 유선 형성 능력의 이전

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

혈관 내피 줄기 세포의 혈관 생성을 시각화하기위한 유방 팻 패드 이식 기술

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간에서 표준화 되 고 재현 가능한 개 타입 대뇌 Organoids의 생성 유도 만능 줄기 세포

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Organoids 마우스 Extrahepatic 담 즙 덕트에서의 세대

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

다세포 인간 1 차 자궁 내막 오르가노이드의 생성

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

추가 세포 매트릭스 기반 및 추가 세포 매트릭스 -Murine 고환 오르가노이드의 추가 세포 매트릭스 없는 생성

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

성인 마우스 맛 줄기 세포에서 파생 된 언어 오르가노이드의 생성 및 배양

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...