Name: quantifying liver size in larval zebrafish using brightfield microscopy
Uploaded: 2020-02-02T13:00:00
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Wir möchten Maurine Hobbs und die Centralized Zebrafish Animal Resource (CZAR) an der University of Utah für die Bereitstellung von Zebrafischhaltung, Laborraum und Ausrüstung zur Durchführung von Teilen dieser Forschung danken. Die Erweiterung des CZAR wird zum Teil durch den NIH-Zuschuss Nr. 1G20OD018369-01 unterstützt. Wir möchten auch Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum und dem Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility für die Pflege von Zebrafischen danken. Wir danken Kenneth Kompass für die Unterstützung bei der R-Programmierung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Stipendien der Huntsman Cancer Foundation (in Verbindung mit dem Stipendium P30 CA042014 an das Huntsman Cancer Institute) (KJE) und NIH/NCI R01CA222570 (KJE) finanziert.

Tierversuche werden nach Verfahren durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Utah genehmigt wurden.
1. Arven fixieren
<ol><li>Nach 3–7 Tagen nach der Befruchtung (dpf) Larven mit Tricain-Methansulfonat einschläfern (0,03%) und sammeln Bis zu 15 Larven in einem 2 ml Rohr mit einer Glaspipette und Pipettenpumpe.</li>
	<li>Larven zweimal mit 1 ml Kalt (4 °C) 1x Phosphat-gepufferte Saline (PBS) auf Eis waschen. Für jede Wäsche so viel Flü...

<ol>
	<li>Lin, D. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+Epigenomic+Heterogeneity+of+Hepatocellular+Carcinoma.">Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).</li><li>Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+hepatocellular+carcinoma:+Epidemiology,+etiology,+and+carcinogenesis.">Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis.</a> Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).</li><li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Chemical+Inhibitors+of+&#946;-Catenin-Driven+Liver+Tumorigenesis+in+Zebrafish.">Identification of Chemical Inhibitors of &#946;-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).</li><li>Kalasekar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+beta-catenin+activation+is+sufficient+to+cause+hepatocellular+carcinoma+in+zebrafish.">Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish.</a> Biology Open. 8 (10), (2019).</li><li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+level+of+liver-specific+expression+of+oncogenic+Kras(V12)+drives+robust+liver+tumorigenesis+in+transgenic+zebrafish.">A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).</li><li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+kras(V12)+transgenic+zebrafish+model+for+liver+tumorigenesis+and+chemical+drug+screening.">An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+liver+tumor+model+with+inducible+Myc+expression+reveals+conserved+Myc+signatures+with+mammalian+liver+tumors.">A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).</li><li>Cox, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yap+reprograms+glutamine+metabolism+to+increase+nucleotide+biosynthesis+and+enable+liver+growth.">Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth.</a> Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).</li><li>Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+the+mutants+vps18,+nf2+and+foie+gras+as+models+of+liver+disease.">A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease.</a> Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).</li><li>Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tumor+models+in+transgenic+zebrafish:+an+alternative+in+vivo+approach+to+study+hepatocarcinogenes.">Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes.</a> Future Oncology. 8 (1), 21-28 (2012).</li><li>Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-Associated+Neutrophils+and+Macrophages+Promote+Gender+Disparity+in+Hepatocellular+Carcinoma+in+Zebrafish.">Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish.</a> Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).</li><li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research.">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).</li><li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+plus+high+cholesterol+diet+lead+to+hepatic+steatosis+in+zebrafish+larvae:+a+novel+model+for+screening+anti-hepatic+steatosis+drugs.">High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs.</a> Nutrition &amp; Metabolism. 12, 42 (2015).</li><li>Kim, S. -. H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+of+tuberous+sclerosis+complex+reveals+cell-autonomous+and+non-cell-autonomous+functions+of+mutant+tuberin.">Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).</li><li>Delous, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9b+is+a+key+regulator+of+pancreaticobiliary+ductal+system+development.">Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development.</a> PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).</li><li>Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+hepatic+competence+by+Fgf+signaling.">Restriction of hepatic competence by Fgf signaling.</a> Development. 138 (7), 1339-1348 (2011).</li><li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+helix-loop-helix+transcription+factor,+heart+and+neural+crest+derivatives+expressed+transcript+2,+marks+hepatic+stellate+cells+in+zebrafish:+analysis+of+stellate+cell+entry+into+the+developing+liver.">The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).</li></ol>

