Name: quantifying liver size in larval zebrafish using brightfield microscopy
Uploaded: 2020-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy at JoVE.com

היינו רוצים להכיר במרין הובס ועל משאבי בעלי החיים מרוכז של דג (הצאר) באוניברסיטת יוטה על מתן גידול בדגים, שטח מעבדה, וציוד לביצוע חלקים של מחקר זה. התרחבות הצאר נתמכת בחלקו על ידי NIH גרנט 1G20OD018369-01. אנחנו גם רוצים להודות רודני סטיוארט, קלואי לים, לאנס גרהאם, קודי ג'יימס, גארט nickum, ואת סרטן הצייד המכון (hci) דג זברה מתקן לטיפול דג זברה. אנחנו רוצים להודות לקנת קומפאס לקבלת עזרה בתכנות R. עבודה זו ממומנת בחלקו על ידי מענקים מן הקרן לסרטן הצייד (בשילוב עם גרנט P30 CA042014 הוענק מכון סרטן הצייד) (KJE) ו-NIH/NCI R01CA222570 (KJE).

מחקרים בעלי חיים מתבצעים בעקבות הליכים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת יוטה.
1. תיקון הזחלים
<ol><li>בשעה 3 – 7 ימים הפריה פוסט (dpf), להרוג הזחלים עם טריקיין מתיונין (0.03%) ולאסוף עד 15 הזחלים בצינור 2 מ"ל באמצעות פיפטה זכוכית משאבת פיפטה.</li>
	<li>שטוף ה?...

<ol>
	<li>Lin, D. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+Epigenomic+Heterogeneity+of+Hepatocellular+Carcinoma.">Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).</li><li>Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+hepatocellular+carcinoma:+Epidemiology,+etiology,+and+carcinogenesis.">Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis.</a> Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).</li><li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Chemical+Inhibitors+of+&#946;-Catenin-Driven+Liver+Tumorigenesis+in+Zebrafish.">Identification of Chemical Inhibitors of &#946;-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).</li><li>Kalasekar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+beta-catenin+activation+is+sufficient+to+cause+hepatocellular+carcinoma+in+zebrafish.">Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish.</a> Biology Open. 8 (10), (2019).</li><li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+level+of+liver-specific+expression+of+oncogenic+Kras(V12)+drives+robust+liver+tumorigenesis+in+transgenic+zebrafish.">A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).</li><li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+kras(V12)+transgenic+zebrafish+model+for+liver+tumorigenesis+and+chemical+drug+screening.">An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+liver+tumor+model+with+inducible+Myc+expression+reveals+conserved+Myc+signatures+with+mammalian+liver+tumors.">A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).</li><li>Cox, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yap+reprograms+glutamine+metabolism+to+increase+nucleotide+biosynthesis+and+enable+liver+growth.">Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth.</a> Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).</li><li>Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+the+mutants+vps18,+nf2+and+foie+gras+as+models+of+liver+disease.">A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease.</a> Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).</li><li>Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tumor+models+in+transgenic+zebrafish:+an+alternative+in+vivo+approach+to+study+hepatocarcinogenes.">Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes.</a> Future Oncology. 8 (1), 21-28 (2012).</li><li>Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-Associated+Neutrophils+and+Macrophages+Promote+Gender+Disparity+in+Hepatocellular+Carcinoma+in+Zebrafish.">Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish.</a> Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).</li><li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research.">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).</li><li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+plus+high+cholesterol+diet+lead+to+hepatic+steatosis+in+zebrafish+larvae:+a+novel+model+for+screening+anti-hepatic+steatosis+drugs.">High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs.</a> Nutrition &amp; Metabolism. 12, 42 (2015).</li><li>Kim, S. -. H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+of+tuberous+sclerosis+complex+reveals+cell-autonomous+and+non-cell-autonomous+functions+of+mutant+tuberin.">Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).</li><li>Delous, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9b+is+a+key+regulator+of+pancreaticobiliary+ductal+system+development.">Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development.</a> PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).</li><li>Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+hepatic+competence+by+Fgf+signaling.">Restriction of hepatic competence by Fgf signaling.</a> Development. 138 (7), 1339-1348 (2011).</li><li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+helix-loop-helix+transcription+factor,+heart+and+neural+crest+derivatives+expressed+transcript+2,+marks+hepatic+stellate+cells+in+zebrafish:+analysis+of+stellate+cell+entry+into+the+developing+liver.">The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).</li></ol>

