Name: generation of mosaic mammary organoids by differential trypsinization
Uploaded: 2020-03-11T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization at JoVE.com

Agradecemos a Ben Abrams pela assistência técnica e apoio do Instituto de Biologia de Células-Tronco da Universidade da Califórnia, Santa Cruz (UCSC). Agradecemos a Susan Strome e Bill Saxton pelo uso de seu Microscópio Confocal do Disco Giratório Solamere. Este trabalho foi apoiado em parte por subsídios à UCSC do Howard Hughes Medical Institute através do James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study program (S.R.), do NIH (NIH GM058903) para a iniciativa de maximizar o desenvolvimento estudantil (H.M.) e de a Fundação Nacional de Ciência para uma bolsa de pós-graduação em pesquisa (O.C. DGE 1339067) e por uma bolsa (A18-0370) do Comitê Coordenador de Pesquisa de Câncer da UC (LH).

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Califórnia, Santa Cruz.
1. Dia 1: Digestão da glândula mamária
<ol><li>Prepare-se para colher os GMs de camundongos maduros de 10 a 14 semanas de idade.<ol>
<li>Realize a colheita em um banco aberto condições assépticas.</li>
		<li>Esterilize todos os suprimentos cirúrgicos, placas de cortiça e pinos por autoclaving e imersão em 70% de álcool por 20 m...

<ol>
	<li>Macias, H., Hinck, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+gland+development.">Mammary gland development.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).</li><li>Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+life+span+of+normal+and+preneoplastic+mouse+mammary+glands:+a+serial+transplantation+study.">The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).</li><li>Ip, M. M., Asch, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , (2000).</li><li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell.">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li><li>Stingl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells.">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li><li>Lasfargues, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+behavior+in+vitro+of+the+normal+mammary+epithelium+of+the+adult+mouse.+II.+Observations+on+the+secretory+activity.">Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity.</a> Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).</li><li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions.">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li><li>Orkin, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+tumor+producing+a+matrix+of+basement+membrane.">A murine tumor producing a matrix of basement membrane.</a> Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).</li><li>Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+secreted+proteins+of+mouse+mammary+epithelial+cells+by+the+collagenous+substrata.">Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata.</a> Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).</li><li>Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+mouse+mammary+epithelial+cells+with+collagen+substrata:+regulation+of+casein+gene+expression+and+secretion.">Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).</li><li>Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+extracellular+matrix+on+gene+expression:+is+structure+the+message?.">The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message?.</a> Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).</li><li>Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li><li>Jarde, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+and+Neuregulin1/ErbB+signalling+extends+3D+culture+of+hormone+responsive+mammary+organoids.">Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids.</a> Nature Commununications. 7, 13207 (2016).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity.">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li><li>Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+functional+role+of+E-+and+P-cadherins+in+mouse+mammary+ductal+morphogenesis+and+growth.">Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth.</a> Developmental Biology. 169 (2), 511-519 (1995).</li><li>Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desmosomal+adhesion+regulates+epithelial+morphogenesis+and+cell+positioning.">Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning.</a> Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).</li><li>Chanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells.">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).</li><li>Honvo-Houeto, E., Truchet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+Immunofluorescence+on+Frozen+Sections+of+Mouse+Mammary+Gland.">Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53179 (2015).</li><li>Macias, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLIT/ROBO1+signaling+suppresses+mammary+branching+morphogenesis+by+limiting+basal+cell+number.">SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number.</a> Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).</li><li>Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+transduction+of+mammary+stem+cells+for+analysis+of+gene+function+during+development+and+cancer.">Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer.</a> Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).</li><li>Smith, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VANGL2+regulates+luminal+epithelial+organization+and+cell+turnover+in+the+mammary+gland.">VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7079 (2019).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells.">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li><li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6 (9), e25661 (2011).</li><li>Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+human+reduction+mammoplasty+and+mastectomy+tissues+for+cell+culture.">Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e50011 (2013).</li><li>Marlow, R., Dontu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+breast+cancer+bone+metastatic+niche+in+complex+three-dimensional+cocultures.">Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).</li><li>Koledova, Z., Lu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+Fibroblast-Epithelium+Co-culture+Model+for+Understanding+Microenvironmental+Role+in+Branching+Morphogenesis+of+the+Mammary+Gland.">A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland.</a> Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).</li></ol>

Aqui, um método é apresentado detalhando como os pesquisadores podem gerar culturas organóides 3D usando células MG primárias. A diferença entre este e outros protocolos é que detalhamos um método para separar os dois compartimentos de células MG distintos: os MyoECs basais externos e lecs internos. Nosso método emprega uma trypsin-EDTA de duas etapas (0,05%) tratamento que chamamos de trippsinização diferencial19. Este procedimento permite que os pesquisadores isolem MyoECs e LECs sem...

