Name: quantifying liver size in larval zebrafish using brightfield microscopy
Uploaded: 2020-02-02T13:00:00
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Nous tenons à remercier Maurine Hobbs et la Ressource animale centralisée du poisson zèbre (CZAR) de l'Université de l'Utah pour avoir fourni de l'élevage de poissons zèbres, de l'espace de laboratoire et de l'équipement pour effectuer des parties de cette recherche. L'expansion de la CZAR est soutenue en partie par la subvention des NIH no 1G20OD018369-01. Nous tenons également à remercier Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum et le Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility pour les soins du poisson zèbre. Nous tenons à remercier Kenneth Kompass pour son aide dans le programme R. Ces travaux ont été financés en partie par des subventions de la Huntsman Cancer Foundation (en conjonction avec la subvention P30 CA042014 accordée au Huntsman Cancer Institute) (KJE) et nih/NCI R01CA222570 (KJE).

Les études sur les animaux sont menées selon des procédures approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université de l'Utah.
1. Fixation des larves
<ol><li>À 3 à 7 jours après la fécondation (dpf), euthanasiez les larves avec du méthane sulfonate de tricaine (0,03 %) et recueillir jusqu'à 15 larves dans un tube de 2 ml à l'aide d'une pipette en verre et d'une pompe à pipette.</li>
	<li>Laver les larves deux fois avec 1 ml de salin...

<ol>
	<li>Lin, D. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+Epigenomic+Heterogeneity+of+Hepatocellular+Carcinoma.">Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).</li><li>Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+hepatocellular+carcinoma:+Epidemiology,+etiology,+and+carcinogenesis.">Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis.</a> Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).</li><li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Chemical+Inhibitors+of+&#946;-Catenin-Driven+Liver+Tumorigenesis+in+Zebrafish.">Identification of Chemical Inhibitors of &#946;-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).</li><li>Kalasekar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+beta-catenin+activation+is+sufficient+to+cause+hepatocellular+carcinoma+in+zebrafish.">Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish.</a> Biology Open. 8 (10), (2019).</li><li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+level+of+liver-specific+expression+of+oncogenic+Kras(V12)+drives+robust+liver+tumorigenesis+in+transgenic+zebrafish.">A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).</li><li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+kras(V12)+transgenic+zebrafish+model+for+liver+tumorigenesis+and+chemical+drug+screening.">An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+liver+tumor+model+with+inducible+Myc+expression+reveals+conserved+Myc+signatures+with+mammalian+liver+tumors.">A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).</li><li>Cox, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yap+reprograms+glutamine+metabolism+to+increase+nucleotide+biosynthesis+and+enable+liver+growth.">Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth.</a> Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).</li><li>Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+the+mutants+vps18,+nf2+and+foie+gras+as+models+of+liver+disease.">A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease.</a> Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).</li><li>Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tumor+models+in+transgenic+zebrafish:+an+alternative+in+vivo+approach+to+study+hepatocarcinogenes.">Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes.</a> Future Oncology. 8 (1), 21-28 (2012).</li><li>Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-Associated+Neutrophils+and+Macrophages+Promote+Gender+Disparity+in+Hepatocellular+Carcinoma+in+Zebrafish.">Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish.</a> Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).</li><li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research.">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).</li><li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+plus+high+cholesterol+diet+lead+to+hepatic+steatosis+in+zebrafish+larvae:+a+novel+model+for+screening+anti-hepatic+steatosis+drugs.">High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs.</a> Nutrition &amp; Metabolism. 12, 42 (2015).</li><li>Kim, S. -. H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+of+tuberous+sclerosis+complex+reveals+cell-autonomous+and+non-cell-autonomous+functions+of+mutant+tuberin.">Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).</li><li>Delous, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9b+is+a+key+regulator+of+pancreaticobiliary+ductal+system+development.">Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development.</a> PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).</li><li>Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+hepatic+competence+by+Fgf+signaling.">Restriction of hepatic competence by Fgf signaling.</a> Development. 138 (7), 1339-1348 (2011).</li><li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+helix-loop-helix+transcription+factor,+heart+and+neural+crest+derivatives+expressed+transcript+2,+marks+hepatic+stellate+cells+in+zebrafish:+analysis+of+stellate+cell+entry+into+the+developing+liver.">The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).</li></ol>

La quantification de la taille du foie est cruciale dans les études visant à comprendre le développement du foie, la régénération et l'oncogénèse. Le protocole décrit ici est une technique relativement rapide, facile et bon marché pour la quantification de la taille du foie chez le poisson zèbre larvaire. Faire preuve de prudence tout en exécutant certains aspects du protocole peut aider à une plus grande exactitude des résultats et à une diminution de la frustration.
Une bonne ...