הקוונפיקציה של גודל הכבד היא קריטית במחקרים שמטרתם הבנת התפתחות הכבד, התחדשות, ו אונגנזה. הפרוטוקול המתואר כאן הוא טכניקה מהירה יחסית, קלה וזולה לכמת את גודל הכבד בזחל צראדג. הפעלת זהירות מתאימה תוך ביצוע היבטים מסוימים של הפרוטוקול יכולה לסייע בדיוק מוגבר של תוצאות ולהקטין את התסכול.
<p ...

קרצינומה hepatocellular (HCC) הוא הגורם העיקרי הנפוץ ביותר של הכבד1 ואת הסיבה המובילה השלישית לתמותה הקשורות לסרטן2. כדי להבין טוב יותר מנגנונים של hepatocarcinogenesis ולזהות HCC therapeutics פוטנציאלי, אנחנו ואחרים פיתחנו בעלי החיים הטרנסגניים שבהם הביטוי הספציפי hepatציט של אונגנס כגון β-catenin3,4, קראס (רובוטית v12)5,6, myc7, או Yap18 מוביל HCC בבעלי חיים למבוגרים. ב זה zebrafish, הגדלת הכבד הוא ציין מוקדם ככל 6 ימים הפריה הפוסט (dpf), מתן פלטפורמת נתיישב לבדיקת ההשפעות של תרופות ושינויים גנטיים על הצמיחה אונגן מונחה הכבד. מדידה מדויקת ומדויקת של גודל בכבד זחל חיוני לקביעת ההשפעות של המניפולציות האלה.
גודל הכבד והצורה ניתן להעריך חצי-כימות הזחלים של דג זברה קבוע על ידי CY3-SA תיוג9 או ב חיים דג זברה הזחלים באמצעות hepatocyte-כתבים פלורסנט ספציפיים הניתוח מיקרוסקופ5,6. השיטה האחרונה היא מהירה יחסית, והיעדר דיוק שלה ניתן לטפל על ידי צילום ומדידת האזור של כל כבד באמצעות תוכנה עיבוד תמונה7,10. עם זאת, זה יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית מיקום אחיד כל הזחלים לחיות בניסוי כזה שאזור כבד דו מימדי הוא ייצוג מדויק של גודל הכבד. טכניקה דומה לכמת את גודל הכבד כוללת שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית אור לכמת את עוצמת הזחל הכבד8, אשר עשוי להיות מדויק יותר לזיהוי הבדלים בגודל כאשר הכבד מורחב לא אחיד בממדים שונים. מיון תא מופעל על-ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS) יכול לשמש כדי לספור את מספר החומרים המסומנים fluorescently וסוגים אחרים של תאי הכבד בזחל כבדים8,11. בשיטה זו, כבדי זחל הם במאגר והנתק, כך מידע על גודל הכבד בודדים וצורה הוא איבד. בשילוב עם שיטת קביעת גודל כבד אחרת, FACS מאפשר הבדלה בין מספר התאים המוגבר (היפרפלזיה) וגודל התא גדל (היפרפרס). כל השיטות הללו מעסיקים טכנולוגיה פלואורסצנטית יקרה (מיקרוסקופ או סדרן תאים) ו, למעט תיוג CY3-SA, דורשים תיוג של hepatocytes עם כתב פלורסנט.
כאן אנו מתארים בפרוטרוט שיטה לכמת את השטח של הזחל הכבד באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר ותוכנה עיבוד תמונה3,12,13,14. פרוטוקול זה מאפשר כימות מדויקות של אזור הכבדים הבודדים באתרו ללא שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. במהלך ניתוח גודל הכבד, אנו מעוורים את זהות התמונה כדי להפחית את הטיית החוקר ולשפר את הקשיחות המדעית15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Camera for dissecting microscope</td>
			<td>Leica, for example</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica, for example</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine (Dumont #5) forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Image J/FIJI</td>
			<td></td>
			<td>ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: <a href="https://imagej.net/Welcome" target="_blank">https://imagej.net/Welcome</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Various suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53502-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes</td>
			<td>USA Scientific Inc</td>
			<td>2906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 9-well round-bottom glass dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for blinding files</td>
			<td>R project</td>
			<td></td>
			<td>R can be downloaded for free: <a href="https://www.r-project.org/" target="_blank">https://www.r-project.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific graphing and statistics software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S)</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>200-226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Very fine (Dumont #55) forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying liver size in larval zebrafish using brightfield microscopy

