Name: quantifying liver size in larval zebrafish using brightfield microscopy
Uploaded: 2020-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy at JoVE.com

Vi vil gerne anerkende Maurine Hobbs og den centraliserede Zebrafish Animal Resource (CZAR) ved University of Utah for at levere zebrafiskopdræt, laboratorierum og udstyr til at udføre dele af denne forskning. Udvidelse af Zar-familien understøttes til dels af NIH-tilskuddet # 1G20OD018369-01. Vi vil også gerne takke Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum, og Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility for zebrafisk pleje. Vi vil gerne takke Kenneth Kompass for hjælp med R programmering. Dette arbejde blev delvist finansieret af tilskud fra Huntsman Cancer Foundation (i samarbejde med tilskud P30 CA042014 tildelt Huntsman Cancer Institute) (KJE) og NIH/NCI R01CA22570 (KJE).

Dyreforsøg udføres efter procedurer, der er godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra University of Utah.
1. Fastsættelse Larver
<ol><li>På 3-7 dage efter befrugtning (dpf), euthanize larver med tricaine metanulfonat (0,03%) og saml op til 15 larver i et 2 ml rør ved hjælp af en glaspipette og pipettepumpe.</li>
	<li>Vask larver to gange med 1 ml koldt (4 °C) 1x fosfatbuffered saltvand (PBS) på is. For hver vask skal du fjerne så meget væske som muligt fra...

<ol>
	<li>Lin, D. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+Epigenomic+Heterogeneity+of+Hepatocellular+Carcinoma.">Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).</li><li>Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+hepatocellular+carcinoma:+Epidemiology,+etiology,+and+carcinogenesis.">Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis.</a> Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).</li><li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Chemical+Inhibitors+of+&#946;-Catenin-Driven+Liver+Tumorigenesis+in+Zebrafish.">Identification of Chemical Inhibitors of &#946;-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).</li><li>Kalasekar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+beta-catenin+activation+is+sufficient+to+cause+hepatocellular+carcinoma+in+zebrafish.">Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish.</a> Biology Open. 8 (10), (2019).</li><li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+level+of+liver-specific+expression+of+oncogenic+Kras(V12)+drives+robust+liver+tumorigenesis+in+transgenic+zebrafish.">A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).</li><li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+kras(V12)+transgenic+zebrafish+model+for+liver+tumorigenesis+and+chemical+drug+screening.">An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+liver+tumor+model+with+inducible+Myc+expression+reveals+conserved+Myc+signatures+with+mammalian+liver+tumors.">A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).</li><li>Cox, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yap+reprograms+glutamine+metabolism+to+increase+nucleotide+biosynthesis+and+enable+liver+growth.">Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth.</a> Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).</li><li>Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+the+mutants+vps18,+nf2+and+foie+gras+as+models+of+liver+disease.">A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease.</a> Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).</li><li>Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tumor+models+in+transgenic+zebrafish:+an+alternative+in+vivo+approach+to+study+hepatocarcinogenes.">Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes.</a> Future Oncology. 8 (1), 21-28 (2012).</li><li>Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-Associated+Neutrophils+and+Macrophages+Promote+Gender+Disparity+in+Hepatocellular+Carcinoma+in+Zebrafish.">Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish.</a> Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).</li><li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research.">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).</li><li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+plus+high+cholesterol+diet+lead+to+hepatic+steatosis+in+zebrafish+larvae:+a+novel+model+for+screening+anti-hepatic+steatosis+drugs.">High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs.</a> Nutrition &amp; Metabolism. 12, 42 (2015).</li><li>Kim, S. -. H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+of+tuberous+sclerosis+complex+reveals+cell-autonomous+and+non-cell-autonomous+functions+of+mutant+tuberin.">Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).</li><li>Delous, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9b+is+a+key+regulator+of+pancreaticobiliary+ductal+system+development.">Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development.</a> PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).</li><li>Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+hepatic+competence+by+Fgf+signaling.">Restriction of hepatic competence by Fgf signaling.</a> Development. 138 (7), 1339-1348 (2011).</li><li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+helix-loop-helix+transcription+factor,+heart+and+neural+crest+derivatives+expressed+transcript+2,+marks+hepatic+stellate+cells+in+zebrafish:+analysis+of+stellate+cell+entry+into+the+developing+liver.">The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).</li></ol>

Kvantificering af leverstørrelse er afgørende i undersøgelser med henblik på at forstå leverudvikling, regenerering, og oncogenesis. Protokollen beskrevet her er en relativt hurtig, nem og billig teknik til leverstørrelse kvantificering i larve zebrafisk. At udvise passende forsigtighed, mens du udfører visse aspekter af protokollen kan støtte i øget nøjagtighed af resultater og nedsat frustration.
Korrekt fiksering af larver er afgørende for at få velbevarede biologiske prøver og...