Le carcinome hépatocellulaire (HCC) est la malignité primaire la plus commune du foie1 et la troisième cause principale de mortalité cancer-connexe2. Pour mieux comprendre les mécanismes de l'hépatocarcinogenèse et identifier les thérapeutiques HCC potentielles, nous et d'autres avons développé le poisson zèbre transgénique dans lequel l'expression hépatocyte-spécifique des oncogènes tels que la caténine3,4, Kras(V12)5,6, Myc7, ou Yap18 conduit à HCC chez les animaux adultes. Chez ces poissons zèbres, l'élargissement du foie est noté dès 6 jours après la fécondation (dpf), fournissant une plate-forme facile pour tester les effets des médicaments et des altérations génétiques sur la surcroissance du foie induite par les oncogènes. La mesure précise et précise de la taille du foie larvaire est essentielle pour déterminer les effets de ces manipulations.
La taille et la forme du foie peuvent être évaluées de façon semi-quantitative chez les larves fixes de poissons zèbres par CY3-SA étiquetant9 ou chez les larves vivantes de poissons zèbres à l'aide de reporters fluorescents spécifiques à l'hépatocyte et de la microscopie disséquer la fluorescence5,6. Cette dernière méthode est relativement rapide, et son manque de précision peut être abordé en photographiant et en mesurant la zone de chaque foie à l'aide d'un logiciel de traitement d'image7,10. Cependant, il peut être techniquement difficile de positionner uniformément toutes les larves vivantes dans une expérience telle que la région bidimensionnelle du foie est une représentation précise de la taille du foie. Une technique similaire pour quantifier la taille du foie consiste à utiliser la microscopie de fluorescence des feuilles légères pour quantifier le volume du foie larvaire8, qui peut être plus précis pour détecter les différences de taille lorsque le foie est élargi de façon non uniforme dans différentes dimensions. Le tri cellulaire activé par la fluorescence (FACS) peut être utilisé pour compter le nombre d'hépatocytes étiquetés fluorescents et d'autres types de cellules hépatiques dans les foies larvaires8,11. Dans cette méthode, les foies larvaires sont mis en commun et dissociés, de sorte que l'information sur la taille et la forme du foie individuel est perdue. En combinaison avec une autre méthode de détermination de la taille du foie, FACS permet la différenciation entre l'augmentation du nombre de cellules (hyperplasie) et l'augmentation de la taille des cellules (hypertrophie). Toutes ces méthodes utilisent une technologie de fluorescence coûteuse (microscope ou trieur de cellules) et, à l'exception de l'étiquetage CY3-SA, nécessitent l'étiquetage des hépatocytes avec un journaliste fluorescent.
Ici, nous décrivons en détail une méthode pour quantifier la zone du foie larvaire de poisson zèbre à l'aide de microscopie de champ lumineux et de logiciel de traitement d'image3,12,13,14. Ce protocole permet une quantification précise de la zone des foies individuels in situ sans l'utilisation de la microscopie de fluorescence. Tout en analysant la taille du foie, nous aveuglons l'identité de l'image pour réduire les biais des chercheurs et améliorer la rigueur scientifique15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Camera for dissecting microscope</td>
			<td>Leica, for example</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica, for example</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine (Dumont #5) forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Image J/FIJI</td>
			<td></td>
			<td>ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: <a href="https://imagej.net/Welcome" target="_blank">https://imagej.net/Welcome</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Various suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53502-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes</td>
			<td>USA Scientific Inc</td>
			<td>2906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 9-well round-bottom glass dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for blinding files</td>
			<td>R project</td>
			<td></td>
			<td>R can be downloaded for free: <a href="https://www.r-project.org/" target="_blank">https://www.r-project.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific graphing and statistics software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S)</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>200-226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Very fine (Dumont #55) forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying liver size in larval zebrafish using brightfield microscopy

Dans plusieurs modèles transgéniques de poisson zèbre du carcinome hépatocellulaire (HCC), l'hépatomegaly peut être observé pendant les étapes larvaires tôt. La quantification de la taille du foie larvaire dans les modèles HCC du poisson zèbre fournit un moyen d'évaluer rapidement les effets des médicaments et d'autres manipulations sur un phénotype lié à l'oncogène. Ici, nous montrons comment fixer les larves de poissons zèbres, disséquer les tissus entourant le foie, photographier les foies à l'aide de microscopie de champ lumineux, mesurer la région du foie, et analyser les résultats. Ce protocole permet une quantification rapide et précise de la taille du foie. Comme cette méthode consiste à mesurer la région du foie, elle peut sous-estimer les différences dans le volume du foie, et des méthodologies complémentaires sont nécessaires pour différencier entre les changements dans la taille des cellules et les changements dans le nombre de cellules. La technique de dissection décrite ci-dessus est un excellent outil pour visualiser le foie, l'intestin, et le pancréas dans leurs positions naturelles pour une myriade d'applications en aval, y compris la coloration d'immunofluorescence et l'hybridation in situ. La stratégie décrite pour quantifier la taille du foie larvaire s'applique à de nombreux aspects du développement et de la régénération du foie.