בכמה מודלים הטרנסגניים של דגי hepatocellular (HCC), hepatomegaly ניתן לצפות במהלך שלבי הזחל המוקדמים. בדיקת גודל הזחל הכבד ב דג זברה מודלים HCC מספק אמצעים כדי להעריך במהירות את ההשפעות של תרופות ומניפולציות אחרות על פניטיפים הקשורים אונאוגן. כאן אנו מראים כיצד לתקן הזחלים דג זברה, לנתח את הרקמות סביב הכבד, צילום כבדים באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר, למדוד את אזור הכבד, ולנתח את התוצאות. פרוטוקול זה מאפשר כימות מהירה ומדויקת של גודל הכבד. כאשר שיטה זו כרוכה במדידת אזור הכבד, הוא עשוי להמעיט בערכם של עוצמת הכבד, ומתודולוגיות משלימות נדרשות כדי להבדיל בין שינויים בגודל התא ושינויים במספר התאים. טכניקת החיתוך המתוארת בזאת היא כלי מצוין להמחיש את הכבד, הבטן והלבלב בעמדותיהם הטבעיות לצורך מספר יישומים בזרם המים, כולל כתמים immunofluorescence והיברידיזציה באתרו. האסטרטגיה המתוארת עבור כימות הכבד הזחל היא ישימה היבטים רבים של התפתחות הכבד והתחדשות.

ביטוי מיוחד המופעל β-catenin (Tg (fabp10a: pt-β-cat) מופעל באמצעותשלושה אחים שאינם טרנסגניים הורדמים באזור 6 dpf ובכבד שימוש במיקרוסקופיה ברייטפילד ובתוכנת עיבוד תמונה. דג הטרנסגניים הגביר באופן משמעותי את גודל הכבד (0.0006 ס"מ2) לעומת האחים הלא-טרנסגניים שלהם (0.0004 ס"מ2, p...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy at JoVE.com

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

כאן אנו להפגין שיטה לכמת את גודל הכבד בזחל zebrafish, מתן דרך להעריך את ההשפעות של מניפולציות גנטיות ופרמקולוגית על גידול בכבד ופיתוח.

בדיקת גודל הכבד בזחל זברה באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

