Name: quantifying liver size in larval zebrafish using brightfield microscopy
Uploaded: 2020-02-02T13:00:00
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ユタ大学のマリン・ホッブスと中央集権ゼブラフィッシュ動物資源(CZAR)が、この研究の一部を行うためのゼブラフィッシュの畜産、実験室スペース、および機器を提供することを認めたい。CZARの拡張は、NIH助成金#1G20OD018369-01によって部分的にサポートされています。また、ロドニー・スチュワート、クロエ・リム、ランス・グラハム、コーディ・ジェームズ、ギャレット・ニックム、ハンツマンがん研究所(HCI)ゼブラフィッシュ・ファシリティに感謝したいと思います。R プログラミングの支援を受けてくださったケネス・コンパスに感謝します。この研究は、ハンツマンがん財団(ハンツマンがん研究所に授与された助成金P30 CA042014)(KJE)とNIH / NCI R01CA222570(KJE)からの助成金の一部によって資金提供されました。

動物研究は、ユタ大学の動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認された以下の手順を実施しています。
1. 幼虫の固定
<ol><li>受精後3~7日(dpf)で、幼虫をトリカインメタンスルホン酸で安楽死させる(0.03%)ガラスピペットとピペットポンプを使用して2 mLチューブに最大15個の幼虫を集めなさい。</li>
	<li>幼虫を1mLの冷たい(4 °C)1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を氷上で2回洗浄...

<ol>
	<li>Lin, D. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+Epigenomic+Heterogeneity+of+Hepatocellular+Carcinoma.">Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).</li><li>Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+hepatocellular+carcinoma:+Epidemiology,+etiology,+and+carcinogenesis.">Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis.</a> Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).</li><li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Chemical+Inhibitors+of+&#946;-Catenin-Driven+Liver+Tumorigenesis+in+Zebrafish.">Identification of Chemical Inhibitors of &#946;-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).</li><li>Kalasekar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+beta-catenin+activation+is+sufficient+to+cause+hepatocellular+carcinoma+in+zebrafish.">Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish.</a> Biology Open. 8 (10), (2019).</li><li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+level+of+liver-specific+expression+of+oncogenic+Kras(V12)+drives+robust+liver+tumorigenesis+in+transgenic+zebrafish.">A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).</li><li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+kras(V12)+transgenic+zebrafish+model+for+liver+tumorigenesis+and+chemical+drug+screening.">An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+liver+tumor+model+with+inducible+Myc+expression+reveals+conserved+Myc+signatures+with+mammalian+liver+tumors.">A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).</li><li>Cox, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yap+reprograms+glutamine+metabolism+to+increase+nucleotide+biosynthesis+and+enable+liver+growth.">Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth.</a> Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).</li><li>Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+the+mutants+vps18,+nf2+and+foie+gras+as+models+of+liver+disease.">A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease.</a> Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).</li><li>Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tumor+models+in+transgenic+zebrafish:+an+alternative+in+vivo+approach+to+study+hepatocarcinogenes.">Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes.</a> Future Oncology. 8 (1), 21-28 (2012).</li><li>Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-Associated+Neutrophils+and+Macrophages+Promote+Gender+Disparity+in+Hepatocellular+Carcinoma+in+Zebrafish.">Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish.</a> Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).</li><li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research.">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).</li><li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+plus+high+cholesterol+diet+lead+to+hepatic+steatosis+in+zebrafish+larvae:+a+novel+model+for+screening+anti-hepatic+steatosis+drugs.">High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs.</a> Nutrition &amp; Metabolism. 12, 42 (2015).</li><li>Kim, S. -. H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+of+tuberous+sclerosis+complex+reveals+cell-autonomous+and+non-cell-autonomous+functions+of+mutant+tuberin.">Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).</li><li>Delous, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9b+is+a+key+regulator+of+pancreaticobiliary+ductal+system+development.">Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development.</a> PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).</li><li>Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+hepatic+competence+by+Fgf+signaling.">Restriction of hepatic competence by Fgf signaling.</a> Development. 138 (7), 1339-1348 (2011).</li><li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+helix-loop-helix+transcription+factor,+heart+and+neural+crest+derivatives+expressed+transcript+2,+marks+hepatic+stellate+cells+in+zebrafish:+analysis+of+stellate+cell+entry+into+the+developing+liver.">The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).</li></ol>

肝臓の発達、再生、および腫瘍形成を理解することを目的とした研究では、肝臓のサイズの定量化は重要です。ここで説明するプロトコルは、幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズ定量のための比較的迅速かつ簡単で安価な技術です。プロトコルの特定の側面を実行しながら適切な注意を払うことは、結果の精度を高め、フラストレーションを減らすことに役立ちます。
?...