Le poisson zèbre transgénique exprimant l'hépatocyte-spécifique activé - caténine (Tg(fabp10a:pt---cat) zebrafish)3 et les frères et sœurs témoins non transgéniques ont été euthanasiés à 6 dpf et la zone hépatique a été quantifiée à l'aide d'un logiciel de microscopie et de traitement d'image brightfield. Les poissons zèbres transgéniques ont considérablement augmenté la taille du foie (0,0006 cm2) par rapport à leurs frères et sœurs non trans...

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Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

Ici nous démontrons une méthode pour quantifier la taille du foie dans le poisson zèbre larvaire, fournissant un moyen d'évaluer les effets des manipulations génétiques et pharmacologiques sur la croissance et le développement de foie.

Quantifier la taille du foie chez le poisson zèbre larvaire à l'aide de la microscopie Brightfield

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Cette méthode permet de quantifier la taille du foie chez le poisson zèbre larvaire. Il permet également d’évaluer les effets de la manipulation génétique et pharmacologique sur la croissance et le développement du foie. Cette technique fournit un moyen rapide et précis de visualiser et de mesurer le foie ainsi que l’intestin et le pancréas.En plus de quantifier la taille du foie, cette méthode de dissection peut être utile pour préparer le foie, l’intestin et le pancréas à l’hybridation in situ ou à l’imagerie confocale. Avant de tenter de désakinning sur les larves expérimentales, assurez-vous que vous avez passé suffisamment de temps à pratiquer sur des échantillons non expérimentaux et ont un taux de réussite significatif. Il est essentiel de visualiser l’orientation et le mouvement appropriés des larves et des forceps du poisson zèbre afin d’enlever la peau sans déranger les organes environnants.À trois à sept jours après la fécondation, après avoir euthanasié les larves, utilisez une pipette en verre et une pompe pipette pour recueillir jusqu’à 15 larves dans un tube de deux millilitres. Laver les larves deux fois avec un millilitre de 1X PBS froid sur la glace. Retirez autant de PBS que possible à l’aide d’une pipette en verre et d’une pompe pipette et ajoutez un millilitre de PFA froid de quatre pour cent dans PBS.Incuber à quatre degrés Celsius au moins toute la nuit avec un basculement doux. À l’aide d’une pipette en verre et d’une pompe à pipette, retirer le PFA du tube et rincer trois fois avec un millilitre de PBS froid. Faire basculer pendant cinq minutes entre les rinçages.Pipette plusieurs larves dans PBS dans un puits de neuf puits plat en verre rond-fond. Au microscope, retirer la peau entourant le foie à l’aide de forceps fins pour tenir une larve sur le dos, saisissant de chaque côté de la tête aussi doucement que possible. Ensuite, utilisez des forceps très fins dans l’autre main pour saisir la peau juste au-dessus du cœur.Tirez la peau vers le bas en diagonale vers la queue du poisson dans le fond du plat sur le côté gauche ou droit du poisson. Répétez l’répétition de l’autre côté. Continuer à saisir les volets de la peau et tirer vers le bas jusqu’à ce que toute la peau et les mélanophores trop ou près du foie ont été enlevés.Si le jaune est présent pendant cinq à six jours après la fécondation des larves, soulevez le jaune en un seul morceau en tenant le poisson avec des forceps fins sur le dos et en utilisant les forceps très fins pour propulser doucement le jaune. Pour trois à quatre larves de DPF, maintenez le poisson avec de fines forceps sur le dos et utilisez les forceps très fins pour caresser le jaune à partir du côté ventral. Racler le jaune en morceaux.Placer les larves disséquées dans un PBS frais et froid dans un tube de deux millilitres à l’aide d’une pipette en verre et d’une pompe à pipette. Pour monter les larves, versez quelques millilitres de méthylcellulose à trois pour cent sur le couvercle de la boîte de Pétri propre et en plastique. Utilisez une pipette en verre et une pompe pipette pour ajouter des larves à la méthylcellulose, en ajoutant le moins de PBS possible avec les larves.Sous un microscope disséquant à faible grossissement, utilisez des forceps fins pour orienter les poissons afin qu’ils soient couchés sur leur côté droit face à gauche. Confirmez que le poisson à photographier est parfaitement aligné avec un œil directement sur le dessus de l’autre œil. Si la queue du poisson est pliée, retirez la queue en la pinçant avec force avec des pincements pour l’enlever de sorte que le poisson s’aplatit.Zoomez sur le grossissement élevé et concentrez-vous sur le foie, en vous assurant que le contour du foie est clairement visible. Appuyez sur le bouton Capture Image pour prendre une photo et enregistrer le fichier. Répétez l’année pour tous les poissons, en vous assurant que le grossissement est le même pour chaque image.Prenez une photo d’un micromètre à l’aide du même