שיטה זו מספקת דרך לכמת את גודל הכבד בדג זברה זחל. זה גם מאפשר הערכה של ההשפעות של מניפולציה גנטית פרמקולוגית על צמיחת הכבד והתפתחות. טכניקה זו מספקת דרך מהירה ומדויקת לדמיין ולמדוד את הכבד, כמו גם את המעיים והלבלב.בנוסף לכימות גודל הכבד, שיטת ניתוח זו יכולה להיות מועילה להכנת הכבד, המעיים והלבלב להכלאה במקום או הדמיה קונפוקל. לפני שתנסה להתאמן על זחלים ניסיוניים, ודא שהשקעת זמן רב בתרגול על דגימות שאינן ניסיוניות ויש לך שיעור הצלחה משמעותי. זה קריטי כדי לדמיין אוריינטציה נכונה ותנועה של זחלים דגי זברה ומדפים על מנת להסיר את העור מבלי להפריע לאיברים שמסביב.בשלושה עד שבעה ימים לאחר ההפריה, לאחר המתת זחלים, השתמשו בפיגט זכוכית ומשאבת פיפטה כדי לאסוף עד 15 זחלים בצינור של שני מיליליטר. לשטוף זחלים פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS 1X קר על קרח. הסר PBS רבים ככל האפשר באמצעות פיפטה זכוכית משאבת פיפטה ולהוסיף מיליליטר אחד של קר ארבעה אחוז PFA ב PBS.דגירה בארבע מעלות צלזיוס לפחות לילה עם נדנדה עדינה. באמצעות פיפטה זכוכית ומשאבת פיפטה, להסיר את PFA מהצינור ולשטוף שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS קר. רוק במשך חמש דקות בין שטיפות.פיפטה כמה זחלים ב- PBS לתוך באר אחת של צלחת זכוכית עגולה תחתונה תשעה היטב. תחת מיקרוסקופ, להסיר את העור המקיף את הכבד באמצעות מלכודות בסדר להחזיק זחל אחד על גבו, אוחז משני צדי הראש בעדינות רבה ככל האפשר. ואז להשתמש מדפים עדין מאוד ביד השנייה כדי לתפוס את העור רק overlying את הלב.משוך את העור כלפי מטה באלכסון לכיוון הזנב של הדג בתחתית המנה בצד שמאל או ימין של הדג. חזור על הפעולה עבור הצד השני. המשך לתפוס מדפים של העור מושך למטה עד כל העור מלנופורים overlying או ליד הכבד הוסרו.אם חלמון קיים במשך חמישה עד שישה ימים לאחר ההפריה זחלים, להרים את החלמון בחתיכה אחת על ידי החזקת הדג עם מלקעות בסדר על גבו באמצעות מלקעות בסדר מאוד לדרבן בעדינות את החלמון. עבור שלושה עד ארבעה זחלי DPF, להחזיק את הדג עם מלקחי עדין על גבו ולהשתמש מלקחי עדין מאוד ללטף את החלמון החל מהצד הגחוני. מגרדים את החלמון בחתיכות.מניחים את הזחלים המנותלים לתוך PBS טרי וקר בצינור שני מיליליטר באמצעות פיפטה זכוכית ומשאבת פיפטה. כדי לעלות על הזחלים, יוצקים כמה מיליליטר של שלושה אחוזים מתילקלוז על המכסה של צלחת פטרי נקייה מפלסטיק. השתמש פיפטה זכוכית משאבת פיפטה כדי להוסיף זחלים methylcellulose, הוספת PBS קטן עם הזחלים ככל האפשר.תחת מיקרוסקופ מנותח בהגדלה נמוכה, השתמש במטסים עדין כדי לכוון את הדגים כך שהם שוכבים בצד ימין שלהם פונה שמאלה. אשר כי הדג להצטלם מיושר בצורה מושלמת עם עין אחת ישירות על גבי העין השנייה. אם זנב הדג מכופף, הסר את הזנב על ידי צביטתו בכוח במדפים כדי להסיר אותו כך שהדגים ישכבו שטוחים.התקרבו להגדלה גבוהה והתמקדו בכבד, ודאו שמתווה הכבד נראה בבירור. לחץ על לחצן לכידת תמונה כדי להצמיד תמונה ולשמור את הקובץ. חזור על הפעולה עבור כל הדגים, ודא שההגדלה זהה עבור כל תמונה.