Quantifizierung der Lebergröße ist entscheidend in Studien zum Verständnis der Leberentwicklung, Regeneration, und Onkogenese. Das hier beschriebene Protokoll ist eine relativ schnelle, einfache und kostengünstige Technik zur Quantifizierung der Lebergröße bei Larvenzebrafischen. Die angemessene Vorsicht bei der Durchführung bestimmter Aspekte des Protokolls kann zu einer höheren Genauigkeit der Ergebnisse und einer verminderten Frustration führen.
Die richtige Fixierung der Larven is...

Hepatozelluläres Karzinom (HCC) ist die häufigste primäre Malignität der Leber1 und die dritthäufigste Ursache der krebsbedingten Mortalität2. Um Mechanismen der Hepatokarzinogenese besser zu verstehen und mögliche HCC-Therapeutika zu identifizieren, haben wir und andere transgene Zebrafische entwickelt, bei denen hepatozytenspezifische Expression von Onkogenen wie z.B. '-Catenin3,4, Kras(V12)5,6, Myc7oder Yap18 zu HCC bei erwachsenen Tieren führt. Bei diesen Zebrafischen wird die Lebervergrößerung bereits 6 Tage nach der Befruchtung (dpf) festgestellt, was eine einfache Plattform für die Erprobung der Auswirkungen von Medikamenten und genetischen Veränderungen auf das Onkogen-getriebene Leberüberwuchern bietet. Genaue und genaue Messung der Larvenlebergröße ist wichtig für die Bestimmung der Auswirkungen dieser Manipulationen.
Lebergröße und -form können halbquantitativ bei festen Zebrafischlarven mit CY3-SA-Kennzeichnung9 oder bei lebenden Zebrafischlarven mit hepatozytenspezifischen Fluoreszenzreportern und Fluoreszenzsezierender Mikroskopie5,6bewertet werden. Die letztgenannte Methode ist relativ schnell, und ihre mangelnde Präzision kann durch fotografieren und messen die Fläche jeder Leber mit Bildverarbeitungssoftware7,10behandelt werden. Es kann jedoch technisch schwierig sein, alle lebenden Larven in einem Experiment einheitlich zu positionieren, so dass der zweidimensionale Leberbereich eine genaue Darstellung der Lebergröße darstellt. Eine ähnliche Technik zur Quantifizierung der Lebergröße beinhaltet die Verwendung von Lichtblattfluoreszenzmikroskopie zur Quantifizierung des Larvenlebervolumens8, was genauer sein kann, um Größenunterschiede zu erkennen, wenn die Leber in verschiedenen Dimensionen ungleichmäßig erweitert wird. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) kann verwendet werden, um die Anzahl der fluoreszierend gekennzeichneten Hepatozyten und andere Leberzelltypen in Larvenlebern8,11zu zählen. Bei dieser Methode werden Larvenleber gepoolt und dissoziiert, so dass Informationen über die größe und Form der einzelnen Leber verloren gehen. In Kombination mit einer anderen Methode zur Bestimmung der Lebergröße ermöglicht FACS die Unterscheidung zwischen erhöhter Zellzahl (Hyperplasie) und erhöhter Zellgröße (Hypertrophie). Alle diese Methoden verwenden teure Fluoreszenztechnologie (Mikroskop oder Zellsortierer) und erfordern, mit Ausnahme der CY3-SA-Kennzeichnung, die Kennzeichnung von Hepatozyten mit einem fluoreszierenden Reporter.
Hier beschreiben wir detailliert eine Methode zur Quantifizierung von Zebrafisch-Larvenleber-Bereich mit Hellfeldmikroskopie und Bildverarbeitungssoftware3,12,13,14. Dieses Protokoll ermöglicht eine präzise Quantifizierung des Bereichs der einzelnen Lebern in situ ohne den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie. Bei der Analyse der Lebergröße blenden wir die Bildidentität, um die Voreingenommenheit der Ermittler zu reduzieren und die wissenschaftliche Strenge zu verbessern15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Camera for dissecting microscope</td>
			<td>Leica, for example</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica, for example</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine (Dumont #5) forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Image J/FIJI</td>
			<td></td>
			<td>ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: <a href="https://imagej.net/Welcome" target="_blank">https://imagej.net/Welcome</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Various suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53502-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes</td>
			<td>USA Scientific Inc</td>
			<td>2906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 9-well round-bottom glass dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for blinding files</td>
			<td>R project</td>
			<td></td>
			<td>R can be downloaded for free: <a href="https://www.r-project.org/" target="_blank">https://www.r-project.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific graphing and statistics software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S)</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>200-226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Very fine (Dumont #55) forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying liver size in larval zebrafish using brightfield microscopy