grossissement. Utiliser le programme R pour aveugler toutes les photos de foie afin d’éviter les biais potentiels des chercheurs et de promouvoir la rigueur scientifique, renommer les fichiers au hasard et créer un fichier de randomisation contenant une liste des noms de fichiers originaux et des noms de fichiers aveugles correspondants. Ouvrez les fichiers randomisés dans l’ordre, en commençant par le premier fichier.Choisissez l’outil Sélections à main levée et décrivez chaque foie. Contrôle de presse-M pour mesurer la zone de chaque foie. Pour tous les foies qui ne peuvent pas être mesurés avec précision parce qu’ils ont la peau résiduelle, jaune, sont hors de discussion, ou ne sont pas intacts, insérer une mesure placeholder.Enregistrez les mesures dans un fichier texte. Pour ne pas aveugler et analyser les données, ouvrez le fichier de mesures et le fichier de randomisation dans un programme de feuille de calcul. Insérez une nouvelle colonne dans le fichier de mesures et ajoutez les noms de fichiers originaux pour les fichiers aveuglés à l’aide du fichier Randomisation.Enregistrez ce fichier sous forme de fichier Mesures non aveuglées. Trier les données par le nom du fichier d’origine. Exclure toute mesure du foie pour laquelle les images n’étaient pas adéquates.Si nécessaire, convertir les valeurs de mesure en l’échelle désirée en millimètres carrés. Ouvrez la barre d’échelle dans le logiciel de traitement d’image. Utilisez l’outil Straight Line pour mesurer un millimètre sur la barre d’échelle.Le logiciel de traitement d’image mesure alors dans les mêmes unités que les foies, donnant un facteur de conversion. Utilisez le facteur de conversion pour convertir les mesures dans le fichier Mesures non aveuglées. Déterminez l’écart moyen et type et calculez les valeurs P.Six jours après la fécondation, les larves non transgéniques du poisson zèbre présentaient une position naturelle et une forme de foie qui survolait l’intestin. Le poisson zèbre transgénique a considérablement augmenté la taille du foie par rapport à ses frères et sœurs non transgéniques. Quelques exemples d’images et de micromètres inadéquats sont montrés ici.Larve avec la peau couvrant le foie, larve avec le jaune obscurcissant le foie, larve avec des parties du foie pincées, et larve avec le foie disloqué et tombant, larve avec le foie manquant, larve avec le contour de foie qui est difficile à identifier, et larve avec le positionnement incorrect. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important d’utiliser de petits mouvements contrôlés pour prévenir les dommages au foie. En plus de la microscopie à champ lumineux, nous pouvons également utiliser des larves disséquées de cette façon, pour la microscopie confoccale, pour visualiser les protéines fluorescentes de reporter ou la coloration immuno-fluorescente, et pour l’hybridation in situ.Le formaldéhyde ou PFA est un irritant et soupçonné cancérogène. Les gants doivent être portés lors de la manipulation de la PFA et les solutions concentrées doivent être manipulées dans un capot de fumée chimique.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Imagerie en direct d&#39;Innate immunitaire et prénéoplasiques Interactions cellulaires L&#39;utilisation d&#39;un système d&#39;expression / UAS inductible Gal4 dans des larves de poisson zèbre peau

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Recherche

Biologie du développement

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Capture réparation des tissus chez le poisson zèbre larves avec Time-lapse Brightfield stéréomicroscopie

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Ablation spécifique des hépatocytes chez le poisson zèbre pour étudier conduit biliaire-Régénération hépatique

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse des Zebrafish Kidney Development avec Time-lapse d&#39;imagerie utilisant un microscope à dissection équipé pour sectionner optique

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Utilisation de feuilles Lumière Fluorescence Microscopy à l&#39;image du développement Zebrafish Eye

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Dissection de tissu gonadique Larval Zebrafish

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Analyses histologiques de lésions hépatiques alcooliques aiguës dans le poisson zébré

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Super-résolution corrélative et microscopie électronique pour résoudre la localisation des protéines dans la rétine de poisson-zèbre

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Mise en place du poisson-zèbre larvaire comme modèle Animal pour enquêter sur Trypanosoma cruzi motilité In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiser le nœud et la notochorde plaque en Gastrulating des embryons de souris à l’aide de la microscopie électronique à balayage et toute monture Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...