A glândula mamária (MG) é uma estrutura epitelia tubular em forma de árvore embutida dentro de um estroma rico em adrócitos. O epitélio ductal bicamada compreende uma camada externa, basal de contratura, células mioepitelélicas (MioECs) e uma camada interna de células epiteliais luminais e secretas (LECs), circundando um lúmen central1. Durante a lactação quando os MyoECs externos se contraem para espremer leite dos LECs alveolares internos, o MG sofre inúmeras alterações que estão o controle de fatores de crescimento (por exemplo, EGF e FGF) e hormônios (por exemplo, progesterona, insulina e prolactina). Essas alterações causam a diferenciação de estruturas especializadas, aveoli, que sintetizam e secretam o leite durante a lactação1. A epitelia mamária pode ser manipulada experimentalmente usando técnicas nas quais fragmentos de tecido epitelial, células ou mesmo uma única célula basal são transplantados em almofadas de gordura mamária hospedeira, pré-limpas de parênquima mamária endógena, e permitidas a crescer para reconstituir uma árvore epitelial completaefuncional 2,3,4,5. O transplante é uma técnica poderosa, mas é demorada e impossível se uma mutação resultar em letalidade embrionária precoce (antes do E14) que impede o resgate de anlaga mamária transplantável. Além disso, os pesquisadores frequentemente desejam pesquisar os papéis dos dois compartimentos diferentes, que são derivados de células progenitoras restritas à linhagem. Embora a tecnologia Cre-lox permita a manipulação genética diferencial de MyoECs e LECs, esta também é uma empresa demorada e cara. Assim, desde a década de 1950, os pesquisadores têm usado organóides mamários in vitro como uma maneira relativamente fácil e eficiente de abordar questões relativas à estrutura e função do tecido mamário6,7.
Nos protocolos iniciais que descrevem o isolamento e a cultura das células epiteliais mamárias primárias, os pesquisadores descobriram que uma matriz de membrana de porão (BME), composta por um coágulo de plasma e extrato de embrião de frango, era necessária para fragmentos de MG cultivados em um prato6. Nas décadas seguintes, matrizes extracelulares (ECMs, colágeno e matriz de proteínas geleias secretadas por células de sarcoma de murina Engelbreth-Holm-Swarm) foram desenvolvidas para facilitar a cultura 3D e imitar melhor o ambiente in vivo7,8,9,10. O cultivo de células em matrizes 3D revelou por múltiplos critérios (morfologia, expressão genética e resposta hormonal) que tal microambiente melhor modela em processos fisiológicos vivos9,,10,,11,12. Pesquisas utilizando células murinaprimárias identificaram fatores-chave de crescimento e morfogênios necessários para a manutenção prolongada e diferenciação dos organóides13. Esses estudos prepararam o cenário para o protocolo aqui apresentado, e para a cultura das células mamárias humanas como organóides 3D, que hoje é uma ferramenta clínica moderna, permitindo a descoberta de medicamentos e testes de drogas em amostras de pacientes14. No geral, a cultura organóide destaca as capacidades de auto-organização das células primárias e suas contribuições para a morfogênese e diferenciação.
Apresentado aqui é um protocolo para a epiteria murina cultural que pode ser diferenciada em acini produtor de leite. Uma técnica diferencial de trypsinização é usada para isolar os MyoECs e LECs que compõem os dois compartimentos celulares MG distintos. Essas frações de células separadas podem então ser geneticamente manipuladas para superexpressá-la ou derrubar a função genética. Como a linhagem intrínseca, a auto-organização é uma propriedade inata das células epiteliais mamárias15,,16,17, recombinando essas frações celulares permite que os pesquisadores gerem organóides bicamadas e mosaicos. Começamos digerindo enzimticamente o tecido adiposo e, em seguida, incubando os fragmentos de mamária em um prato de cultura de tecido por 24 h (Figura 1). Os fragmentos de tecido se instalam em pratos de poliestireno como fragmentos bicamadas com sua organização in vivo: camada mioepitelial externa em torno de camadas luminais internas. Esta organização celular permite o isolamento dos MyoECs externos por trypsin-EDTA (0,05%) tratamento para 3-6 min seguido de uma segunda rodada de trypsin-EDTA (0,05%) tratamento que destaca os LECs internos restantes(Figura 2). Assim, esses tipos de células com sensibilidade à tripsina diferente são isolados e podem, posteriormente, ser misturados e banhados em ECM (Figura 3). As células passam por auto-organização para formar esferas bicamadas, compreendendo uma camada externa de MyoECs em torno de LECs internos. A formação de lúmen ocorre à medida que as células crescem em um meio contendo um coquetel de fatores de crescimento (ver receitas para o Meio de Crescimento)13. Após 5 dias, os organóides podem ser diferenciados em acini produtores de leite, mudando para Alveologenesis Medium (ver receitas e Figura 3F) e incubados por mais 5 dias. Como alternativa, os organóides continuarão a expandir-se e ramificar-se no Meio de Crescimento por pelo menos 10 dias. Os organóides podem ser analisados utilizando imunofluorescência(Figura 3D-F) ou liberados do ECM utilizando uma solução de recuperação (ver Tabela de Materiais) e analisados por outros métodos (por exemplo, imunoblot, RT-qPCR).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well ultra-low attachment plate (Corning)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CLS3473-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M nylon cell strainer (Corning)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Pen/Strep also works</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement without vitamin A (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6 ACTb-EGFP mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>003291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin syringe 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class 2 Dispase (Roche)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class 3 Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Cell Recovery solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>354253</td>
			<td>Follow the guidelines for use &#8211; Extraction of Three-Dimensional Structures 
			from Corning Matrigel Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CLS3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4902-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase (Deoxyribonuclease I)</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS002007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21447</td>
			<td>Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-606-150</td>
			<td>Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330-057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>Without Mg2+/Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AF-100-15-100ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068&#8211;085</td>
			<td>100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G (Southern Biotech)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Referred to as mounting media in text</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-WAP</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>SC-14832</td>
			<td>Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 &#181;g/mL, RRID:AB_677601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>AS-83218</td>
			<td>Use 1:2000, stock is 20mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I6634-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRT14&#8211;CreERtam</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>5107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40230C</td>
			<td>Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MillexGV Filter Unit 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td>These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SMA</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S671-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S468-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrg1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5898-NR-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovine Pituitary Prolactin</td>
			<td>National Hormone and Peptide Program</td>
			<td></td>
			<td>Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldahyde</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PX0055-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R26R-EYFP</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho inhibitor Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Filtered Donkey Serum</td>
			<td>Equitech-Bio Inc.</td>
			<td>SD30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Filtered Donkey Serum</td>
			<td>Equitech-Bio Inc.</td>
			<td>SD30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>x100-500ML</td>
			<td>Laboratory grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of mosaic mammary organoids by differential trypsinization