In mehreren transgenen Zebrafischmodellen des hepatozellulären Karzinoms (HCC) kann Hepatomegalie in frühen Larvenstadien beobachtet werden. Die Quantifizierung der Larvenlebergröße in Zebrafisch-HCC-Modellen bietet eine Möglichkeit, die Auswirkungen von Medikamenten und anderen Manipulationen auf einen Onkogen-bezogenen Phänotyp schnell zu bewerten. Hier zeigen wir, wie man Zebrafischlarven fixiert, das Gewebe, das die Leber umgibt, seziert, Lebern mittels Hellfeldmikroskopie fotografiert, leberfarbene Flächen misst und Ergebnisse analysiert. Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle, präzise Quantifizierung der Lebergröße. Da diese Methode die Messung des Leberbereichs beinhaltet, kann es Unterschiede im Lebervolumen unterschätzen, und ergänzende Methoden sind erforderlich, um zwischen Veränderungen der Zellgröße und Veränderungen der Zellzahl zu unterscheiden. Die hier beschriebene Dissektionstechnik ist ein ausgezeichnetes Werkzeug, um Leber, Darm und Bauchspeicheldrüse in ihren natürlichen Positionen für unzählige nachgelagerte Anwendungen, einschließlich Immunfluoreszenzfärbung und In-situ-Hybridisierung, zu visualisieren. Die beschriebene Strategie zur Quantifizierung der Larvenlebergröße ist auf viele Aspekte der Leberentwicklung und -regeneration anwendbar.

Transgene Zebrafische, die Hepatozyten-spezifisches aktiviertes -Catenin (Tg(fabp10a:pt---cat) Zebrafisch)3 und nicht-transgene Kontrollgeschwister exzensieren, wurden mit 6 dpf eingeschläfert und der Leberbereich wurde mit Hilfe von Brightfield-Mikroskopie- und Bildverarbeitungssoftware quantifiziert. Transgene Zebrafische haben die Lebergröße (0,0006 cm2) im Vergleich zu ihren nicht-transgenen Geschwistern (0,0004 cm2, p < 0,0001; <strong class...

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Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

Hier zeigen wir eine Methode zur Quantifizierung der Lebergröße in Larvenzebrafischen, die eine Möglichkeit bietet, die Auswirkungen genetischer und pharmakologischer Manipulationen auf das Leberwachstum und die Leberentwicklung zu bewerten.

Quantifizierung der Lebergröße in Larval Zebrafischen mit Brightfield-Mikroskopie