肝細胞癌(HCC)は、肝臓1の最も一般的な原発性悪性腫瘍であり、癌関連死亡率2の第3の主要な原因である。肝癌のメカニズムを理解し、潜在的なHCC治療薬を同定するために、我々および他の人々は、β-カテニン3、4、Kras(V12)5、6、Myc7、またはYap18のような腫瘍遺伝子の肝細胞特異的発現が成人動物のHCCにつながるトランスジェニックゼブラフィッシュを開発しました。これらのゼブラフィッシュでは、肝臓の拡大は受精後6日(dpf)に早くも注目され、腫瘍遺伝子駆動の肝臓過剰増殖に対する薬物および遺伝的変化の効果をテストするためのファシリティプラットフォームを提供する。幼虫の肝臓のサイズの正確かつ正確な測定は、これらの操作の効果を決定するために不可欠です。
肝臓の大きさと形状は、CY3-SA標識9または肝細胞特異的蛍光レポーターおよび蛍光分光顕微鏡顕微鏡法を用いた生きたゼブラフィッシュ幼虫で固定ゼブラフィッシュ幼虫で半定量的に評価することができる5,6。後者の方法は比較的速く、その精度の欠如は、画像処理ソフトウェア7、10を使用して各肝臓の面積を撮影して測定することによって対処することができる。しかし、2次元の肝臓領域が肝臓の大きさを正確に表すような実験で、すべての生きた幼虫を均一に配置することは技術的に困難である可能性があります。肝臓のサイズを定量する同様の技術は、幼虫肝容積8を定量するために光シート蛍光顕微鏡を使用することを含むが、これは肝臓が異なる次元で不均一に拡大された場合のサイズの違いを検出するためのより正確であるかもしれない。蛍光活性化細胞選別(FACS)は、幼虫肝臓における蛍光標識肝細胞および他の肝細胞タイプの数を数えるために使用することができる8、11。この方法では、幼虫の肝臓がプールされ、解き分け、個々の肝臓のサイズと形状に関する情報が失われます。他の肝サイズ決定方法と組み合わせて、FACSは増加した細胞数(過形成)と増加した細胞サイズ(肥大)との間の分化を可能にする。これらの方法はすべて高価な蛍光技術(顕微鏡または細胞選別器)を採用し、CY3-SA標識を除いて、蛍光レポーターによる肝細胞の標識を必要とする。
ここでは、明視野顕微鏡および画像処理ソフトウェア3、12、13、14を用いてゼブラフィッシュ幼虫の肝臓領域を定量する方法について詳細に説明する。このプロトコルは、蛍光顕微鏡を使用せずに、その場で個々の肝臓の面積を正確に定量化することができます。肝臓のサイズを分析しながら、我々は、研究者の偏見を低減し、科学的な厳しさを向上させるために画像のアイデンティティを盲目に15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Camera for dissecting microscope</td>
			<td>Leica, for example</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica, for example</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine (Dumont #5) forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Image J/FIJI</td>
			<td></td>
			<td>ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: <a href="https://imagej.net/Welcome" target="_blank">https://imagej.net/Welcome</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Various suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53502-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes</td>
			<td>USA Scientific Inc</td>
			<td>2906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 9-well round-bottom glass dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for blinding files</td>
			<td>R project</td>
			<td></td>
			<td>R can be downloaded for free: <a href="https://www.r-project.org/" target="_blank">https://www.r-project.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific graphing and statistics software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S)</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>200-226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Very fine (Dumont #55) forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying liver size in larval zebrafish using brightfield microscopy