צלם תמונה של מיקרומטר באמצעות אותה הגדלה. כדי להשתמש בתוכנית R כדי לעוור את כל תמונות הכבד כדי למנוע הטיית חוקר פוטנציאלי ולקדם הקפדה מדעית, לשנות את שמות הקבצים באופן אקראי וליצור קובץ אקראי המכיל רשימה של שמות הקבצים המקוריים ושמות קבצים עיוורים תואמים. פתח קבצים אקראיים לפי הסדר, החל מקובץ אחד.בחרו בכלי בחירות ביד חופשית והתוו כל כבד. לחץ Control-M כדי למדוד את האזור של כל כבד. עבור כל הכבדים שלא ניתן למדוד במדויק כי יש להם עור שיורית, חלמון, הם מחוץ לפוקוס, או לא שלמים, להכניס מדידת מציין מיקום.שמור את המידות בקובץ טקסט. כדי לבטל את ההקצנה ולנתח נתונים, פתח את קובץ המדידות ואת קובץ האקראיזציה בתוכנית גיליון אלקטרוני. הוסיפו עמודה חדשה לקובץ המידות והוסיפו את שמות הקבצים המקוריים לקבצים המסונוורים באמצעות קובץ האקראיזציה.שמור קובץ זה כקובץ המדידות הלא מרוסנות. מיין את הנתונים לפי שם הקובץ המקורי. אל תכלול מדידות כבד שעבורן תמונות לא היו מספיקות.במידת הצורך, המירו ערכי מדידה לקנה המידה הרצוי במילימטרים רבועים. פתח את סרגל קנה המידה בתוכנת עיבוד התמונה. השתמש בכלי קו ישר כדי למדוד מילימטר אחד בסולם ההיקף.תוכנת עיבוד התמונה לאחר מכן מודד באותן יחידות כמו הכבדים, נותן גורם המרה. השתמשו במקדם ההמרה להמרת מידות בקובץ 'מדידות לא מקובות'. קבע את הממוצע וסטיית התקן וחשב ערכי P.בשישה ימים לאחר ההפריה, זחלי זברה לא מהוונגיים הראו מיקום טבעי וצורה של כבד מעל המעיים. דגי זברה מהו מהודרים הגדילו באופן משמעותי את גודל הכבד בהשוואה לאחים הלא מהו מהוונגיים שלהם. כמה דוגמאות של תמונות לא מספקות מיקרומטר מוצגים כאן.זחל עם עור המכסה את הכבד, זחל עם חלמון מטשטש את הכבד, זחל עם חלקים של הכבד צבט, וזחל עם הכבד נקע ונופל, זחל עם כבד חסר, זחל עם קווי מתאר הכבד שקשה לזהות, וזחל עם מיקום לא תקין. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להשתמש בתנועות קטנות ומבוקרות כדי למנוע נזק לכבד. בנוסף למיקרוסקופיה של שדה בהיר, אנו יכולים גם להשתמש בזחלים שנותרו בדרך זו, למיקרוסקופיה קונפוקאלית, כדי לדמיין חלבוני כתב פלואורסצנטיים או כתמים אימונו-פלואורסצנטיים, ולהכלאה באתרו.הפורלדהיד או PFA הוא מסרטן מרגיז וחשוד. כפפות צריך להיות משוחק בעת טיפול PFA ופתרונות מרוכזים צריך להיות מטופלים ברדס אדים כימיים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

הדמיה חיה של אינטראקציות תא של מערכת חיסון המולדת וPreneoplastic שימוש מערכת ביטוי / כטב&quot;מ העין מתנהלת Gal4 בעור הזחל דג הזברה

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

אבלציה Hepatocyte הספציפי בדג הזברה לחקר התחדשות כבד מונע מרה

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור פיתוח תמונה דג הזברה העין

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

דיסקציה של רקמות הזחל דג הזברה האשכים

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

ניתוח היסטולוגית של פגיעה חריפה בכבד אלכוהול דג הזברה

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

רזולוציה סופר correlative ואלקטרון לפתרון חלבון לוקליזציה ברשתית דג זברה

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

הקמתה של הזחל דג זברה כמודל חיה כדי Investigate Trypanosoma cruzi תנועתיות Vivo ב

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...