Organóides oferecem estruturas de tecidos tridimensionais auto-organizadas que recapitulam processos fisiológicos na conveniência de um prato. A glândula mamária murina é composta por dois compartimentos de células epiteliais distintos, servindo funções diferentes: o compartimento mioepitelal externo e contraído e o compartimento luminal interno e secreto. Aqui, descrevemos um método pelo qual as células que compõem esses compartimentos são isoladas e, em seguida, combinadas para investigar suas contribuições individuais de linhagem para morfogemeee e diferenciação da glândula mamária. O método é simples e eficiente e não requer tecnologias sofisticadas de separação, como a triagem celular ativada por fluorescência. Em vez disso, colhemos e digerimos enzimáticamente o tecido, sedeo o epitélio em pratos de cultura de tecido aderente e, em seguida, usamos a tripsinização diferencial para separar o mioepitelial das células luminais com ~90% de pureza. As células são então banhadas em uma matriz extracelular onde se organizam em organóides bicamadas tridimensionais (3D) que podem ser diferenciadas para produzir leite após 10 dias na cultura. Para testar os efeitos das mutações genéticas, as células podem ser colhidas de modelos de camundongos selvagens ou geneticamente modificados, ou podem ser geneticamente manipuladas antes da cultura 3D. Esta técnica pode ser usada para gerar organóides de mosaico que permitem a investigação da função genética especificamente no compartimento luminal ou mioepitelélico.

O protocolo aqui apresentado descreve um método para investigar contribuições específicas de linhagem de células epiteliais mamárias, fazendo uso de organóides de mosaico. Para obter células murinas primárias para organóides, o epitélio da glândula mamária deve primeiro ser isolado do estroma rico em adifrócito circundante(Figura 1). Este processo é descrito brevemente aqui e também é descrito em um estudo publicado anteriormente<sup class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization at JoVE.com

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

A glândula mamária é uma estrutura bicamada, composta por células epiteliais mioepiteleliais externas e internas. Apresentado é um protocolo para preparar organóides utilizando a tripspsinização diferencial. Este método eficiente permite que os pesquisadores manipulem separadamente esses dois tipos de células para explorar questões sobre seus papéis na forma e função da glândula mamária.