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Diese Methode bietet eine Möglichkeit, die Lebergröße in Larvenzebrafischen zu quantifizieren. Es ermöglicht auch die Bewertung der Auswirkungen der genetischen und pharmakologischen Manipulation auf das Leberwachstum und die Entwicklung. Diese Technik bietet eine schnelle und präzise Möglichkeit, die Leber sowie den Darm und die Bauchspeicheldrüse zu visualisieren und zu messen.Neben der Quantifizierung der Lebergröße, Diese Seziermethode kann hilfreich für die Vorbereitung der Leber, Darm, und Bauchspeicheldrüse für In-situ-Hybridisierung oder konfokale Bildgebung. Bevor Sie versuchen, an experimentellen Larven zu laborieren, stellen Sie sicher, dass Sie viel Zeit damit verbracht haben, an nicht-experimentellen Proben zu üben und eine signifikante Erfolgsrate zu haben. Es ist wichtig, die richtige Orientierung und Bewegung von Zebrafischlarven und Zangen zu visualisieren, um die Haut zu entfernen, ohne die umgebenden Organe zu stören.Nach drei bis sieben Tagen nach der Befruchtung, nach der Einschläferung von Larven, verwenden Sie eine Glaspipette und eine Pipettenpumpe, um bis zu 15 Larven in einem Zwei-Milliliter-Rohr zu sammeln. Larven zweimal mit einem Milliliter kalter 1X PBS auf Eis waschen. Entfernen Sie so viel PBS wie möglich mit einer Glaspipette und Pipettenpumpe und fügen Sie einen Milliliter kalte vier Prozent PFA in PBS hinzu.Bei vier Grad Celsius mindestens über Nacht mit sanftem Schaukeln inkubieren. Mit einer Glaspipette und Pipettenpumpe den PFA aus dem Rohr nehmen und dreimal mit einem Milliliter kalter PBS abspülen. Rock für fünf Minuten zwischen spülen.Mehrere Larven in PBS in einen Brunnen aus neun gut rund-Boden-Glasschale pfeifen. Entfernen Sie unter dem Mikroskop die Haut, die die Leber umgibt, mit feinen Zangen, um eine Larve auf dem Rücken zu halten, und greifen Sie auf beiden Seiten des Kopfes so sanft wie möglich. Dann verwenden Sie sehr feine Zange in der anderen Hand, um die Haut nur über dem Herzen zu greifen.Ziehen Sie die Haut diagonal zum Schwanz des Fisches in den Boden der Schale auf der linken oder rechten Seite des Fisches. Wiederholen Sie dies für die andere Seite. Greifen Sie weiter Klappen der Haut und ziehen Sie nach unten, bis die gesamte Haut und Melanophoren über oder in der Nähe der Leber entfernt wurden.Wenn Eigelb fünf bis sechs Tage lang nach der Befruchtung samt Larven vorhanden ist, heben Sie das Eigelb in einem Stück ab, indem Sie den Fisch mit feiner Zange auf dem Rücken halten und die sehr feinen Zangen verwenden, um das Eigelb sanft zu proden. Für drei bis vier DPF-Larven halten Sie den Fisch mit feiner Zange auf dem Rücken und verwenden Sie die sehr feinen Zangen, um das Eigelb von der ventralen Seite zu streicheln. Das Eigelb in Stücke zerkleinern.Legen Sie die sezierten Larven in frische, kalte PBS in einem Zwei-Milliliter-Rohr mit einer Glaspipette und Pipettenpumpe. Um die Larven zu montieren, gießen Sie ein paar Milliliter drei Prozent Methylcellulose auf den Deckel der sauberen, Kunststoff Petrischale. Verwenden Sie eine Glaspipette und Pipettenpumpe, um Larven in die Methylcellulose einzutragen und so wenig PBS wie möglich mit den Larven hinzuzufügen.Unter einem Sezieren Mikroskop bei geringer Vergrößerung, verwenden Sie feine Zange, um die Fische zu orientieren, so dass sie auf ihrer rechten Seite nach links legen. Bestätigen Sie, dass der zu fotografierende Fisch perfekt mit einem Auge direkt auf dem anderen Auge ausgerichtet ist. Wenn der Schwanz des Fisches gebogen ist, entfernen Sie den Schwanz, indem Sie ihn mit Kräftigen zangen, um ihn so zu entfernen, dass der Fisch flach liegt.Zoomen Sie auf eine hohe Vergrößerung und konzentrieren Sie sich auf die Leber, um sicherzustellen, dass die Kontur der Leber deutlich sichtbar ist. Drücken Sie die Schaltfläche Bild aufnehmen, um ein Bild zu fangen und die Datei zu speichern. Wiederholen Sie dies für alle Fische, um sicherzustellen, dass die Vergrößerung für jedes Bild gleich ist.Nehmen Sie ein Bild von einem Mikrometer mit der gleichen Vergrößerung. Um das Programm R zu verwenden, um alle Leberbilder zu blenden, um potenzielle Voreingenommenheit des Ermittlers zu vermeiden und wissenschaftliche Strenge zu fördern, benennen Sie Dateien