Name: quantifying liver size in larval zebrafish using brightfield microscopy
Uploaded: 2020-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy at JoVE.com

نود أن نعترف تورين هوبز والموارد الحيوانية حمار وحشي مركزي (CZAR) في جامعة يوتا لتوفير تربية حمار وحشي، والفضاء المختبري، والمعدات اللازمة لتنفيذ أجزاء من هذا البحث. ويدعم التوسع في CZAR جزئيا من قبل منحة المعاهد القومية للصحة # 1G20OD018369-01. ونود أيضا أن نشكر رودني ستيوارت، كلوي ليم، لانس غراهام، كودي جيمس، غاريت نكوم، ومعهد هانتسمان للسرطان (HCI) مرفق حمار وحشي لرعاية حمار وحشي. نود أن نشكر كينيث كومباس للمساعدة في البرمجة R. تم تمويل هذا العمل جزئيا ً من خلال منح من مؤسسة هانتسمان للسرطان (بالتزامن مع المنحة P30 CA042014 الممنوحة لمعهد هانتسمان للسرطان) (KJE) وNIH/NCI R01CA222570 (KJE).

يتم إجراء الدراسات الحيوانية بعد الإجراءات المعتمدة من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها (IACUC) في جامعة يوتا.
1. إصلاح اليرقات
<ol><li>في 3-7 أيام بعد الإخصاب (dpf), القتل الرحيم اليرقات مع الميثان سولفونات التريكين (0.03%) وجمع ما يصل إلى 15 يرقة في أنبوب 2 مل باستخدام ماصة ز...

<ol>
	<li>Lin, D. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+Epigenomic+Heterogeneity+of+Hepatocellular+Carcinoma.">Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).</li><li>Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+hepatocellular+carcinoma:+Epidemiology,+etiology,+and+carcinogenesis.">Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis.</a> Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).</li><li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Chemical+Inhibitors+of+&#946;-Catenin-Driven+Liver+Tumorigenesis+in+Zebrafish.">Identification of Chemical Inhibitors of &#946;-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).</li><li>Kalasekar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+beta-catenin+activation+is+sufficient+to+cause+hepatocellular+carcinoma+in+zebrafish.">Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish.</a> Biology Open. 8 (10), (2019).</li><li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+level+of+liver-specific+expression+of+oncogenic+Kras(V12)+drives+robust+liver+tumorigenesis+in+transgenic+zebrafish.">A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).</li><li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+kras(V12)+transgenic+zebrafish+model+for+liver+tumorigenesis+and+chemical+drug+screening.">An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+liver+tumor+model+with+inducible+Myc+expression+reveals+conserved+Myc+signatures+with+mammalian+liver+tumors.">A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).</li><li>Cox, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yap+reprograms+glutamine+metabolism+to+increase+nucleotide+biosynthesis+and+enable+liver+growth.">Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth.</a> Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).</li><li>Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+the+mutants+vps18,+nf2+and+foie+gras+as+models+of+liver+disease.">A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease.</a> Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).</li><li>Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tumor+models+in+transgenic+zebrafish:+an+alternative+in+vivo+approach+to+study+hepatocarcinogenes.">Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes.</a> Future Oncology. 8 (1), 21-28 (2012).</li><li>Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-Associated+Neutrophils+and+Macrophages+Promote+Gender+Disparity+in+Hepatocellular+Carcinoma+in+Zebrafish.">Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish.</a> Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).</li><li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research.">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).</li><li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+plus+high+cholesterol+diet+lead+to+hepatic+steatosis+in+zebrafish+larvae:+a+novel+model+for+screening+anti-hepatic+steatosis+drugs.">High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs.</a> Nutrition &amp; Metabolism. 12, 42 (2015).</li><li>Kim, S. -. H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+of+tuberous+sclerosis+complex+reveals+cell-autonomous+and+non-cell-autonomous+functions+of+mutant+tuberin.">Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).</li><li>Delous, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9b+is+a+key+regulator+of+pancreaticobiliary+ductal+system+development.">Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development.</a> PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).</li><li>Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+hepatic+competence+by+Fgf+signaling.">Restriction of hepatic competence by Fgf signaling.</a> Development. 138 (7), 1339-1348 (2011).</li><li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+helix-loop-helix+transcription+factor,+heart+and+neural+crest+derivatives+expressed+transcript+2,+marks+hepatic+stellate+cells+in+zebrafish:+analysis+of+stellate+cell+entry+into+the+developing+liver.">The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).</li></ol>