Hepatocellulære karcinom (HCC) er den mest almindelige primære malignitet i leveren1 og den tredje hyppigste årsag til kræft-relaterede dødelighed2. For bedre at forstå mekanismer af hepatocarcinogenese og identificere potentielle HCC terapeutiske, vi og andre har udviklet transgene zebrafisk, hvor hepatocyt-specifikke udtryk for onkogener såsom β-catenin3,4, Kras (V12)5,6, Myc7, eller Yap18 fører til HCC hos voksne dyr. I disse zebrafisk, leverudvidelsen er noteret så tidligt som 6 dage efter befrugtning (dpf), hvilket giver en letkøbt platform til at teste virkningerne af narkotika og genetiske ændringer på oncogene-drevet leverovervækst. Nøjagtig og præcis måling af larvelever størrelse er afgørende for bestemmelse af virkningerne af disse manipulationer.
Leverstørrelse og form kan vurderes semi-kvantitativt i faste zebrafisk larver ved CY3-SA mærkning9 eller i levende zebrafisk larver ved hjælp af hepatocyt-specifikke fluorescerende reportere og fluorescens dissekere mikroskopi5,6. Sidstnævnte metode er relativt hurtig, og dens manglende præcision kan løses ved at fotografere og måle området for hver lever ved hjælp af billedbehandling software7,10. Men, Det kan være teknisk udfordrende at ensartet position alle levende larver i et eksperiment, således at to-dimensionelle leverområde er en nøjagtig repræsentation af leverens størrelse. En lignende teknik til kvantificering af leverstørrelse indebærer brug af lysplade fluorescens mikroskopi til at kvantificere larve levervolumen8,hvilket kan være mere præcis til påvisning af størrelsesforskelle, når leveren er udvidet ikke-ensartet i forskellige dimensioner. Fluorescens-aktiverede cellesortering (FACS) kan bruges til at tælle antallet af fluorescerende mærket hepatocytter og andre levercelletyper i larvelever8,11. I denne metode, larve lever er samlet og dissociated, så oplysninger om individuelle leverstørrelse og form er tabt. Kombineret med en anden leverstørrelsebestemmelsesmetode muliggør FACS differentiering mellem øget celletal (hyperplasi) og øget cellestørrelse (hypertrofi). Alle disse metoder anvender dyr fluorescensteknologi (mikroskop- eller cellesortering) og kræver, bortset fra CY3-SA-mærkning, mærkning af hepatocytter med en fluorescerende reporter.
Her beskriver vi i detaljer en metode til kvantificering zebrafisk larve lever område ved hjælp af lyse felt mikroskopi og billedbehandling software3,12,13,14. Denne protokol muliggør præcis kvantificering af området for de enkelte lever på stedet uden brug af fluorescensmikroskopi. Mens analysere leverstørrelse, vi blinde billedet identitet til at reducere investigator bias og forbedre videnskabelige stringens15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Camera for dissecting microscope</td>
			<td>Leica, for example</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica, for example</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine (Dumont #5) forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Image J/FIJI</td>
			<td></td>
			<td>ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: <a href="https://imagej.net/Welcome" target="_blank">https://imagej.net/Welcome</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Various suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53502-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes</td>
			<td>USA Scientific Inc</td>
			<td>2906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 9-well round-bottom glass dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for blinding files</td>
			<td>R project</td>
			<td></td>
			<td>R can be downloaded for free: <a href="https://www.r-project.org/" target="_blank">https://www.r-project.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific graphing and statistics software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S)</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>200-226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Very fine (Dumont #55) forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying liver size in larval zebrafish using brightfield microscopy

I flere transgene zebrafisk modeller af hepatocellulære karcinom (HCC), hepatomegaly kan observeres i de tidlige larve stadier. Kvantificering larve lever størrelse i zebrafisk HCC modeller giver et middel til hurtigt at vurdere virkningerne af narkotika og andre manipulationer på en oncogene-relaterede fænotype. Her viser vi, hvordan du løser zebrafisk larver, dissekere væv omkring leveren, fotografere lever ved hjælp af lyse-felt mikroskopi, måle leverområdet, og analysere resultater. Denne protokol muliggør hurtig, præcis kvantificering af leverstørrelse. Da denne metode indebærer måling af leverområdet, kan det undervurdere forskelle i levervolumen, og komplementære metoder er nødvendige for at skelne mellem ændringer i cellestørrelse og ændringer i celletal. Den dissektion teknik, der er beskrevet heri er et glimrende værktøj til at visualisere leveren, tarmen, og bugspytkirtlen i deres naturlige positioner for utallige downstream applikationer, herunder immunfluorescens farvning og in situ hybridisering. Den beskrevne strategi for kvantificering larve lever størrelse gælder for mange aspekter af leverudvikling og regenerering.