Geração de Organóides Mammary mosaicos por Trypsinização Diferencial

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Nosso método é significativo porque permite que os pesquisadores isolem e manipulem diferentes tipos de células para a investigação de suas contribuições individuais de linhagem à forma e função tecidual. Esta técnica é um método suave e eficiente para separar tipos de células e, como resultado, a integridade das células é preservada para a cultura 3D. Essa técnica também pode ser aplicada a outros sistemas para isolar células que não possuem biomarcadores bem caracterizados.Para colher as glândulas mamárias número dois, três, quatro e cinco de um rato fêmea de 10 a 14 semanas, primeiro faça uma incisão de um centímetro na linha média entre os dois traseiros. Estenda o corte até o pescoço e faça pequenos cortes laterais da incisão da linha média em direção aos membros. Em seguida, estique a pele ensinada antes de fixá-la com um alfinete em cada lado do animal.Usando fórceps, colete os linfonodos das glândulas número quatro. Para remover as glândulas mamárias, use uma tesoura afiada para cortar sob cada região do tecido, colocando os tecidos em 50 mililitros de quatro graus Celsius DMEM-F12 suplementados com 5% de FBS e antibiótico-antimíctico à medida que são colhidos. Quando todos os tecidos tiverem sido coletados, corte as glândulas até que as peças possam caber facilmente através de uma ponta de pipeta de um mililitro girando a placa conforme necessário para que todos os tecidos sejam picados uniformemente.Em seguida, transfira os fragmentos em três mililitros de meio de digestão em um único poço de um prato de seis poços de baixa adesão por 14 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Na manhã seguinte, pipeta suavemente os tecidos 10 vezes com uma micropipette de um mililitro e transfira os fragmentos de tecido em um tubo de 15 mililitros. Recolher o tecido por centrifugação e resuspensar a pelota em cinco mililitros de DPBS frescos.Filtre a suspensão através de um coador de células de nylon pré-molhado de 70 micrômetros, enxaguando o tubo no coador quatro vezes com 10 mililitros de 37 graus Celsius DMEM-F12 por lavagem. Para liberar os fragmentos de tecido, segure a aba do coador com os dedos enluvados e inverta o coador sobre um prato de cultura tecidual de 60 milímetros. Passe quatro alíquotas mililitros de meio de manutenção através da parte inferior do coador e examine rapidamente o prato para células únicas, gotículas de gordura e tecido contaminante sob um microscópio invertido.Em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura celular por 24 horas para permitir que os fragmentos de tecido aderam ao prato e gerem fragmentos bicamadas. Para separar as células mioepiteliais das células epiteliais luminais, enxágue o prato com um mililitro de DPBS antes de adicionar um mililitro de 0,5% de trippsina-EDTA fresco às células. Monitore cuidadosamente a digestão sob um microscópio invertido.A camada externa das células mioepithelialas começará a se desprender dentro de três a seis minutos. Quando as células mioepithelialas se separarem, transfira o supernante para um tubo de 15 mililitros contendo dois mililitros de 10% FBS em DPBS. Sem perturbar as células epiteliais luminais, enxágue suavemente o prato com dois mililitros de DPBS antes de adicionar um mililitro fresco de trypsin-EDTA às células restantes.Após sete a 15 minutos, sacie a reação enzimática com dois mililitros de 10% FBS na PBS e transfira as células para um novo tubo de 15 mililitros. É fundamental monitorar de perto as células durante a trippsinização diferencial e não digerir demais as células. Quando ambas as frações foram coletadas, centrifugar as células para remover qualquer reagente de dissociação residual e resuspensar as pelotas em 250 microliters de meio de manutenção por tubo.Após a contagem, diluir cada população celular para uma população de 1,2 vezes 10 para as quatro células por concentração de poço em meio de manutenção fresca. Adicione 90 microliters de matriz extracelular de 50% no DMEM-F12 sem fenol vermelho a cada poço de um slide de câmara de oito poços. Quando todos os poços tiverem sido revestidos, solidifique a camada base da incubadora de cultura celular por 30 minutos.Durante essa polimerização, colete as frações celulares por centrifugação e resuspenda cada população em 100 microlitadores de matriz 10% extracelular em 90% de crescimento médio por poço. Em seguida, adicione 100 microliters de cada poço e permita que as co-culturas se contentem por 20 minutos na incubadora de cultura celular. No final da incubação, adicione cuidadosamente 100 microliters de crescimento médio ao lado de cada parede da câmara e devolva o slide à incubadora de cultura