القياس الكمي لحجم الكبد أمر بالغ الأهمية في الدراسات التي تهدف إلى فهم نمو الكبد، والتجدد، والأورام. البروتوكول الموصوف هنا هو تقنية سريعة نسبيا وسهلة ورخيصة لحجم الكبد في كمية حمار وحشي اليرقات. يمكن أن تساعد ممارسة الحذر المناسب أثناء تنفيذ جوانب معينة من البروتوكول في زيادة دقة النتائ...

سرطان الخلايا الكبدية (HCC) هو الخبيثة الأولية الأكثر شيوعا من الكبد1 والسبب الرئيسي الثالث للوفيات المرتبطة بالسرطان2. من أجل فهم أفضل لآليات الخلايا الكبدية وتحديد العلاجات HCC المحتملة، ونحن والآخرين قد وضعت حمار وحشي المعدلة وراثيا التي التعبير عن خلايا الكبد محددة من الأورام مثل α-catenin3،4،كراس (V12)5،6،Myc7،أو Yap18 يؤدي إلى HCC في الحيوانات البالغة. في هذه الحمار الوحشي، ويلاحظ تضخم الكبد في وقت مبكر من 6 أيام بعد الإخصاب (dpf)، وتوفير منصة سهلة لاختبار آثار الأدوية والتعديلات الوراثية على نمو الكبد التي يحركها الأوجين. القياس الدقيق والدقيق لحجم الكبد اليرقات ضروري لتحديد آثار هذه التلاعبات.
يمكن تقييم حجم الكبد وشكله شبه الكمي في يرقات حمار وحشي ثابتة من قبل CY3-SA وضع العلامات9 أو في يرقات حمار وحشي حية باستخدام مراسلين فلورسنت خاصين بالكبد وفلورسينس تشريح المجهر5،6. الطريقة الأخيرة سريعة نسبيا، ويمكن معالجة افتقارها إلى الدقة عن طريق تصوير وقياس مساحة كل كبد باستخدام برنامج معالجة الصور7،10. ومع ذلك ، يمكن أن يكون من الصعب تقنيًا وضع جميع اليرقات الحية بشكل موحد في تجربة بحيث تكون منطقة الكبد ثنائية الأبعاد تمثيلًا دقيقًا لحجم الكبد. تقنية مماثلة لقياس حجم الكبد ينطوي على استخدام المجهر ضوء ورقة مضان لتحديد حجم الكبد اليرقات8، والتي قد تكون أكثر دقة للكشف عن اختلافات الحجم عندما يتم توسيع الكبد غير موحد ة في أبعاد مختلفة. يمكن استخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS) لحساب عدد خلايا الكبد المسماة بالفلور سنتسنت وأنواع خلايا الكبد الأخرى في الكبد اليرقات8،11. في هذه الطريقة ، يتم تجميع الكبد اليرقات وفصلها ، لذلك يتم فقدان المعلومات حول حجم الكبد الفردي وشكله. في تركيبة مع طريقة أخرى لتحديد حجم الكبد، يتيح FACS التمايز بين زيادة عدد الخلايا (تضخم) وزيادة حجم الخلية (تضخم). كل هذه الأساليب تستخدم تكنولوجيا الفلورسينس مكلفة (المجهر أو فرز الخلايا) ، وباستثناء وضع العلامات CY3-SA ، تتطلب وضع علامات على خلايا الكبد مع مراسل الفلورسنت.
هنا نصف بالتفصيل طريقة لتحديد كمية حمار وحشي منطقة الكبد اليرقة باستخدام المجهر مشرق المجال ومعالجة الصور البرمجيات3،12،13،14. يتيح هذا البروتوكول التحديد الكمي الدقيق لمنطقة الكبد الفردية في الموقع دون استخدام المجهر الفلوري. أثناء تحليل حجم الكبد ، فإننا نعمي هوية الصورة للحد من تحيز المحقق وتحسين الصرامة العلمية15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Camera for dissecting microscope</td>
			<td>Leica, for example</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica, for example</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine (Dumont #5) forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Image J/FIJI</td>
			<td></td>
			<td>ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: <a href="https://imagej.net/Welcome" target="_blank">https://imagej.net/Welcome</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Various suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53502-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes</td>
			<td>USA Scientific Inc</td>
			<td>2906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 9-well round-bottom glass dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for blinding files</td>
			<td>R project</td>
			<td></td>
			<td>R can be downloaded for free: <a href="https://www.r-project.org/" target="_blank">https://www.r-project.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific graphing and statistics software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S)</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>200-226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Very fine (Dumont #55) forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying liver size in larval zebrafish using brightfield microscopy