Transgene zebrafisk, der udtrykker hepatocyt-specifikke aktiverede β-catenin(Tg(fabp10a:pt-β-cat) zebrafisk)3 og ikke-transgene kontrolsøskende blev aflivet ved 6 dpf- og leverområdet, blev kvantificeret ved hjælp af brightfield mikroskopi og billedbehandlingssoftware. Transgene zebrafisk har øget leverstørrelsen betydeligt (0,0006 cm2)sammenlignet med deres ikke-transgene søskende (0,0004 cm2, p < 0,0001; Figur 1</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy at JoVE.com

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

Her demonstrerer vi en metode til kvantificering af leverstørrelse i larvezebrafisk, hvilket giver mulighed for at vurdere virkningerne af genetiske og farmakologiske manipulationer på levervækst og udvikling.

Kvantificering leverstørrelse i Larval Zebrafish Ved hjælp af Brightfield Mikroskopi

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Denne metode giver en måde at kvantificere leverstørrelse i larve zebrafisk. Det giver også mulighed for vurdering af virkningerne af genetisk og farmakologisk manipulation på levervækst og udvikling. Denne teknik giver en hurtig og præcis måde at visualisere og måle leveren samt tarmen og bugspytkirtlen.Ud over at kvantificere leveren størrelse, denne dissektion metode kan være nyttigt for at forberede leveren, tarmen, og bugspytkirtlen for in situ hybridisering eller konfokal billeddannelse. Før du forsøger deskinning på eksperimentelle larver, skal du sørge for at du har brugt rigelig tid på at øve på ikke-eksperimentelle prøver og har en betydelig succesrate. Det er afgørende at visualisere korrekt orientering og bevægelse af zebrafisk larver og snæver for at fjerne huden uden at forstyrre omkringliggende organer.På tre til syv dage efter befrugtningen, efter aflivende larver, bruge et glas pipette og pipette pumpe til at indsamle op til 15 larver i en to milliliter rør. Vaskelarver to gange med en milliliter kold 1X PBS på is. Fjern så meget PBS som muligt ved hjælp af en glaspipette og pipettepumpe og tilsæt en milliliter kold fire procent PFA i PBS.Inkubere ved fire grader Celsius mindst natten over med blid vuggende. Brug en glaspipette og pipettepumpe, fjern PFA fra røret og skyl tre gange med en milliliter kold PBS. Rock i fem minutter i mellem skylninger.Pipette flere larver i PBS i en brønd af ni-godt rund-bund glas skål. Under et mikroskop, fjerne huden omkring leveren ved hjælp af fine kraftbefængte til at holde en larve på ryggen, gribende på hver side af hovedet så forsigtigt som muligt. Brug derefter meget fine arfortæve i den anden hånd til at få fat i huden bare overliggende hjertet.Træk huden diagonalt ned mod fiskens hale i bunden af skålen på venstre eller højre side af fisken. Gentag for den anden side. Fortsæt sensationsprægede flapper af huden og trække ned, indtil alle af huden og melanophores overliggende eller i nærheden af leveren er blevet fjernet.Hvis æggeblomme er til stede i fem til seks dage efter befrugtning larver, løfte æggeblomme ud i ét stykke ved at holde fisken med fine kraftforræv på ryggen og bruge de meget fine forrædt til forsigtigt prod æggeblomme. For tre til fire DPF larver, holde fisken med fine kraftang på ryggen og bruge de meget fine kraftang til at slagtilfælde æggeblomme startende fra ventrale side. Skrab æggeblomme af i stykker.Læg de dissekerede larver i frisk, kold PBS i et to milliliterrør ved hjælp af en glaspipette og pipettepumpe. For at montere larverne hældes et par milliliter på tre procent methylcellulose på låget af ren, plast petriskål. Brug en glaspipette og pipettepumpe til at tilsætte larver til methylcellulose, og tilsæt så lidt PBS med larverne som muligt.Under en dissekere mikroskop ved lav forstørrelse, bruge fine kraftbefængte til at orientere fiskene, så de er om på deres højre side mod venstre. Bekræft, at de fisk, der skal fotograferes, er perfekt justeret med det ene øje direkte oven på det andet øje. Hvis fiskens hale er bøjet, skal du fjerne halen ved at klemme den kraftigt med snævler for at fjerne den, så fisken lægger sig fladt.Zoom ind på høj forstørrelse og fokus på leveren, og sørg for, at leverens omrids er klart synlig. Tryk på knappen Hent billede for at fastgøre et billede og gemme filen. Gentag