肝細胞癌(HCC)のいくつかのトランスジェニックゼブラフィッシュモデルでは、肝腫は幼虫初期段階で観察することができる。ゼブラフィッシュHCCモデルにおける幼虫の肝臓のサイズを定量化することは、腫瘍遺伝子関連の表現型に対する薬物および他の操作の影響を迅速に評価する手段を提供する。ここでは、ゼブラフィッシュの幼虫を固定し、肝臓を取り巻く組織を解剖し、明視野顕微鏡を用いて肝臓を撮影し、肝臓面積を測定し、結果を分析する方法を示します。このプロトコルは、肝臓のサイズの迅速かつ正確な定量化を可能にします。この方法は、肝領域を測定することを含む, それは肝臓の体積の違いを過小評価可能性があります, そして、補完的な方法論は、細胞のサイズの変化と細胞数の変化を区別するために必要とされます.本明細書に記載される解剖技術は、免疫蛍光染色およびin situハイブリダイゼーションを含む無数の下流アプリケーションのための自然な位置で肝臓、腸、膵臓を視覚化するための優れたツールです。幼虫の肝臓のサイズを定量化するための説明された戦略は、肝臓の発達と再生の多くの側面に適用可能です。

肝細胞特異的活性化βカテニン(Tg(fabp10a:pt-β-cat)ゼブラフィッシュ)3および非トランスジェニック対照兄弟を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュを6dpfで安楽死させ、肝臓領域を明熱域で明熱分析し、明視野顕微鏡および画像処理ソフトウェアを用いて肝臓領域を定量した。トランスジェニックゼブラフィッシュは、非トランスジェニック兄弟(0.0004 cm<su...

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Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

ここでは、幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズを定量化する方法を実証し、肝臓の成長と発達に対する遺伝的および薬理学的操作の効果を評価する方法を提供する。