في العديد من نماذج حمار وحشي معدلة وراثيا من سرطان الكبد الخلوي (HCC)، يمكن ملاحظة الأوميغا الكبدي خلال المراحل اليرقات المبكرة. يوفر تحديد حجم الكبد اليرقات يُقدم في نماذج HCC لسمك الحمار الوحشي وسيلة لتقييم آثار الأدوية وغيرها من التلاعبات على النمط الظاهري المرتبط بالأوكوجين بسرعة. هنا نعرض كيفية إصلاح يرقات سمك الحمار الوحشي ، وتشريح الأنسجة المحيطة بالكبد ، وتصوير الكبد باستخدام المجهر المشرق ، وقياس منطقة الكبد ، وتحليل النتائج. يتيح هذا البروتوكول قياسًا دقيقًا وسريعًا لحجم الكبد. وبما أن هذه الطريقة تنطوي على قياس منطقة الكبد، فقد تقلل من شأن الاختلافات في حجم الكبد، ويلزم منهجيات تكميلية للتمييز بين التغيرات في حجم الخلية والتغيرات في عدد الخلايا. تقنية تشريح وصفها هنا هو أداة ممتازة لتصور الكبد, الأمعاء, والبنكرياس في مواقعها الطبيعية لتطبيقات المصب لا تعد ولا تحصى بما في ذلك تلطيخ الفلورالمناعي والتهجين في الموقع. الاستراتيجية الموصوفة لقياس حجم الكبد اليرقات ينطبق على العديد من جوانب تطوير الكبد والتجدد.

حمار وحشي معدل وراثيا التعبير عن hepatocyte محددة تنشيط α-catenin(Tg (fabp10a: pt-α-cat) حمار وحشي)3 والأشقاء التحكم غير المعدلة وراثيا تم القتل الرحيم في 6 dpf ومنطقة الكبد تم قياسها كميا باستخدام المجهر الساطع ومعالجة الصور البرمجيات. وقد زادت أسماك الحمار الوحشي المعدلة وراثيا بشكل ?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy at JoVE.com

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

هنا نبين طريقة لقياس حجم الكبد في سمك الحمار الوحشي اليرقان، وتوفير وسيلة لتقييم آثار التلاعب الجيني والدوائي على نمو الكبد والتنمية.