for alle fisk, og sørg for forstørrelsen er den samme for hvert billede.Tag et billede af et mikrometer med samme forstørrelse. Hvis du vil bruge programmet R til at blinde alle leverbilleder for at undgå potentielle investigator bias og fremme videnskabelig stringens, omdøbe filer tilfældigt og oprette en randomisering fil, der indeholder en liste over de oprindelige filnavne og tilsvarende blindet filnavne. Åbn randomiserede filer i rækkefølge, startende med fil et.Vælg værktøjet Frihåndsvalg, og konturér hver lever. Tryk på Control-M for at måle området for hver lever. For alle lever, der ikke kan måles nøjagtigt, fordi de har resterende hud, æggeblomme, er ude af fokus, eller ikke er intakt, indsætte en pladsholder måling.Gemme målingerne i en tekstfil. Hvis du vil fjerneblind og analysere data, skal du åbne målefilen og randomiseringsfilen i et regnearksprogram. Indsæt en ny kolonne i målefilen, og tilføj de oprindelige filnavne for de blindede filer ved hjælp af randomiseringsfilen.Gem denne fil som filen Ikke-blinded målinger. Sorter dataene efter det oprindelige filnavn. Ekskluder alle levermålinger, for hvilke billederne ikke var tilstrækkelige.Om nødvendigt skal måleværdier omregnes til den ønskede skala i kvadratnillimeter. Åbn linjen Skaler i billedbehandlingssoftwaren. Brug værktøjet Lige linje til at måle en millimeter på skalalinjen.Billedbehandlingssoftwaren måler derefter i de samme enheder som leverne, hvilket giver en konverteringsfaktor. Brug konverteringsfaktoren til at konvertere målinger i filen Ikke-blinded målinger. Bestemme middelværdi og standardafvigelse og beregne P-værdier.På seks dage efter befrugtningen, ikke-transgene zebrafisk larver viste naturlig position og form af leveren overliggende tarmen. Transgene zebrafisk har øget leverstørrelsen betydeligt i forhold til deres ikke-transgene søskende. Nogle eksempler på utilstrækkelige billeder og mikrometer er vist her.Larver med hud, der dækker leveren, larver med æggeblomme tilsløre leveren, larver med dele af leveren klemt af, og larver med leveren forvredet og falder af, larver med manglende lever, larver med leverkontur, der er vanskeligt at identificere, og larver med forkert positionering. Når du forsøger denne procedure, Det er vigtigt at bruge små og kontrollerede bevægelser for at forhindre skader på leveren. Ud over bright-field mikroskopi, kan vi også bruge larver dissekeret på denne måde, for konfokal mikroskopi, at visualisere fluorescerende reporter proteiner eller immun-fluorescerende farvning, og for in situ hybridisering.Formaldehyd eller PFA er irriterende og mistænkt kræftfremkaldende. Handsker skal bæres ved håndtering af PFA, og koncentrerede opløsninger skal håndteres i en kemisk røghætte.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Live-Imaging af medfødte immunsystem og præneoplastiske celleinteraktioner Brug en inducerbar Gal4 / UAS Expression System i Larve Zebrafisk Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Optagelse Tissue Repair i zebrafisk Larver med Time-lapse Lysfelt stereomikroskopi

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Hepatocyt-specifik Ablation i Zebrafisk til Studieinformationen Biliær drevet Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse af zebrafisk Kidney Udvikling med Time-lapse Imaging Ved hjælp af en dissektionsmikroskop Udstyret til Optical Sektionsinddeling

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Brug Light Sheet Fluorescens mikroskopi til billede zebrafisk Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Dissektion af Larver zebrafisk gonadale Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Histologiske analyser af akut alkoholisk leverskader i sebrafisk

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Korrelationsmaalinger super-opløsning og elektronmikroskopi at løse Protein lokalisering i zebrafisk nethinden

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Etablering af larve zebrafisk som en dyr Model til at undersøge Trypanosoma cruzi motilitet In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal plade i Gastrulating mus embryoner ved hjælp af Scanning elektronmikroskopi og hele Mount immunfluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...