celular.Imagem as células a cada 24 horas para acompanhar seu crescimento e renovar suavemente o meio de crescimento a cada dois ou três dias. Para corrigir os organoides para imunostaining, no momento experimental apropriado, aspire cuidadosamente o meio de cada slide a ser imageado e enxágue cada poço com 200 microliters de DPBS por poço. Fixar os organoides com 200 microlitadores de quatro graus Celsius paraformaldeído por 10 minutos à temperatura ambiente antes de tratar os organoides com 200 microlitrais de 0,2% de glicina em DPBS por poço por 30 minutos à temperatura ambiente.Ao final da incubação, permeabilize os organoides com 0,25% triton X-100 em DPBS por 10 minutos à temperatura ambiente seguido pelo bloqueio de ligação inespecífica com soro de burro de 5%ou o soro apropriado que corresponde à espécie do anticorpo secundário em DPBS por uma hora com balanço. Em seguida, rotule as células com 125 a 200 microliters dos anticorpos primários apropriados de interesse em 1% de soro de burro em DPBS durante a noite a quatro graus Celsius com balanço. Na manhã seguinte, lave cada poço duas vezes com 200 microlitadores de DPBS mais triton X-100 antes de rotular os organoides com os anticorpos secundários conjugados fluorescência apropriados por 45 minutos à temperatura ambiente com balanço protegido da luz.Em seguida, lave cada poço duas vezes com DPBS fresco mais triton X-100 como demonstrado e imagem os organoides por microscopia de fluorescência de acordo com os protocolos padrão. Após 24 horas de incubação, fragmentos epiteliais purificados aderiram ao fundo do prato de cultura formando estruturas planas semelhantes a panquecas com uma camada externa de células mioepithelialas circundando uma camada interna de células epiteliais luminais. O tratamento de trippsina destaca diferencialmente as células com as células mioepiteliais se desprendendo primeiro e aparecendo como células arredondadas brilhantes que circundam o núcleo das células epiteliais luminais cuboidas restantes.A pureza geral dos dois compartimentos celulares é de cerca de 90% avaliada pela expressão de queratina-14 e e-cadherina dentro das duas populações. Após 10 dias de cultura em matriz 10% extracelular em uma base de matriz 50% extracelular como demonstrado, os organoides de células epiteliais mioepitheliais formaram grandes estruturas ramificadas com lúmens bem desenvolvidos. A diferenciação no quinto dia com a adição ao meio da alveologênese induz a formação de organoides maiores e mais ramificados que contenham leite.É importante lembrar de lavar o filtro cuidadosamente ao coletar o epitélio para garantir que não haja contaminantes estrômicos. Para consultar as mudanças na expressão genética, os pesquisadores podem coletar RNA dos organoides liberando-os da matriz extracelular usando uma solução de recuperação. O paraformaldeído é considerado perigoso e os pesquisadores devem usar equipamentos de proteção individual e trabalhar dentro de uma coifa ao usar este reagente.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Mosaic Zebrafish Transgénese para Análise Funcional Genomic de candidatos Genes de cooperação em Tumor Patogênese

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

Biologia do Desenvolvimento

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Geração de parabiótica embriões Zebrafish por Fusion cirúrgica de Desenvolvimento blástulas

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Geração de iPSC-derivado do cérebro Organóides Humanos para modelar alterações precoces do desenvolvimento neurológico

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

Transferência de capacidade de formação de glândulas mamárias entre células epiteliais basais mamárias e células luminal mamárias através de vesículas / exossos extracelulares

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Uma nova técnica de transplante de almofada de gordura mamária para visualizar a geração de vasos de células vasculares endoteliais vasculares

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Geração de padronizada e reprodutível Forebrain-tipo Organoids Cerebral de humanos induzida por células-tronco pluripotentes

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Geração de Organoids de vias biliares extra-hepáticas Mouse

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Geração de organóides endometriais primários humanos multicelulares

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Geração extra-baseada em matriz celular e extra-celular livre de organoides testiculares de murina

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

Geração e Cultura de Organoides Linguais Derivados de Células-Tronco do Gosto de Rato Adulto

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...