تحديد حجم الكبد في لارفال زيبرافيش باستخدام المجهر برايتفيلد

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

توفر هذه الطريقة طريقة لقياس حجم الكبد في سمك الحمار الوحشي اليرقات. كما أنه يسمح لتقييم آثار التلاعب الوراثي والصيدلة على نمو الكبد والتنمية. هذه التقنية توفر طريقة سريعة ودقيقة لتصور وقياس الكبد وكذلك الأمعاء والبنكرياس.بالإضافة إلى قياس حجم الكبد، يمكن أن تكون طريقة التشريح هذه مفيدة لإعداد الكبد والأمعاء والبنكرياس للتهجين الموضعي أو التصوير confocal. قبل محاولة التدرب على اليرقات التجريبية، تأكد من أنك قضيت وقتًا طويلاً في ممارسة العينات غير التجريبية وأن يكون لديك معدل نجاح كبير. من المهم تصور التوجه السليم وحركة يرقات الحمار الوحشي والملوط من أجل إزالة الجلد دون إزعاج الأعضاء المحيطة.في غضون ثلاثة إلى سبعة أيام بعد الإخصاب ، بعد القتل الرحيم اليرقات ، واستخدام الماصات الزجاجية ومضخة ماصة لجمع ما يصل الى 15 يرقة في أنبوب ملليلتر اثنين. غسل اليرقات مرتين مع ملليلتر واحد من PBS 1X الباردة على الجليد. إزالة أكبر قدر من برنامج تلفزيوني ممكن باستخدام ماصة زجاجية ومضخة ماصة وإضافة ملليلتر واحد من PFA أربعة في المئة الباردة في برنامج تلفزيوني.احتضان في أربع درجات مئوية على الأقل بين عشية وضحاها مع هزاز لطيف. باستخدام ماصة زجاجية ومضخة ماصة، وإزالة PFA من الأنبوب وشطف ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني الباردة. صخرة لمدة خمس دقائق بين يشطف.الماصات عدة يرقات في PBS في بئر واحد من تسعة بئرين طبق زجاجي مستدير القاع. تحت المجهر، وإزالة الجلد المحيط الكبد باستخدام ملقط غرامة لعقد يرقة واحدة على ظهرها، تجتاح على جانبي الرأس بلطف ممكن. ثم استخدام ملقط غرامة جدا في اليد الأخرى للاستيلاء على الجلد فقط فوق القلب.سحب الجلد إلى أسفل قطريا نحو ذيل السمك في الجزء السفلي من الطبق على الجانب الأيسر أو الأيمن من الأسماك. كرر للجانب الآخر. مواصلة الاستيلاء على اللوحات من الجلد وسحب إلى أسفل حتى تم إزالة جميع الجلد والميلانوفورات الإفراط أو بالقرب من الكبد.إذا كان الصفار موجودًا لمدة خمسة إلى ستة أيام في يرقات ما بعد الإخصاب ، فرفع صفار اليرقات في قطعة واحدة عن طريق حمل السمك مع ملقط ناعم على ظهره واستخدام ملقط ناعم جدًا لدفع الصفار برفق. لمدة ثلاثة إلى أربعة يرقات DPF ، أمسك السمك مع ملقط ناعم على ظهره واستخدم ملقطًا ناعمًا جدًا لسكتة صفار البدء من الجانب البطني. كشط صفار قبالة في قطع.ضع اليرقات المُشرَّحة في برنامج PBS الطازج والبارد في أنبوب ملليلتر باستخدام ماصة زجاجية ومضخة ماصة. لتركيب اليرقات ، صب بضعة ملليلترات من ثلاثة في المئة ميثيلسيللوز على غطاء طبق بيتري نظيفة من البلاستيك. استخدام الماصات الزجاجية والميصة مضخة لإضافة اليرقات إلى ميثيل سيلولوز، مضيفا برنامج تلفزيوني أقل مع اليرقات قدر الإمكان.تحت مجهر تشريح في التكبير منخفضة، واستخدام ملقط غرامة لتوجيه الأسماك حتى أنها تكمن على الجانب الأيمن التي تواجه اليسار. تأكد من أن الأسماك التي سيتم تصويرها تتماشى تماما مع عين واحدة مباشرة على رأس العين الأخرى. إذا كان ذيل السمكة عازمًا ، فأزل الذيل عن طريق قرصه بقوة باستخدام ملقط لإزالته بحيث تضع السمكة مسطحًا.تكبير عالية في التكبير والتركيز على الكبد, التأكد من أن مخطط الكبد واضحة للعيان. اضغط على الزر التقاط صورة لالتقاط صورة وحفظ الملف. كرر جميع الأسماك، والتأكد من التكبير هو نفسه لكل صورة.التقاط صورة من ميكرومتر باستخدام التكبير نفسه. لاستخدام البرنامج R لتعمي جميع صور الكبد لتجنب التحيز المحقق المحتملة وتعزيز الدقة العلمية، وإعادة تسمية الملفات عشوائيا وإنشاء ملف العشوائية التي تحتوي على قائمة بأسماء الملفات الأصلية وأسماء الملفات المكفوفين المقابلة. فتح الملفات العشوائية في النظام، بدءا من ملف واحد.