ブライトフィールド顕微鏡を用いた幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズの定量化

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

この方法は、幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズを定量化する方法を提供する。また、肝臓の成長と開発に対する遺伝的および薬理学的操作の影響の評価を可能にします。この技術は、肝臓だけでなく、腸や膵臓を視覚化し、測定するための迅速かつ正確な方法を提供します。肝臓のサイズを定量化することに加えて、この解剖法は、その場でのハイブリダイゼーションまたは共焦点イメージングのために肝臓、腸、膵臓を調製するのに役立ちます。実験用幼虫のデスクラッキングを試みる前に、実験以外のサンプルの練習に十分な時間を費やし、有意な成功率を持っていることを確認してください。周囲の器官を乱さずに皮膚を除去するためには、ゼブラフィッシュの幼虫や鉗子の適切な向きと動きを視覚化することが重要です。受精後3~7日で、幼虫を安楽死させた後、ガラスピペットとピペットポンプを使用して、2ミリリットルチューブに最大15匹の幼虫を採取します。幼虫を氷の上で冷たい1X PBSの1ミリリットルで2回洗います。ガラスピペットとピペットポンプを使用してできるだけ多くのPBSを取り出し、PBSに冷たい4%PFAの1ミリリットルを加えます。少なくとも一晩は穏やかな揺れで摂氏4度でインキュベートします。ガラスピペットとピペットポンプを使用して、チューブからPFAを取り出し、冷たいPBSの1ミリリットルで3回リンスします。すすいの間に5分間ロックします。9ウェルラウンドボトムガラス皿の1つの井戸にPBSでいくつかの幼虫をピペット。顕微鏡下で、細かい鉗子を使って肝臓を取り巻く皮膚を取り除き、片方の幼虫を背中に保持し、頭の両側をできるだけ穏やかにつかみます。その後、ちょうど心臓の上に皮膚をつかむために、他の手で非常に細かい鉗子を使用しています。魚の左右の皿の底にある魚の尾に向かって斜めに皮膚を引き下げます。反対側についても繰り返します。皮膚のフラップをつかみ続け、肝臓の上または近くにあるすべての皮膚とメラノフォアが取り除かれるまで引き下げます。黄身が受精後5〜6日間存在する場合は、魚を背中に細かい鉗子で保持し、非常に細かい鉗子を使って黄身を穏やかに突き出して、黄身を1枚で持ち上げます。3〜4匹のDPF幼虫の場合は、魚を背中に細かい鉗子で保持し、非常に細かい鉗子を使用して腹側から始まる黄身をなでます。黄身を粉々に削り取ります。ガラスピペットとピペットポンプを使用して、解剖した幼虫を2ミリリットルチューブに新鮮で冷たいPBSに入れます。幼虫を取り付けるには、清潔でプラスチック製のペトリ皿の蓋に3%のメチルセルロースを数ミリリットル注ぎます。ガラスピペットとピペットポンプを使用してメチルセルロースに幼虫を加え、幼虫と共にPBSをできるだけ少なくします。低倍率で解剖顕微鏡の下で、彼らは左に向かって彼らの右側に横たわっているように、魚の向きを微調整するために細かい鉗子を使用しています。撮影する魚がもう一方の目の上に直接片方の目と完全に整列していることを確認します。魚の尻尾が曲がっている場合は、魚が平らに横たわるように、鉗子で強引につまんで尾を取り除きます。高倍率にズームインし、肝臓に焦点を当てます, 肝臓の輪郭がはっきりと見えるように.[イメージのキャプチャ]ボタンを押して、画像をスナップしてファイルを保存します。すべての魚に対して繰り返し、各画像の倍率が同じであることを確認します。同じ倍率を使用してマイクロメーターの写真を撮ります。潜在的な調査者の偏見を避け、科学的な厳しさを促進するために、すべての肝臓の写真を盲目にするためにプログラムRを使用するには、ランダムにファイルの名前を変更し、元のファイル名と対応するブラインドファイル名のリストを含むランダム化ファイルを作成します。ランダム化されたファイルを順に開きます(ファイル 1 から始まります)。フリーハンド選択ツールを選択し、各肝臓の概要.各肝臓の領域を測定するためにコントロールMを押します。皮膚が残っているために正確に測定できない肝臓については、黄身が焦点を合わせていないか、または無傷でない場合は、プレースホルダー測定を挿入します。テキスト ファイルに測定値を保存します。ブラインドを解除してデータを分析するには、測定ファイルとランダム化ファイルをスプレッドシートプログラムで開きます。測定ファイルに新しい列を挿入し、ランダム化ファイルを使用して、ブラインドファイルの元のファイル名を追加します。このファイルをブラインドなし測定ファイルとして保存します。データを元のファイル名で並べ替えます。写真が十分ではなかった肝臓の測定値を除外します。必要に応じて、計測値を必要なスケール(平方ミリメートル)に変換します。画像処理ソフトウェアでスケール バーを開きます。[直線] ツールを使用して、スケール バーの 1 ミリメートルを計測します。画像処理ソフトウェアは、肝臓と同じ単位で測定し、変換因子を与えます。ブラインドなし測定ファイルの測定値を変換するには、変換係数を使用します。平均と標準偏差を決定し、P値を計算します。受精後6日間で、非トランスジェニックゼブラフィッシュの幼虫は、腸の上に生来の位置と肝臓の形を示した。トランスジェニックゼブラフィッシュは、彼らの非トランスジェニック兄弟と比較して大幅に肝臓のサイズを増加しています。.不十分な画像とマイクロメータの例を以下に示します。肝臓を覆う皮膚を持つ幼虫、肝臓を覆い隠す幼虫、肝臓の一部がつままれた幼虫、肝臓が脱臼して落ちる幼虫、肝臓が欠けている幼虫、識別が困難な肝臓の輪郭を持つ幼虫、不適切な位置付けの幼虫。この手順を試みる場合, 肝臓への損傷を防ぐために小さく、制御された動きを使用することが重要です..また、明視野顕微鏡に加えて、この方法で解剖した幼虫を共焦点顕微鏡、蛍光レポータータンパク質や免疫蛍光染色の可視化、および現場でのハイブリダイゼーションにも使用できます。ホルムアルデヒドまたはPFAは、刺激性および発がん性物質の疑いがある。手袋はPFAを扱うときに着用する必要があり、濃縮された溶液は化学発煙フードで扱われるべきです。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

幼虫ゼブラフィッシュスキンにおける誘導GAL4 / UASの発現系を用いて自然免疫と前癌細胞の相互作用のライブイメージング

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

タイムラプス明実体顕微鏡でゼブラフィッシュ幼虫における組織修復をキャプチャ

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

胆道主導の肝臓の再生を研究するためにゼブラフィッシュにおける肝細胞特異的アブレーション

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

解剖顕微鏡を使用したタイムラプスイメージングとゼブラフィッシュ腎臓の開発の分析は、光学切片のための装備します

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

イメージゼブラフィッシュアイ開発にライトシート蛍光顕微鏡を用いて、

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

幼生ゼブラフィッシュ性腺組織の解剖

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

ゼブラフィッシュにおける急性アルコール性肝障害の組織学的解析

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

ゼブラフィッシュの網膜におけるタンパク質局在を解決する相関超解像および電子顕微鏡観察

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

調査cruzi トリパノソーマの原因運動In Vivo動物モデルとしてのゼブラフィッシュ稚魚の確立

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...