nach dem Zufallsprinzip um und erstellen Sie eine Randomisierungsdatei, die eine Liste der ursprünglichen Dateinamen und der entsprechenden geblendeten Dateinamen enthält. Öffnen Sie randomisierte Dateien in der Reihenfolge, beginnend mit Datei eins.Wählen Sie das Freehand-Auswahl-Tool und skizzieren Sie jede Leber. Drücken Sie Control-M, um den Bereich jeder Leber zu messen. Für alle Lebern, die nicht genau gemessen werden können, weil sie Resthaut, Eigelb, a-fokussieren oder nicht intakt sind, fügen Sie eine Platzhaltermessung ein.Speichern Sie die Messungen in einer Textdatei. Um die Blindheit zu entblinden und zu analysieren, öffnen Sie die Messdatei und die Randomisierungsdatei in einem Tabellenkalkulationsprogramm. Fügen Sie eine neue Spalte in die Messdatei ein, und fügen Sie die ursprünglichen Dateinamen für die geblendeten Dateien mithilfe der Randomisierungsdatei hinzu.Speichern Sie diese Datei als Datei "Nicht blinde Messungen". Sortieren Sie die Daten nach dem ursprünglichen Dateinamen. Schließen Sie alle Lebermessungen aus, für die die Bilder nicht ausreichten.Konvertieren Sie bei Bedarf Messwerte in die gewünschte Skala in Quadratmillimetern. Öffnen Sie die Skalenleiste in der Bildverarbeitungssoftware. Verwenden Sie das Werkzeug Gerade Linie, um einen Millimeter auf der Maßstabsleiste zu messen.Die Bildverarbeitungssoftware misst dann in den gleichen Einheiten wie die Lebern, was einen Umrechnungsfaktor ergibt. Verwenden Sie den Konvertierungsfaktor, um Messungen in der Datei "Nicht blinde Messungen" zu konvertieren. Bestimmen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung und berechnen Sie P-Werte.Nach sechs Tagen nach der Befruchtung zeigten nicht-transgene Zebrafischlarven eine natürliche Position und Form der Leber, die über dem Darm lag. Transgene Zebrafische haben die Lebergröße im Vergleich zu ihren nicht-transgenen Geschwistern deutlich erhöht. Einige Beispiele für unzureichende Bilder und Mikrometer sind hier gezeigt.Larve mit Haut bedeckt die Leber, Larve mit Dotter verdunkelt die Leber, Larve mit Teilen der Leber abgeklemmt, und Larve mit Leber disloziert und fallen abfallen, Larve mit fehlender Leber, Larve mit Leberumriss, die schwer zu identifizieren ist, und Larve mit unsachgemäßer Positionierung. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, kleine und kontrollierte Bewegungen zu verwenden, um Schäden an der Leber zu verhindern. Neben der Hellfeldmikroskopie können wir auf diese Weise sezierte Larven auch für die konfokale Mikroskopie, zur Visualisierung fluoreszierender Reporterproteine oder immunfluoreszierender Färbungen und für die In-situ-Hybridisierung verwenden.Das Formaldehyd oder PFA ist reizend und vermutet krebserregend. Handschuhe sollten beim Umgang mit PFA getragen werden und konzentrierte Lösungen sollten in einer chemischen Rauchhaube behandelt werden.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Live-Imaging von angeborenen Immun und Präkanzeröse Zell-Interaktionen unter Verwendung eines induzierbaren Gal4 / UAS Expression System in Zebrafisch-Larven Haut

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Erfassen von Gewebereparatur in Zebrafisch-Larven mit Zeitrafferhellstereomikroskopie

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Hepatozyten-spezifische Ablation in Zebrafische, um Gallengetriebenen Leberregeneration Studieren

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse von Zebrabärbling Nierenentwicklung mit Zeitraffer-Imaging einem Binokular Mit Ausgerüstet für Optische Schnitte

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Mit Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie Bild Zebrabärbling Augenentwicklung

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Dissection von Larval Zebrabärbling Gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Histologische Analysen der akuten alkoholischen Leberverletzung in Zebrafisch

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Korrelative Höchstauflösung und Elektronenmikroskopie Protein Lokalisierung im Zebrafisch Netzhaut zu lösen

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Gründung der Larven Zebrafisch als Tier-Modell zu untersuchen Trypanosomen Trypanosoma Motilität In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...