اختر أداة التحديدات الحرّة وحدد كل كبد. اضغط على التحكم-M لقياس مساحة كل كبد. لأية كبدات لا يمكن قياسها بدقة لأن لديها الجلد المتبقية، صفار، هي خارج التركيز، أو ليست سليمة، إدراج قياس العنصر النائب.حفظ القياسات في ملف نصي. إلى unblind وتحليل البيانات، افتح ملف القياسات وملف التعشية في برنامج جدول البيانات. إدراج عمود جديد في ملف القياسات وإضافة أسماء الملفات الأصلية للملفات المكفوفين باستخدام ملف التعشية.حفظ هذا الملف كملف قياسات غير معمَس. فرز البيانات حسب اسم الملف الأصلي. استبعاد أي قياسات الكبد التي لم تكن الصور كافية.إذا لزم الأمر، تحويل قيم القياس إلى مقياس المطلوب في ملليمتر مربع. افتح شريط المقياس في برنامج معالجة الصور. استخدم أداة Straight Straight Line لقياس ملليمتر واحد على شريط المقياس.ثم يقوم برنامج معالجة الصور بقياس نفس وحدات الكبد، مما يعطي عامل تحويل. استخدم عامل التحويل لتحويل القياسات في ملف القياسات غير المكفوفين. تحديد الانحراف المعياري والمتوسط ثم حساب قيم P.في ستة أيام بعد الإخصاب ، أظهرت يرقات حمار وحشي غير معدلة وراثيا الموقف الطبيعي وشكل الكبد فوق الأمعاء. وقد زادت حمار وحشي المعدلة وراثيا بشكل كبير حجم الكبد بالمقارنة مع الأشقاء غير المعدلة وراثيا. وتظهر هنا بعض الأمثلة على الصور غير الكافية والميكروفيتر.اليرقة مع الجلد الذي يغطي الكبد ، واليرقة مع صفار يحجب الكبد ، واليرقة مع أجزاء من الكبد مقروص قبالة ، واليرقة مع خلع الكبد والسقوط ، يرقة مع الكبد المفقود ، يرقة مع مخطط الكبد الذي يصعب تحديد ، واليرقة مع تحديد المواقع غير لائق. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم استخدام حركات صغيرة وخاضعة للسيطرة لمنع تلف الكبد. بالإضافة إلى المجهر مشرق المجال، يمكننا أيضا استخدام اليرقات تشريح بهذه الطريقة، للمجهر confocal، لتصور البروتينات مراسل الفلورسنت أو تلطيخ الفلورسنت المناعي، والتهجين في الموقع.الفورمالديهايد أو PFA هو مادة مسرطنة مهيجة ويشتبه. يجب ارتداء القفازات عند التعامل مع PFA وينبغي معالجة الحلول المركزة في غطاء أبخرة كيميائية.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

تصوير لايف الفطرية المناعي والتفاعلات سابق للورم الخلية باستخدام نظام التعبير / UAS محرض GAL4 في اليرقات الزرد الجلد

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

التقاط إصلاح الأنسجة في الزرد اليرقات مع الوقت الفاصل بين Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

تذرية الكبدية محددة في الزرد لدراسة يحركها صفراوية تجديد الكبد

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

تحليل التنمية الكلى الزرد مع الوقت الفاصل بين التصوير باستخدام مجهر تشريح مجهزة لباجتزاء البصري

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

باستخدام ورقة ضوء مضان المجهري لصورة التنمية الزرد العين

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

تشريح اليرقات الزرد الغدد التناسلية الأنسجة

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

التحاليل النسيجية لإصابات الكبد الكحولية الحادة في الزرد

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

القرار فائقة الارتباطية والميكروسكوب الإلكتروني لحل التعريب البروتين في الشبكية الزرد

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

إنشاء الزرد اليرقات "نموذج الحيوان" للتحقيق مثقبيه الكروزية حركية في فيفو

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...